זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל
July 4th, 2011
שיטה לפיתוח תרבות מצעים תא עם היכולת לשנות את הטופוגרפיה במהלך התרבות מתואר. השיטה עושה שימוש חומרים חכמים המכונה זיכרון פולימרים צורה יש את היכולת לשנן צורה קבועה. תפיסה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של חומרים ויישומים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית תאים במצע עם טופוגרפיה המשתנה עם הזמן. זה מושג על ידי תכנות פולימר זיכרון צורה לצורה קבועה שניתן לזכור. פולימר זיכרון הצורה מתוכנת לאחר מכן לצורה זמנית שעליה מצופים תאים מאוחר יותר.
השלב האחרון של ההליך הוא להפעיל את פולימר זיכרון הצורה לחזור לצורתו הקבועה על ידי העלאת הטמפרטורה, בסופו של דבר ניתן להשיג תוצאות המראות שינוי בהתנהגות התא באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היי, שמי פט מאת'ר. אני פרופסור להנדסה ביו-רפואית וכימית ומנהל המכון לביו-חומרים בסירקיוז כאן באוניברסיטת סירקיוז.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מכשירים מסחריים או מותאמים אישית למתיחת תאים הוא שבמערכת פולימרית אחת, אנו מסוגלים ליישם מגוון רחב של זנים מורכבים על תאים. שמי ג'יי הנדרסון. אני עוזר פרופסור להנדסה ביו-רפואית וכימית וחבר במכון הביו-חומרים של סירקיוז.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה, כגון כיצד תאים מגיבים לשינויים דינמיים בסביבתם הפיזית. שמי קווין דייוויס ואני דוקטורנט באוניברסיטת סירקיוז במחלקה להנדסה ביו-רפואית והנדסה כימית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביולוגיה מכנית דו-ממדית, היא יכולה לשמש גם למערכות אחרות כגון פיגומים משני צורה תלת מימדיים להנדסת רקמות.
לפני תחילת הליך זה, הכינו תא ריפוי מותאם אישית באמצעות מגלשת זכוכית, מרווח טפלון בעובי מילימטר אחד וצלחת אלומיניום. אבטח את החדר באמצעות קליפסים קלסר קטנים כדי להתחיל, הזריק NOA 63 לתא דרך חור במרווח הטפלון באמצעות מחט בגודל 18. לאחר מכן הניחו את החדר בפלטה חמה המוגדרת על 125 מעלות צלזיוס.
הניחו לתא להתחמם לטמפרטורה אחידה למשך חמש דקות לאחר חימום החדר. רכשו את ה-NOA 63 למשך 20 דקות על ידי מיקום מנורת UV במרחק של 6.5 סנטימטרים מפני השטח של הזכוכית. הסר את ה-NOA 63 מהתא כשהוא עדיין חם באמצעות סכין גילוח.
לאחר מכן ריפוי פולימר זיכרון הצורה תחת אור ה-UV למשך שלוש שעות ו-40 דקות ישירות על הפלטה החמה ב-125 מעלות צלזיוס. כדי לאפיין את זיכרון הצורה של ה-NOA 63, הכינו דגימת משקולת על ידי לחיצה חמה על הסרט הנרפא בעזרת אגרוף מותאם אישית. לבסוף, תיעב את הדגימה למנתח מכני דינמי עם מתקן מתיחה.
הגדר את המכשיר למצב מבוקר כפה ותכנת את הליך הבדיקה כפי שנמצא בפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה. תוצאת ההליך היא פולימר זיכרון בצורת ריפוי איזותרמי או סרט SMP, הנח CSMP בפלטה חמה והגדר את הטמפרטורה גבוהה יותר מטמפרטורת מעבר הזכוכית על מנת להפחית את המודול ולהקל על החיתוך. להכנת דגימות בודדות מסרט ה-s וה-p הנרפא איזותרמית.
חותכים את סרט ה- s ו- p בעזרת סכין גילוח לגודל המדגם הרצוי. ניתן לתקן את הצורה הזמנית במספר דרכים שונות. הנה. מכבש הידראולי ספסל עם פלטות הניתנות לחימום וקירור משמש להבלטת טופוגרפיה זמנית.
ראשית, הגדר את הטמפרטורה של ה- PLA בטמפרטורה מעל ה- tg. לצורך הדגמה זו, הבלטה נוצרה על ידי ריפוי אפוקסי על תקליט ויניל כדי לייצר צורה זמנית של חריצים מקבילים. ההבלטה יכולה להיות עשויה מחומרים אחרים ועם טופוגרפיות שונות, אך חייבת להיות קשיחה יותר מה-NOA 63.
בטמפרטורת ההבלטה הנח את דגימות ה-s וה-p עם הפנים כלפי מטה על הבלטה. לאחר מכן הנח את הדגימות וההבלטה במכבש. החל כ-100 קילו פסקל טעינה מראש כדי ליצור מגע בין ה-PLA החימום והדגימות מחזיקות כחמש דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע לטמפרטורה אחידה.
