זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל תאים על תשתית בעלת טופוגרפיה המשתנה עם הזמן. הדבר מושג תחילה על ידי תכנות פולימר בעל זיכרון צורה לצורה קבועה שניתן לזכור. לאחר מכן, הפולימר בעל זיכרון הצורה מתוכנת לצורה זמנית, שעל פניה נזרעים התאים בשלב מאוחר יותר.

השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הפעלת הפולימר בעל זיכרון הצורה לחזור לצורתו הקבועה על ידי העלאת הטמפרטורה, ובסופו של דבר ניתן לקבל תוצאות המראות שינוי בהתנהגות התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, שמי פאט מאת'ר. אני פרופסור להנדסה ביו-רפואית וכימית ומנהל מכון הביומטריאלים של סיראקיוז כאן באוניברסיטת סיראקיוז.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מכשירים מסחריים או מותאמים אישית למתיחת תאים הוא שבמערכת פולימרית אחת, אנו יכולים להפעיל מגוון רחב של מאמצים מורכבים על התאים. שמי ג'יי הנדרסון. אני מרצה בכיר להנדסה ביו-רפואית וכימית וחבר במכון לביומטריאליים של סיראקיューズ.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה (Mechanobiology), כגון האופן שבו תאים מגיבים לשינויים דינמיים בסביבתם הפיזית. שמי קווין דייוויס ואני סטודנט לדוקטורט באוניברסיטת סירקיוז במחלקה להנדסה ביו-במדית והנדסה כימית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה מכנית דו-ממדית (2D), ניתן להשתמש בה גם עבור מערכות אחרות, כגון פיגומים משני-צורה תלת-ממדיים (3D) להנדסת רקמות.

לפני תחילת הליך זה, הכינו תא פולימריזציה מותאם אישית באמצעות סלייד זכוכית, ספייסר טפלון בעובי של 1 מילימטר ולוח אלומיניום. אבטחו את התא באמצעות תפסים קטנים, ולאחר מכן, הזרקו NOA 63 אל תוך התא דרך חור בספייסר הטפלון באמצעות מחט במידה 18. לאחר מכן, הניחו את התא על פלטה מחממת המכוונת ל-125 degrees Celsius.

לאחר חימום התא, המתינו חמש דקות עד שהתא יגיע לטמפרטורה אחידה. בצעו פילמור של ה-NOA 63 במשך 20 דקות על ידי מיקום מנורת UV במרחק של 6.5 centimeters מפני השטח של הזכוכית. הוציאו את ה-NOA 63 מהתא בעודו חם באמצעות להב תער.

לאחר מכן, בצעו פוסט-קיור (post cure) לפולימר עם זיכרון הצורה תחת אור UV למשך שלוש שעות ו-40 דקות, ישירות על פלטה חמה בטמפרטורה של 125 °C. כדי לאפיין את זיכרון הצורה של ה-NOA 63, הכינו דגימה בצורת משקולת (dumbbell) באמצעות דחיסה חמה של הסרט המקשוח עם מחץ מותאם אישית. לבסוף, התקינו את הדגימה באנליזה מכנית דינמית (DMA) עם אביזר למתיחה.

הגדירו את המכשיר למצב בקרת כוח ותכננו את הליך הבדיקה כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. תוצאת ההליך היא סרט פולימר בעל זיכרון צורה (SMP) שעבר הקשייה איזותרמית. הניחו את ה-CSMP על פלטה חמה והגדירו טמפרטורה הגבוהה מטמפרטורת מעבר הזכוכית כדי להפחית את המודולוס ולהקל על החיתוך. הכינו דגימות בודדות מסרט ה-SMP שעבר הקשייה איזותרמית.

חתוך את סרט ה-s ו-p באמצעות תער לגודל הדגימה הרצוי. ניתן לקבע את הצורה הזמנית במספר דרכים שונות. כאן, נעשה שימוש במכבש הידראולי לשולחן מעבדה עם פלטות שניתן לחמם ולקרר כדי להטביע טופוגרפיה זמנית.

