חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר ננו-חיישנים לנתרן עבור יישומים in vitro ו-in vivo. הדבר מושג על ידי הכנת תערובת opto המכילה את רכיבי החיישן עבור הננו-חיישנים. כשלב שני, חומר פעילי שטח עובר סוניקציה בתמיסה מימית כדי להתפזר באופן שווה, מה שיאפשר את היווצרות הננו-חיישנים בעת הוספת ה-opto.

בשלב הבא, מוסיפים את תערובת ה-opto לתערובת החומר הפעיל שטחית המימית תחת סוניקציה כדי ליצור את הננו-חיישנים בתמיסה. סרטון זה מדגים כי התגובה של החיישן ניתנת לכיוונון. ניתן להחדיר את החיישנים בהזרקה מיקרוסקופית לתאי שריר לב (cardiac myocytes), וכן ניתן להזריק את החיישנים תת-עורית לעכברים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים, הוא היכולת לכוונן את החיישנים לטווח דינמי התואם את הסביבה הפיזיולוגית, למדוד מגוון רחב יותר של אנליטים ולבצע מדידות רציומטריות לצורך ניתוח כמותי. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות, שכן לאחר ייצור החיישנים, הכנסתם לסביבה ביולוגית עשויה להיראות כמשימה מרתיעה. יש להכין מראש תמיסות מרוכזות של sodium ion four x dry sodium TFPB ו-chromo four three לפני הכנת ה-opto, בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

בתוך מנדף, ערבבו את כל החומרים בתוך מבחנה מזכוכית בנפח 1.5 milliliter. בעזרת פקק הברגה מצופה טפלון, ערבבו את המבחנה בעזרת וורטקס בעדינות עד להמסה מלאה של ה-PVC. התמיסה צריכה להיראות אדומה.

התחילו בהכנת הננו-חיישנים על ידי הוספת 100 µL של 10 mg/mL של PEG lipid לתוך מבחנה מזכוכית של 4 גרם. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של התמיסה המימית הרצויה, כגון HEPES בריכוז 10 mM.

הנח קצה סוניקציה לעומק של 7 mm בתוך הבקבוק באמצעות ג'ק מעבדתי והפעל הספק סוניקציה נמוך למשך 30 שניות. בתוך מבחנה של 0.6 ml, ערבב 50 µl של חומר ה-opto ו-50 µl של di chloro methane באמצעות פיפטה כדי להבטיח ערבוב אחיד. לאחר מכן, התחל סוניקציה למשך שלוש דקות.

עם תחילת הסוניקציה, הוסיפו 100 µL של תערובת ה-opto על ידי טבילת קצה הפ pipette ושחרור הנפח המלא בהזרקה מהירה ואחידה אחת. התמיס יהפוך לכחול אם ה-pH יעלה מעל שבע, ואם אין נתרן שיסיר את שאריות ה-THF וה-di chloro methane מהתמיס. העבירו את קצה הסוניקטור לעומק של 2 mm.

במהלך שלוש הדקות הנותרות, התמיסה תהפוך לעכורה. עם סיום הסוניקציה (Sonication), שאבו את תמיסת הננו-חיישן (Nanosensor) לתוך מזרק של 5 ml. חברו מסנן והעבירו את תמיסת הננו-חיישן לבקבוק זכוכית עם פקק הברגה.

התחילו בהכנת 10 תמיסות עם ריכוז נתרן העולה בהדרגה, שביסודן ניתן למדוד את הרגישות של הננו-חיישן. ערבבו תמיסות מנתרן מהמלאי בריכוז אפס מולרי ובריכוז מולרי אחד בתוך מבחנות קוניות של 50 milliliters. כעת, בלוחית 96 בארות עם תחתית אופטית, הוסיפו 100 microliters מכל ריכוז נתרן לשלוש בארות בעמודה.

לאחר מכן, הוסף 100 µL של ננו-חיישנים שהוכנו טריים לכל באער, העמס את הפלטה לתוך פלואורימטר של מיקרופלטה והזן את אורכי הגל של העירור, הפליטה והחסימה (cutoff) האידיאליים עבור הכרומופור שבשימוש. בחירת אורכי הגל למדידה תלויה ביישום. אורכי גל אלו מאפשרים מדידות של דינמיקה תוך-תאית מהירה או הפחתת רעשים.

כדי לקבל את ערכי האלפא, חלקו את יחס העצימות ב-570 ננומטר בעצימות ב-670 ננומטר או ב-680 ננומטר. שרטטו את ערכי האלפא מול הלוגריתם של ריכוז הנתרן, כאשר הלוגריתם של ריכוז נתרן אפס מוגדר כמינוס אחת.

