Name: בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו לבנות במה קריוגנית בעלות נמוכה לצילום קורלטיבי בין מיקרוסקופיית אור לקריוגנית ואלקטרונית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לתעד תאים קפואים במחיר סביר ולשמר את מבנה הדגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ברנדון ג&#39;הרוכסן וקן ב &#39;קפלן עבור מתן גישה זן שמרים השתמשו במחקר זה. המחברים מודים גם חוליו לנין דומינגז-רמירז לסיוע עם צילום וידיאו. JEE מודה תמיכה NIH למימון מענק 5RC1GM91755 מספר.

1. ייצור והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מפזר החום אלומיניום בתוך 22.96 ס"מ (9 ") במחבת העוגה כ 2 ס"מ מהצד של המחבת, כפי שמוצג באיור 1c שימוש בטוש שחור, חורים סימן עבור מפזר החום אלומיניום הערה:.. אם אלומיניום בלוק (לרכוש חנות גרוטאות מתכת המקומית או באינטרנט <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) לא מגיע עם טרום קדח חורים, תצטרך לארגן יש חורים שנקדחו ו המשוקעים לפני שלב 1 כדי לאבטח את אלומיניום לחסום למחבת את העוגה. השתמשנו 5 חורים כדי לאבטח את גוש לפלטפורמת ו 4 חורים נוספים כדי לאפשר גז בועות חנקן לברוח תחת האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תיבת cryo-רשת ליד המיקום של מפזר החום אלומיניום לסמן את החריץ ואת כל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים טייס לכל תפקיד מסומן באמצעות קצת # 17 לקדוח חורים החום אלומיניום כיור קצת # 35 לקדוח חורים cryo-רשת התיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חום אלומיניום כיור באמצעות 5 - # 10, 1.9 ס"מ (3 / 4 ") ראש שטוח מחוררת ברגים ואומים המקביל כמו גם 15 - # 10 מנקי מניחים שתי דיסקיות מתחת לבלוק אלומיניום השלישי על הישבן של. פשטידת מחבת של כל חור הערה:. המסוכך בחו"ל של גוש אלומיניום בסמוך לאזור הצפייה עלולה לגרום לתנודות המגבילים יכולות הדמיה של הבמה בדוק כדי לוודא שכל הברגים הרכבה הם הידקו בחוזקה.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 3 - # 4, 0.95 ס"מ (3 / 8 ") בסיבוב ברגים מחוררת ואגוזים המקביל מהישבן של פאן פאי לשמש cryo-רשת התיבה הר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת 4 מקלות אכילה יחד בזוגות עם המקל על גבי מחילות. כל זוג Tape לקצוות מרוחקים של המחבת עוגת לשמש מפרידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח רטוב העליון ובחלק התחתון של העוגה עוגת מחבתות בהתאמה עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחבת עוגה עם שתי שכבות של ספריי קצף בידוד. הרטבת כל שכבה לפני שהולכים לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התבנית לתוך הקצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפכו את מחבתות הפוך ולחץ על מחבת את העוגה עד מפרידי הקשר את התבנית. מניחים חפץ משוקלל על גבי מחבת את העוגה ולתת לשבת לילה לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סכין משוננת, לחתוך עודף יבשים ספריי קצף בידוד מקצה מחבתות והסר את מקלות אכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורידים את הסיר העוגה מהתבנית את העוגה. במחבת עם גוף הקירור העוגה אלומיניום מבודד עכשיו יהיה המכונה "שלב קריוגני" (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים לוח פלסטיק שקוף (כל צבע יותר מאשר 3 מ"מ עובי) מעל הבמה