ראשית, הגדירו את הטמפרטורה של ה-PLAs לטמפרטורה הגבוהה מה-tg. לצורך הדגמה זו, נוצר מעצב על ידי הקשיה של אפוקסי על תקליט ויניל כדי להפיק צורה זמנית של חריצים מקבילים. ניתן להכין את המעצב מחומרים אחרים ובטופוגרפיות שונות, אך עליו להיות קשיח יותר מה-NOA 63.

בטמפרטורת ההטבעה, הניחו את הדגימות s ו-p כשהן פונות כלפי מטה על המטבע. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות ואת המטבע למכבש. הפעילו עומס מוקדם של כ-100 kilo pascals כדי ליצור מגע בין ה-PLAs המחממים לבין הדגימות, והמתינו כחמש דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע לטמפרטורה אחידה.

לאחר הגעה לטמפרטורה אחידה, יש להפעיל לחץ של 1 עד 6 megapascals על הדגימות ולהמתין במשך דקה אחת. ה-SMP יישבר. במידה ויופעל מאמץ גבוה יותר.

יש להפעיל מאמצים קטנים יותר כדי ליצור טופוגרפיות בעלות אמפליטודות קטנות יותר. לאחר הפעלת הלחץ, יש להפחית את הטמפרטורה אל מתחת ל-TG באמצעות יכולת קירור המים של פלטות המכבש. כאשר הטמפרטורה נמוכה מה-tg, יש להסיר את הכוח המופעל לפני תחילת ניסוי תרבית התאים הפעילה.

השתמש באור ה-UV של קבינת הבטיחות הביולוגית כדי לעקר את הדגימות. סדר את הדגימות כשהן פונות כלפי מטה בתוך צלחות סטריליות ללא מכסים, והפעל את אור ה-UV למשך שש שעות. לאחר מכן, העבר את הדגימות לצלחות סטריליות חדשות כאשר הן פונות כלפי מעלה.

הדליקו את נורת ה-UV למשך שש שעות נוספות. יש להביא את הדגימות למצב שיווי משקל יציב יחסית לפני הזריעה עם תאים. העבירו את הדגימות לפלטה בעלת 96 בארות והוסיפו 150 µL של מצע גידול מלא.

מדיום לכל באר. העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 30 °C עם 5%CO2 עד להשגת ההתאוששות החלקית הרצויה. בהדגמה זו, הדגימות מוכנסות לאינקובציה למשך 30 שעות כדי להפיק אמפליטודה גדולה מספיק ליישור התאים.

ברגע שהושג התאוששות חלקית, ניתן לזרוע תאים על הדגימות. העבירו את הדגימות לפלטת 96 בארות חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 150 µL של תמיסת תאים לכל אחת מהדגימות כאן, C3 H 10 t and a half.

מרבית הפיברובלסטים העובריים משמשים בריכוז של 20,000 תאים למילילטר. כדי להשיג תאים מבודדים, יש לאפשר לתאים להיצמד ולהתפשט על הטופוגרפיה הזמנית באמצעות דגירה ב-30 degrees Celsius למשך 9.5 שעות. לאחר מכן, יש לבחון את מורפולוגיית התאים לפני המעבר על ידי הוצאת דגימות וביצוע צביעה ודימות פלואורסצנטי של הדגימות.

חומר זה מציג פלואורסצנציה עצמית לאורך רוב טווח ה-UV והטווח הנראה; מומלץ להשתמש בצבעי פלואורסצנציה מקצה הספקטרום האדום הרחוק, כגון Alexa Fluor 647, כדי להפחית את הרקע. כדי לאפשר לדגימות להתאושש, העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והמשיכו בתרבית למשך 19 שעות. פעולה זו מאפשרת לחומר להתאושש ולתאים להתאים את המורפולוגיה שלהם לטופוגרפיה החדשה. לאחר האינקובציה, יש להוסיף את הצבעים המתאימים, כגון phalloidin לצילום של actin פילמנטרי.