לאחר שמגיעים לטמפרטורה אחידה, מרחו 1 עד 6 מגה-פסקל על הדגימות והחזיקו למשך דקה אחת. ה-SMP יישבר. אם מופעל לחץ גדול יותר.
הפעל מתחים קטנים יותר כדי להציג טופוגרפיות עם אמפליטודות קטנות יותר. לאחר הפעלת לחץ, הפחת את הטמפרטורה מתחת ל-TG על ידי שימוש ביכולת קירור המים של לוחות העיתונות. כאשר הטמפרטורה נמוכה מה-tg, הסר את הכוח המופעל לפני תחילת ניסוי תרבית התאים הפעילה.
אור ה-UV של ארון הבטיחות הביולוגי משמש לעיקור הדגימות. מסדרים את הדגימות עם הפנים כלפי מטה בכלים סטריליים ללא מכסים, ומדליקים את אור ה-UV למשך שש שעות. לאחר מכן הפכו את הדוגמאות לכלים סטריליים חדשים במצב עם הפנים כלפי מעלה.
הדליקו את אור ה-UV למשך שש שעות נוספות. יש לאזן את הדגימות למצב יציב יחסית לפני הציפוי בתאים. מניחים את הדגימות בצלחת של 96 בארות ומוסיפים 150 מיקרוליטר של צמיחה מלאה.
בינוני לבאר. מניחים את הצלחת באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד להגעה להחלמה החלקית הרצויה. לצורך הדגמה זו, הדגימות מודגרות למשך 30 שעות כדי לייצר משרעת גדולה מספיק כדי ליישר את התאים.
לאחר השגת התאוששות חלקית, ניתן לצפות את הדגימות בתאים. מניחים את הדגימות בצלחת חדשה של 96 בארות. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת תאים לכל אחת מהדגימות כאן, C3 H 10 t וחצי.
רוב הפיברובלסטים העובריים משמשים ב-20,000 תאים למיליליטר. כדי להשיג תאים מבודדים, אפשר לתאים להיצמד ולהתפשט על הטופוגרפיה הזמנית על ידי דגירה ב-30 מעלות צלזיוס למשך 9.5 שעות. לאחר מכן, בדוק את המורפולוגיה של התא לפני המעבר על ידי הסרת דגימות וביצוע הדמיית צביעה ופלואורסצנטיות של הדגימות.
חומר זה מציג אוטופלואורסצנטיות דרך רוב ה-UV וארבע פלואורו בטווח הנראה בקצה האדום הרחוק של הספקטרום, כגון Alexa Fluor 6 47 מומלץ להפחית את הרקע כדי לעורר דגימות להתאושש, להעביר את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ולהמשיך בתרבית למשך 19 שעות. זה מאפשר לחומר להתאושש ולתאים להתאים את המורפולוגיה שלהם לטופוגרפיה החדשה. לאחר הדגירה, יש למרוח את הכתמים המתאימים כגון פאלין להדמיית אקטין חוטית.
כשלב האחרון, ניתן לדמות את התאים על הטופוגרפיה החדשה המוצגת כאן היא זיכרון הצורה החד-כיוונית של תרופה אחת של NOA 63. חוזר על עצמו שלוש פעמים כאשר הכוכבית מציינת שהתחלת הניסוי נרפאה. NOA 63 הוא מוצק שקוף וזכוכית בעל תכונות זיכרון צורה מצוינות.
במקרה זה, החומר נרפא ומראה TG אחיד של 51.1 מעלות צלזיוס כפי שנקבע מתחילת ירידת מודול האחסון. הירידה במתח הנראית כאן מתרחשת ב-tg הנמדד. אחוז גדול מהמתח המופעל של 4.7% תוקן לאחר פריקת 20 מעלות צלזיוס המקביל ליחס קיבוע של 89.3%המתח הקבוע התאושש לאחר מכן ביחס של 84.4% בטווח טמפרטורות קטן יחסית במהלך החימום.
ביצועי זיכרון הצורה לא הראו הידרדרות עד שלושה מחזורים כפי שמעידים כל העקומות העוקבות כמעט בדיוק באותו נתיב. משרעת הטופוגרפיה הזמנית פוחתת עם הזמן ב-30 מעלות צלזיוס ב-30 שעות. ב-30 מעלות צלזיוס.
המשרעת הצטמצמה בכ-50% המצוין כאן בזמן אפס. זה יורד עוד 10% במהלך 9.5 השעות הבאות. כאשר ההתאוששות מופעלת על ידי העלאת הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, המשרעת מצטמצמת ל-0.5% מהמשרעת הראשונית תוך 9.5 שעות עבור הבלטה בשימוש ומתח הבלטה של 4.9 מגה-פסקל.
זה מתאים לשינוי פונקציונלי של חריצים של 13 מיקרומטר למשטח כמעט שטוח. פולימר זה מתאושש בטווח הטמפרטורות של 30 עד 37 מעלות בתנאי תרבית תאים. הסיבה לכך היא ספיגת מים ממדיום התרבית, פלסטיק המים מגדיל את הפולימר, מה שמוריד את ה-tg, ומאפשר התאוששות בטמפרטורות מתחת ל-TG היבש של 51 מעלות.