קריוגני. סמן בטוש שחור את מיקומו של הר cryo-רשת התיבה על ידי ציור עיגול כ -1.5 פעמים הקוטר של עגול אחד cryo-רשת התיבה. לגזור חור עם 1.9 ס"מ (3 / 4 ") ראה חור. הלוח זה יהיה המכונה" מסך הטעינה "(איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ללוח שקוף חדש מעל הבמה קריוגני ומניחים על מיקרוסקופ עם מפזר החום ישירות תחת עדשות אובייקטיבי. בטוש שחור, סימן את הנתיב של היעדים כפי שהם לסובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך הקו המסומן הסרת חצי מעגל מקצה הלוח. ניתן להשיג זאת עם פאזל או בעזרת 7.62 ס"מ (3 ") חור ראיתי מספר פעמים כפי שמוצג בסרטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לחתוך חור 1.9 ס"מ (3 / 4 ") במרחק חצי העיגול, אבל עדיין בתוך השטח של המנה. זה יהיה נמל למילוי חנקן נוזלי (באעכליה 2) אם תוך ירידה ברמות הדמיה. הלוח הזה יופנה בשם "מסך הצפייה" (איור 1 ג'). </li></ol> 2. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל שלב יומן שמרים תאים שגודלו סינתטי (SC) התקשורת מלאה הריכוז המתאים של 1x10 6 תאים / מ"ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ"ל של השמרים בדילול הם pipetted על R2 / 1 400 רשת המחוררת פחמן מצופה נחושת cryo-EM רשת (ספקי SPI, במערב צ'סטר, פנסילבניה) וכן מותר לספוג למשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם משם נוזל עודף מפני השטח לרשת על ידי נגיעה בחלק האחורי של הרשת לפיסת קרוע של רקמה רכה תאית (Kimwipe) למשך 2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך, הרשת ניתן לכבס עם 3 טיפות μL של מים (1-3 פעמים), ואת הרשעים משם כמו בשלב 3 של סופג מאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לפני הגמר, המדגם הוא נטען לתוך המקפיא לצלול פנאומטי והרשת תלוי נשטף כמו בשלב 2.4. לאחר סופג את הרשת עם נייר קרוע (Kimwipe) כדי להסיר את רוב המים מפני השטח, הרשת הוא צלל לתוך באעכליה 2 מקורר אתאן נוזלי והועברו תיבת cryo-רשת אחסון עבור הערה: 1. חשוב להשאיר שכבה של נוזל דק ככל האפשר על פני השטח כדי למנוע התייבשות המדגם. לא נכון יהיה גם סופג לייבש את המדגם או לעזוב קרח אטומה האלקטרון הקורה. </li></ol> 3. Cryo-Light מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הבמה עם קריוגניבאעכליה 2 במהירות לכסות עם מסך הטעינה (לוח פלסטיק עם 1.9 ס"מ בודד (3 / 4 ") חור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתכת מגיע באעכליה 2 טמפרטורה, להעביר את תיבת cryo-רשת דרך 1.9 ס"מ (3 / 4 ") חור של המסך טעינה לתוך להעביר את הר שנוצר על ידי 3 ברגים המתואר A5 חלק. הברג החוצה את תיבת cryo-רשת מבעל שלה להסיר את בעל גישה משופרת. שמור בעל cryo-רשת בתיבה תחת באעכליה 2 בתוך דיואר נפרדת עד שלב 3.10. תיבת cryo-רשת צריך גם להיות כל הזמן תחת באעכליה 2 רשת כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . דיו באעכליה 2 בשלב קריוגני ממש מתחת העליון של מפזר החום אלומיניום הערה: באעכליה 2 רמות יש לבדוק מעת לעת ומילא בתהליך הדמיה כדי להבטיח באעכליה 2 הוא ברציפות במגע עם גוף הקירור. באופן כללי, מילוי מתרחשת כל 10 דקות דרך נמל למלא את המסך לצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מגניב קצה פינצטה ב באעכליה 2, ולאחר מכן להעביר לרשת שלך (ים) על גבי משטח שטוח הצפייה של הכיור אלומיניום חום עם פינצטה, באמצעות 1.9 