כשלב סופי, ניתן לצלם את התאים על הטופוגרפיה החדשה; מוצג כאן זיכרון צורה חד-כיווני של תגבּור (bulk) של NOA 63 שעבר פולימריזציה. הפעולה חזרה על עצמה שלוש פעמים, כאשר הכוכבית מציינת את תחילת הפולימריזציה הניסויית. NOA 63 הוא מוצק זכוכיתי שקוף בעל תכונות זיכרון צורה מצוינות.

במקרה זה, החומר עבר מעבדה (cured) ומראה TG אחיד של 51.1 °C כפי שנקבע מנקודת ההתחלה של הירידה במודול האחסון (storage modulus). הירידה במאמץ (strain) הנצפית כאן מתרחשת ב-tg הנמדד. אחוז גבוה מהמאמץ המופעל של 4.7% נותר קבוע לאחר פריקה בטמפרטורה של 20 °C, מה שמתאים ליחס קיבוע של 89.3%. לאחר מכן, המאמץ הקבוע שוחזר ביחס של 84.4% בטווח טמפרטורות קטן יחסית במהלך החימום.

ביצועי זיכרון הצורה לא הראו התדרדרות עד לשלושה מחזורים, כפי שמעיד העובדה שכל העקומות עקבו כמעט בדיוק אחרי אותו נתיב. אמפליטודת הטופוגרפיה הזמנית פוחתת עם הזמן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius במשך 30 שעות. ב-30 degrees Celsius.

האמפליטודה הופחתה בכ-50%, כפי שמוצג כאן בזמן אפס. היא פוחתת ב-10% נוספים במהלך 9.5 השעות הבאות. כאשר ההתאוששות מופעלת על ידי העלאת הטמפרטורה ל-37 °C, האמפליטודה פוחתת ל-0.5% מהאמפליטודה הראשונית תוך 9.5 שעות עבור המכבש שנעשה בו שימוש ומאמץ הבלטה של 4.9 megapascals.

זהו שינוי פונקציונלי מחריצים של 13 µm למשטח כמעט שטוח. פולימר זה מתאושש בטווח טמפרטורות של 30 עד 37 °C בתנאי תרבית תאים. הדבר נובע מספיגת מים מתוך תווך התרבית; המים מרככים את הפולימר, דבר המוריד את ה-tg ומאפשר התאוששות בטמפרטורות הנמוכות מה-TG של הפולימר היבש, העומד על 51 °C.

דוגמה להתנהגות תא הנשלטת באמצעות שימוש בתשתיות פעילות לתרבית תאים היא שינוי בארגון השלד התאי על גבי תשתיות בעלות חריצים זמניים. לפני הפעלת ההתאוששות, סיבי האקטין (actin microfilaments) מסתדרים לאורך כיוון החריצים. לאחר התאוששות באמצעות העלאת הטמפרטורה, סיבי המיקרו התארגנו מחדש והם מכוונים באופן אקראי.

לעומת זאת, דגימות ביקורת בעלות פני שטח שטוחים או חריצים סטטיים אינן עוברות ארגון מחדש לאחר העלייה בטמפרטורה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ניתן להתאים את גאומטריית תא ההקשיה, טמפרטורת המעבר של הפולימר, שיטת קיבוע המאמץ והרכב הפולימר עצמו כדי להשיג את המעבר הרצוי בניסוי שלכם בעקבות ביצוע פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון real time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד משתנה ביטוי הגנים בתגובה לגירוי המכני מהמצע לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המכנוביולוגיה של התא לחקור את שלד התא, ארגון מחדש ופיזיקה של חומר רך בממדים שניים. תודה על התעניינותכם בעבודתנו ותודה שצפיתם.