כעת התאימו עקומה סיגמואידית לתגובה, ומתוך העקומה חשבו את ריכוז הנתרן שבו ערך ה-alpha הוא 0.5. נתון זה מייצג את ריכוז הנתרן שבו החיישן מגיב באופן אופטימלי. באמצעות מידע זה, התאימו את היחס בין sodium iono four x sodium TFPB לבין chromo iono four three ב-opto כדי ליצור ננו-חיישנים בעלי ריכוז נתרן אופטימלי.

לדוגמה, עקומות תגובה של חמישה סטים שונים של ננו-חיישנים המייצגים פורמולציות אופטיות שונות, הנבדלות רק בכמות הנתרן של ארבעה 10. לצורך דימות תוך-תאי, החליפו את מצע התרבית במצע שקוף כגון תמיסת Tyro והעבירו את התאים לתא דימות. כעת, מלאו במרובה פנימה פיפטת זכוכית שנמשכה בתמיסת ננו-חיישנים שהוכנה ב-5 mg/mL גלוקוז במים.

לאחר מכן, חברו את הפ pipette למיקרו-מניפולטור וחברו אותו למערכת הזרקה מבוקרת לחץ. הורידו את ה-pipette אל מעל התא ועד לציטופלזמה. לעיתים יש צורך להקיש על מחזיק המניפולטור כדי לנקב את הממברנה.

הזריק מספר מאות picoliters של תמיסת ננו-חיישן ושלוף במהירות את הפ pipette. הרדם עכבר CD1 nude באמצעות isof fluorine באמצעות תא הרדמה. לאחר ההרדמה, מקם את העכבר בתוך תא דימות שעבר חיטוי.

בשלב הבא, מלאו מזרק אינסולין סטרילי במידה 31 ב-10 µL של ננו-חיישנים בעלי ה-KD המתאים ב-10 mM PBS. ודאו שכל בועות האוויר הוסרו באמצעות פינצטה. אחזו בקיפול קטן של העור לאורך גבו של העכבר באתר ההזרקה הרצוי תוך כדי תפיסת העור.

החדירו את המזרק לעור כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה והמחט מקבילה לעור. כעת, משכו את בוכנת המזרק לאחור כדי לוודא שהמחט אינה מוחדרת לכלי דם. כדי למזער את הלחץ האחורי, הניעו בעדינות את המחט ימינה ושמאלה כדי ליצור כיס בתוך העור.

לאחר מכן, הזרקו את החיישנים והוציאו בעדינות את המזרק. הפילו לחץ עדין על אתר ההזרקה ונגבו כל תמיסה שייתכן שדלפה ממנו. בדרך כלל, מבצעים שש הזרקות במרווחים שווים לאורך הגב.

במידה ומבצעים את הפעולה על עכברים שונים, יש להחליף את המחט כדי למזער את התפשטות המחלה וזיהומים צולבים. לאחר ההזרקות, רכשו תמונות בשדה בהיר (brightfield) ותמונות פלואורסצנטיות באמצעות סטים של פילטרים התואמים באופן הדוק את ספקטרום העירור והפליטה של הננו-חיישנים. פעולה זו מפחיתה גם את האוטופלואורסצנציה של העור.

מיוציטים לבביים אלו של רכים נתרבתו על זכוכית כיסוי והוזרקו בהם ננו-חיישנים של נתרן. תמונה פלואורסצנטית זו צולמה באורך גל עירור של 639 ננומטר. זוהי תמונת שדה בהיר (brightfield) של אותם תאים, וזוהי תמונת מיזוג של השתיים.

מופיע מיקבוב מסוים של חיישנים, אך לתאים יש מורפולוגיה תקינה. החיישנים התפזרו ברחבי הציטוזול ולא נצפתה הצטברות גרעינית. חפיפה זו של תמונה בשדה בהיר ותמונה פלואורסצנטית מראה תשעה הזרקות תת-עוריות שונות של ננו-חיישני נתרן למרחב התת-עורי של עכבר nude.

בפעם אחת, ניתן לייצר ננו-חיישנים של Masten בתוך דקות אם התהליך מבוצע כראוי, וניתן ליישמם בכל מחקר למדידת תדفق אנליט הפיך בזמן אמת. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להטעין ננו-חיישנים לחלל התוך-תאי או התת-עורי לצורך מדידות כמותיות בסביבה ביולוגית.