ס"מ (3 / 4 ") חור של מסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את cryo-הבמה מתחת פתחים המטרה של מיקרוסקופ אור משתקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את מסך הצפייה שקוף על גבי מסך הטעינה. ואז לאט לאט להסיר את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מתחת הערה צפייה במסך:. בשלב זה, המדגם הוא הפגיע ביותר. כל זרמי אוויר סביב המיקרוסקופ צריך להיות ממוזער, ביניהם: נשימה, פתח את הדלת הסמוכה, אנשים חולפים, וכו 'אנו ממליצים לובש facemask או תלוי מגן פנים שקוף מתחת למיקרוסקופ מהעיניות כאמצעי זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העדשות אובייקטיבית לתוך הסביבה גז קר חנקן של הבמה cryo ולסרוק למדגם על שטח חום שטוחה כיור הצפייה. באמצעות אור רגיל בהיר בשדה מיקרוסקופיה להתמקד טכניקות על רשת עם מטרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את מרכז ולקחת תמונה כללית. מפרט לגבי עדשות מיקרוסקופ אור משמש לצורך הניסוי הזה המפורטים בסעיף חומרים ניסויית. הערה: באעכליה 2 לא בא במגע עם עדשות אובייקטיבי יש לנו עדיין לראות את ההשפלה של תמונות או נזק עדשות מהשפעות קירור . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בהגדלה גבוהה על שטח של עניין לרכוש נתונים עם שדה בהיר, שדה חשוך, אור מקוטב או דימות פלואורסצנטי. הקפד לרשום את המיקום של אזור הריבית על התמונה שדה נמוך בהיר הגדלה עבור מתאם בעתיד. אם כל אמצעי הזהירות המפורטים לעיל עבור מילוי באעכליה 2 הם אחריו, ולאחר מכן לחץ חיובי החנקן מתאדים מספיקה כדי לשמור על הסביבה זיהום חופשי (עצמאי של החדר לחות) למשך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים, להחליף את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מעל מסך התצוגה. הסר את המסך לצפייה על ידי האטת מחליק אותו מתחת למסך הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבמה cryo מן מיקרוסקופ עם פינצטה מקורר מראש, להעביר את הרשת בחזרה אל תיבת cryo-לרשת. בורג בעל cryo-רשת התיבה לתוך תיבת cryo-רשת לאטום נגד הסביבה ולהעביר את המחזיק ל דיואר LN2 לאחסון הדמיה בעתיד. </li></ol> 4. מיקרוסקופית אלקטרונים cryo- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טכניקות סטנדרטיות והקים, לטעון את רשת מדגם לתוך המחזק cryo-EM העברה תוך שמירה על הדגימה בטמפרטורת חנקן נוזלי בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את cryo-מחזיק עם רשת מדגם לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאור הגדלה מתאים נמוכה (50-500x הגדלה נומינלית), למצוא את המרכז של הרשת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שנאספו בעבר נמוך cryo-LM הגדלה נתונים צעד 3.7 כדי לקבוע את הכיוון היחסי של כרטיסיות המרכזי של רשת נחושת (כמתואר באיור 2), לזהות אזורים המדויק של עניין המתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך יישור מיקרוסקופ, במינון נמוך cryo-EM הדמיה איסוף הנתונים. </li></ol> 5. נציג תוצאות השלב קריוגני (איור 1 א) היא דרך יעילה לאיסוף cryo-LM נתונים עבור מיקרוסקופיה cryo-פלואורסצנציה וניתוח cryo-LM/cryo-EM גומל. איור 2 מראה כיצד שילוב של תמונות נמוך וגבוה cryo-LM ההגדלה מאפשר לך לבנות מפות התייחסות לכוון אותך לאזורים ספציפיים cryo-EM. כתוצאה cryo-LM התייחסות המפה (איור 2b) נוצל במהלך רכישת נתונים