דוגמה להתנהגות תאים הנשלטת באמצעות שימוש במצעי תרבית תאים פעילים היא שינוי בארגון השלד הציטולוגי על מצעים מחורצים זמניים. לפני הפעלת ההתאוששות, חוטי המיקרו של האקטין מתיישרים לאורך כיוון החריצים. לאחר התאוששות על ידי עליית טמפרטורה, חוטי המיקרו התארגנו מחדש והם מכוונים באופן אקראי.
לעומת זאת, דגימות בקרה בעלות חריצים סטטיים, שטוחים או סטטיים אינן מתארגנות מחדש לאחר עליית הטמפרטורה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שניתן להתאים את הגיאומטריה של תא הריפוי, טמפרטורת המעבר של הפולימר, שיטת קיבוע המתח והרכב הפולימר עצמו כדי להשיג את המעבר הרצוי בניסוי שלך בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון PCR בזמן אמת, כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד ביטוי הגנים משתנה בתגובה לגירוי המכני מהמצע לאחר התפתחותו.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המכנוביולוגיה של התא לחקור את השלד התא, סידור מחדש ופיזיקה של חומר רך בשני ממדים. תודה על התעניינותך בעבודה שלנו ותודה על הצפייה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה לפיתוח מצעים לתרבית תאים שיכולים לשנות טופוגרפיה במהלך התרבות באמצעות פולימרים בעלי זיכרון צורה. הטכניקה מאפשרת תכנות של פולימר לצורה קבועה, שניתן לעוררה לחזור לאחור, ולהשפיע על התנהגות התאים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- תרבית תאים
- חומרים ביולוגיים
- פולימרים בעלי זיכרון צורה
רקע
- פולימרים בעלי זיכרון צורה יכולים לזכור ולחזור לצורה קבועה.
- שינוי טופוגרפיה של המצע יכול להשפיע על התנהגות התאים.
- שיטה זו ניתנת להתאמה לחומרים ויישומים שונים.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה משמשת לצפייה בשינויים בהתנהגות התאים.
מטרת המחקר
- לפתח מצע שמשנה טופוגרפיה לאורך זמן.
- לחקור את ההשפעות של שינויים טופוגרפיים על התנהגות התאים.
- לנצל חומרים חכמים לטכניקות חדשניות לתרבית תאים.
שיטות ששימשו
- תכנות פולימרים בעלי זיכרון צורה לצורה קבועה.
- יצירת צורה זמנית להנחת תאים.
- עורר את הפולימר לחזור לצורה הקבועה שלו על ידי העלאת הטמפרטורה.
- שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה לניתוח שינויים בהתנהגות התאים.
תוצאות עיקריות
- הושגה תכנות מוצלח של פולימרים בעלי זיכרון צורה.
- שינויים בהתנהגות התאים נצפו באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- השיטה הדגימה התאמה לחומרים שונים.
- שינויים טופוגרפיים השפיעו משמעותית על תגובות התאים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה חדשנית לתרבית תאים.
- פולימרים בעלי זיכרון צורה יכולים לשנות ביעילות את טופוגרפיית המצע.
- לטכניקה זו יש פוטנציאל ליישום בהנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Shape memory polymer (SMP) substrates enable programmable, dynamic control of cell culture topography, directly addressing the need for active mechanobiology platforms in early discovery. This capability supports predictive confidence in cell behavior studies by allowing real-time modulation of the cellular microenvironment. Integrating SMP-based active cell culture systems enhances mechanistic de-risking and informs target validation decisions across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular responses to dynamic mechanical cues for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by revealing how cells adapt to changing substrate topographies.
- Facilitates predictive confidence in pathway analysis by controlling environmental variables.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, programmable substrates for reproducible mechanobiology assays.
- Standardizes topographical transitions to ensure assay consistency and quantitative outputs.
- Enables scalable screening of compounds under dynamic mechanical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanobiology models with disease-relevant dynamic environments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time cell adaptation studies.
- Provides predictive de-risking for tissue engineering and regenerative medicine applications.
Pipeline & Workflow Integration
SMP-based active cell culture platforms fit within the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on cell-environment interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, programmable assay substrates for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts of cell morphology and cytoskeletal organization via fluorescence imaging.
- Translational Research: Models dynamic tissue environments to inform biomarker and therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various cell types and mechanobiology questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Standardizes dynamic substrate preparation and enables reproducible mechanobiology workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing dynamic, physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer processing and mechanobiology assay design.
- Needs access to dynamic mechanical analyzers, programmable presses, and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of substrate preparation and recovery protocols.
- Adaptable to both 2D and 3D culture systems with appropriate protocol modifications.
- Considerations include polymer composition, transition temperature, and topography design for specific applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:47
Isothermal UV-Curving of Norland Optical Adhesive 63 (NOA63) and Shape Memory Characterization
3:23
Preparation of Active Cell Culture Substrates
5:11
Active Cell Culture Experiment
7:22
Active Cell Culture on Shape Memory Polymers: Representative Results
10:02
Conclusion