cryo-EM לאתר אזורים המדויק שמוצג באיור 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שלב קריוגני. א) הפריסה של השלב קריוגני מורכב העברת cryo-רשת תיבה הר הצביעו wהחץ ith לבן מפזר החום אלומיניום. רשתות מועברים תחת באעכליה 2 מתוך תיבת cryo-לרשת והניח ישירות על אזור התצוגה הכיור של חום, כמצוין על ידי החץ השחור. ב) תמונה המתארת ​​את השלב קריוגני עם טעינת מסך. חור במסך הטעינה ממוקם ישירות מעל cryo-רשת התיבה הר משמש ליציאת להעביר דגימות להעברת דגימות תיבת cryo-הרשת לאזור מדגם צפייה על מפזר החום עם פינצטה. ג) קריוגני בשלב בעמדה תחת עדשות אובייקטיבי עם מסך צפייה במקום. נתק מיוחד על המסך מאפשר צפייה עדשות אובייקטיבי הנדנדה בקלות למצב מבלי להזיז את הבמה קריוגני. חור במסך הצפייה הרחק מאזור מדגם משמש באעכליה 2 למלא נמל לחדש באעכליה 2 רמות במידת הצורך. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ניווט LM-cryo ללימודי גומל.) בהגדלה נמוכה cryo-LM נוף של תאים שמרים דבק רשת מדגם. ב) אותה תמונה ב (א) ועליהן תמונה בהגדלה גבוהה הקרינה בשטח של עניין עם מצולע כתום מלא לציון מרכז של רשת המדגם. המרכז מורכב מקבוצה של ארבעה ריבועים, שלושה שיש לשונית מתכת נוספת הפתוח הלאה. במשך שלושה ריבועים עם לשונית מתכת נוספת, שני זוגות חולקים על הכרטיסייה על צירים ארוכים וקצרים להרכיב מרכז אסימטרי. מרכז זה אסימטרית ניתן לראות בפינה השמאלית העליונה שימשה כדי לציין את זווית סיבוב handedness של הרשת בין cryo-LM ו cryo-EM. מאחד נמוך התמונה הגדלה באזורים רבים של עניין ניתן לסמן ושימש המפה התייחסות לאתר אזורים זהים cryo-EM. ג) מוגדל הקרינה cryo-LM תמונה של האזור של עניין (ב). HTA1-CFP, סמן בטרמינל C-CFP היסטון, ניתן לראות מבנה punctate ירוק תיוג את מיקומו של הגרעין. ד) תמונה cryo-EM של האזור המקביל ב (ג). ברים סולם מייצגים 50 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. מתאם של cryo-LM ו cryo-EM. שני שדות הראייה המתארת ​​שמרים תאים זהים בקורלציה עם שדה cryo-בהיר (א, ד), cryo-פלואורסצנטי (ב, ה), ו cryo-EM (ג, ו ). ברים סולם מייצגים 5 מיקרון.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

<p class="jove_content"&gt; שימוש הבמה קריוגני שלנו הכנת המדגם טכניקות, מחקרים המתאם בין cryo-LM ו cryo-EM התערוכה מספר יתרונות על פני הגישות המסורתיות בטמפרטורת החדר, כולל אך לא מוגבל ל: קיבוע מהיר<sup&gt; 1,2</sup&gt;, הקטינה photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt;, וסריקה של שלמות המדגם לפני cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; או כימי קיבעון / הטבעה<sup&gt; 6</sup&gt;. אחד צווארי בקבוק עבור cryo-EM איסוף נתונים הוא הזמן הנדרש הן העברת מדגם לתוך TEM ו לסרוק את הרשת כדי למצוא אזורים מתאימים לתמונה. עם רכישת נתונים מהירה של cryo-LM<sup&gt; 5</sup&gt;, הזמן המוקדש למציאת תאים טוב יכול להיות מופחת במידה ניכרת. לפיכך, אנו יכולים לחסוך זמן וכסף ולצמצם את צוואר הבקבוק על ידי מראש סריקת מיפוי תחומי עניין cryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; שלבי קריוגני יקר יותר או מורכבים עשוי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה cryo-LM. עם זאת, בשלב מפוברק כאן היא יותר ממספקת עבור יישומים רבים. אם cryo-LM הדמיה רשת העברות מדגם מבוצעות בזהירות כפי שמתואר בטקסט ווידאו, הדמיה מלאה זיהום חופשי יכול להיות מושלם. שיטה זו מאפשרת קשר ישיר של נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלקטרון באותו תא, אברון או מורכב macromolecular מפוזרים על התמיכה פחמן או בתוך קטע רקמה דקה<sup&gt; 7</sup&gt;. יש לציין כי ערך בשלב זה קריוגני חורג מחקרים המצטרף cryo-LM/cryo-EM לתחום במיקרוסקופ אור כולה. שלב זה קריוגני הוא גם מתאים הן דוגמאות וצבעים עדינים fluorophore / כתמים<sup&gt; 8</sup&gt;, נקודות קוונטיות, או החלבונים המתויגים fluorescently<sup&gt; 9</sup&gt; זה עשוי להיות לא יציב במהלך קיבוע כימי בטמפרטורה בחדר והטבעה עם glutaraldehyde ו paraformaldehyde. כתוצאה מכך, אנו מקווים כי זה שלב קריוגני תספק גישה גדולה יותר למעוניינים cryo-LM, שהיו בעבר נרתע גישה העלות מספקת.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; פתרון בעיות cryo-Light מיקרוסקופית</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. לדוגמה ספיחה:</em&gt; מדגמים שונים יכולים להפגין משתנה מאפיינים ספיחה לתמוך פחמן. אתה עלול למצוא לנכון להשתמש בסוגים אחרים של רשתות תמיכה כגון פחמן רציפה, פחמן המחוררת, או רשתות מצופה formvar לתמיכה המדגם. בנוסף, אם המדגם הוא מחייב את הסורגים נחושת של הרשת ולא משטח הפחמן, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כימיה של פני השטח הפחמן על ידי דוגרים את הרשת עם סוכן הרטבה או על ידי זוהר ופריקה לפני כן המדגם.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. שלב יציבות:</em&gt; אם אתה מבחין הרטט, סביר להניח עקב הבמה מדגם להיות עמוסה עם משקל ולא המבעבע של LN2. המשקל הנוסף של שלב קריוגני, יכול לפעמים לגרום לתנודות בתדירות נמוכה לשדר לאורך הבמה מיקרוסקופ רגיל 3-ציר הנסיעה, להשפיע לרעה על דימות באמצעות טשטוש. זה יכול בקלות להיות מתוקן על ידי תמיכה לשלב נסיעה של מיקרוסקופ מלמטה עם או להרים מיני מתכווננת או מתאם מתכווננת עם בורג כפול נשק, כפי שמוצג בסרטון. שני אלה במנגנוני תמיכה מתכווננת אינטראקציה עם החלק הלא ניד של הבמה לנסוע ולכן עדיין היתרי X ו-Y ציר תרגום כנדרש הדמיה.</p

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th><th> עלות </th></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) פשטידת מחבת עם קצה משופע </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.39 $ </td></tr><tr><td> 1-22.86 ס&quot;מ (9 &quot;) עוגת מחבת </td><td> טוב קוק </td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 4.93 $ </td></tr><tr><td> 4 זוגות של מקלות אכילה </td><td></td><td></td><td> בחנות מכולת מקומית </td><td> 0.50 $ </td></tr><tr><td> 1 - ספריי קצף הגדול Stuff </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 5.98 $ </td></tr><tr><td> 1 - 4cm x8cm לחסום x1cm של אלומיניום </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי או חצר גרוטאות מתכת </td><td> 10.00 $ </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1.91 ס&quot;מ (3 / 4 &quot;) ראש שטוח מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 3 - 4 0.95 ס&quot;מ (3 / 8 &quot;) עגול מחוררת ברגים w / אגוזים </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 15 - # 10 מנקי </td><td></td><td></td><td> חומרה לאחסון מקומי </td><td> 0.98 $ </td></tr><tr><td> 2 - פלסטיק שקוף כתיבה </td><td></td><td></td><td> משרד מקומי חנות </td><td> 6.84 $ </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM רשת בעל תיבת </td><td> טד פלה </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - cryo-EM תיבת לרשת מוט טיפול </td><td> טד פלה </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 הסרט המחוררת פחמן, 400-רשת cryo-EM נחושת רשת תמיכה </td><td> SPI ספקי </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> ניסיוני חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן שמרים: Hta1-CFP: קן (נכ&quot;ק-3382: מאטה, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP: KanMX6 ממעבדת קפלן ב UC Davis). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Light מיקרוסקופית: cryo-מיקרוסקופ אור תמונות צולמו על מיקרוסקופ הלייקה DM4000M המשקף עם DFC310 לייקה FX מצלמת CCD. שדה מוארת, שדה כהה ותמונות Fluorescence נרכשו או באמצעות PL HCX FLUOTAR 5x 0.15 NA אובייקטיבי אוויר, PL HCX FLUOTAR אובייקטיבי 10x 0.30 NA אוויר, FLUOTAR PL 50x 0.55 אובייקטיבי NA אוויר או 100x NPLAN 0.75 אובייקטיבי NA האוויר. שדה מוארת ותמונות שדה כהה משמש מנורה 12V 100W טונגסטן כמקור אור. עבור פלואורסצנטי, EL6000 מנורת UV שימש מקור בשיתוף עם JC1 לייקה (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580) Cube סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryo-Transmission מיקרוסקופית אלקטרונים: cryo-EM התמונות נרכשו על מיקרוסקופ Jem-2100-FEG אלקטרונים הילוכים (JEOL, יפן) הפעלה ב 200 קו ניצול 626 Gatan cryo-להעביר לבעל (Gatan, ארה&quot;ב). Micrographs נרשמו בהגדלה הנומינלי של X 50, 200, 1200 ו - 4000 על 4096 x 4096 פיקסלים טיץ מצלמת CCD (TVIPS, גאוטינג, גרמניה). </li></ol>

בעלות נמוכה cryo-light stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

צימוד של מיקרוסקופיה cryo-אור (cryo-LM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM) מהווה מספר יתרונות להבנת הדינמיקה הסלולר ultrastructure. ראשית, תאים ניתן הדמיה בסביבה יליד ליד טכניקות שניהם. שנית, בשל תהליך vitrification, דגימות נשמרים על ידי immobilization פיזי מהיר יותר מאשר קיבוע כימי איטי. שלישית, הדמיה מדגם זהה עם שני cryo-LM ו cryo-EM מספק המתאם של נתונים מתא בודד, ולא השוואה של &quot;מדגמים מייצגים&quot;. למרות היתרונות הללו ידועים ממחקרים קודמים, השימוש הנרחב המצטרף cryo-LM ו cryo-EM נשאר מוגבל בשל חשבון והמורכבות של רכישת או בניית מיקרוסקופ מתאים קריוגני שלב אור. כאן אנו מדגימים את הרכבה, ושימוש בשלב קריוגני יקר זה יכול להיות מפוברק במעבדה כל פחות מ 40 $ עם חלקים למצוא בכתובת חומרה מקומיים וחנויות מכולת. שלב זה cryo-LM מיועד לשימוש עם מיקרוסקופים האור המוחזר כי מצוידים זמן האוויר מטרות עבודה מרחוק. עבור המצטרף cryo-LM ו cryo-EM מחקרים, אנו להתאים את השימוש של פחמן סטנדרטי מצופה 3 מ&quot;מ cryo-EM רשתות כמו תומך הדגימה. לאחר adsorbing המדגם לרשת, פרוטוקולים הוקמה בעבר עבור vitrifying המדגם והעברת / טיפול לרשת הן בעקבות להתיר טכניקה רב הדמיה. כתוצאה מכך, התקנה זו מאפשרת לכל מעבדה עם מיקרוסקופ האור המוחזר כדי לקבל גישה המצטרף הדמיה ישירה של דגימות hydrated קפואים.

אנו מדגימים את ייצור של השלב בעלות נמוכה קריוגני שתוכנן מיקרוסקופים האור המוחזר ביותר. שלב זה במעבדה בנוי קריוגני מאפשרת הדמיה המצטרף יעיל ואמין בין cryo-אור cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית.

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

השילוב של מיקרוסקופיית אור קריוגנית (cryo-LM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM) מביא עימו מספר יתרונות להבנת הדינמיקה התאית...

שלום, אני דייוויד קרלסון, סטודנט לתואר מתקדמים במעבדה של ג'יימס אוונס בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. בסרטון זה, אראה לכם כיצד להקים במה קריו-אופטית פשוטה ואפקטיבית עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים ומיקרוסקופיית אור קריוגנית משולבת (correlative cryo light electron microscopy). במת קריו מורכבת מלוח צפייה שקוף, פתח עבור עדשות העדשה, דופנית חנקן נוזלי, גוף קירור לצפייה בדגימה ומעמד להעברת דגימות.מרבית החומרים שנעשה בהם שימוש נרכשו בחנות חומרי בניין ומכולת מקומית. הם כוללים תבנית פאי בקוטר תשעה אינץ', תבנית עוגה בקוטר תשעה אינץ', ארבעה זוגות של מקלות אכילה (chopsticks), קצף התרחבות למילוי, בלוק אלומיניום במידות 4 cm על 8 cm על 1 cm עם חורי קידוח להרכבת ברגים מס' 10, חמישה ברגי ראש שטוח עם חריץ וסומליות מס' 10 באורך 3/4 אינץ', שלושה ברגים עגולים עם חריץ וסומליות מס' 4 באורך 3/8 אינץ', 15 דיסקיות מס' 10, שני לוחות כתיבה (clipboards) מפלסטיק שקוף, מים, ומחזיק לקופסת רשתות cryo EM ומוט טיפול, אותם ניתן לרכוש מחברת Ted Pella.הניחו את צלחת הפאי על בסיס המיקרוסקופ מתחת לעדשות האובייקטיב. הניחו את גוש האלומיניום ליד קצה הצלחת ובצעו פוקוס על פני השטח של האלומיניום. ודאו שעדשות האובייקטיב יכולות לנוע בחופשיות פנימה והחוצה מעל שולי צלחת הפאי.אם לא, מקם מחדש את בלוק האלומיניום ובדוק שוב. לאחר קביעת מיקומו של בלוק האלומיניום, סמן את מיקום ברגי הקיבוע בעזרת טוש. מקם את קופסת רשמי הקריו (cryo grid box) לצד בלוק האלומיניום וסמן בטוש את מיקום החריץ וכל צד של קופסת רשמי הקריו, כאשר סידור הברגים רשום על פני השטח של צלחת הפטרי.השתמשו בבורג חד ובפטיש כדי ליצור חורי התחלה בכל אחת מהנקודות המסומנות באמצעות מקדחים מספר 17. קדחו את החורים להרכבת בלוק האלומיניום. השחיזו את קצוות כל חור כדי להחליק אותם.בשלב הבא, השתמשו במקדח מספר 35 כדי לקדוח ולעגל את החורים להרכבת תיבת רשת הקריו, צלחת הפאי. לאחר ההכנה והקידוח, הכניסו ברגי חריץ עם ראש שטוח מספר 10 בגודל שלושה רבע אינץ' לחורים שבבלוק האלומיניום, והניחו שתי שייבות SAE מספר 10 מעל כל חלק של בלוק האלומיניום.חורי קיבוע על צלחת הפאי. בשלב הבא, קבעו את הבלוק באמצעות האצבעות כדי להתחיל את הברגת כל בורג, והדקו אותם באמצעות מקדחה. הפכו את צלחת הפאי, הניחו דיסקיit (שייבה) מספר 10 על כל בורג ואבטחו אותם בעזרת אום.השתמש במפתח ברגים כדי לוודא שכל האומים מהודקים היטב. לאחר מכן, מחלקו האחורי של תבנית הפאי, הכנס ברגי ראש עגול עם חריץ, מספר 4, דרך חורי העיגון של קופסת רשת הקריו והדק אותם באמצעות אום מחלקה העליונה של תבנית הפאי.לאחר השלמת החלק העליון של במת הקריו, נדגים כיצד להעביר את קופסת רשתות הקריו ללא השימוש בלוח הכתיבה מפלסטיק ובחנקן נוזלי. כעת, נתחיל בהכנת תבנית הספוג המבודד. התחילו בהדבקת מקלוני האכילה בזוגות.לאחר מכן, הדביקו באמצעות סרט דביק כל צרור מקלות אכילה לדופן תבנית העוגה, כך שיהיו ממוקמים זה מול זה. מטרת מקלות האכילה היא להבטיח עובי אחיד של בידוד הספוג. בשלב הבא, הרטיבו במים את תבנית העוגה ואת פני השטח התחתונים של תבנית הפאי.התחילו בהוספה של שכבה אחת של קצף פוליאוריטן (great stuff). רססו את הקצף על פני כל תחתית התבנית ורססו במים. הוסיפו שכבה שנייה של קצף פוליאוריטן ורססו במים.לחצו את תבנית הפאי באופן אחיד וחזק לתוך תבנית העוגה. הפכו את התבניות המשולבות והניחו משקולת כבדה מעליהן. הניחו לקצף להתקשות למשך הלילה.לאחר שהקצף התקשה, השתמשו בסכין משוננת כדי לחתוך את הצלחת ולהוציאה, והסירו את עודפי הקצף מדפנות הצלחת. הוציאו את מקלי האכילה המשמשים כמרווחים והפרידו את צלחת הפאי מתבנית העוגה. הקצף אמור להישאר מודבק לצלחת הפאי.בשלב הבא, הניחו את במת הקריו (cryo stage) תחת עדשת העדשה והניחו מעליה לוח כתיבה מפלסטיק. בעזרת מרקר, שרטטו את נתיב תנועתן של עדשות העדשה בעת תנועתן פנימה והחוצה. סמנו X במרחק מהחצי עיגול, קרוב לקצה של צלחת הפאי.בעזרת לוח הכתיבה השני, סמנו את מיקום תושבת קופסת רשת ההמון. חוררו את הפתח עבור קופסת רשת ההמון באמצעות מקדח כוס בקוטר שלושה רבע אינץ', והדביקו את לוח הכתיבה השני. חוררו את ה-X באמצעות מקדח כוס בקוטר שלושה רבע אינץ'.הסר את האזור החצי-מעגלי על ידי ביצוע מספר חיתוכים באמצעות מקדח כוס בקוטר שלושה אינץ' ומקדחה שולחנית; כעת תהליך הייצור הושלם. החומרים הדרושים להכנת הדגימות כוללים קופסת רשתות קריו (cryo grid box) ומוט טיפול, פינצטה, בלוק העברה לקופסת רשתות קריו, מגבון ניגוב לכימיה (chem wipe), כוס קירור, כוס אתאן נוזלי, רשתות פחמן EM מסוג 400 mesh R2/1 holy, קופסת קלקר ומקפיא צלילה פנאומטי (pneumatic plunge freezer). קרר באמצעות חנקן נוזלי את קופסת הקלקר, קופסת רשתות הקריו, בלוק ההעברה, כוס הקירור וכוס האתאן הנוזלי.בשלב הבא, מקמו את קופסת רשתות הקריו (cryo grid box) בתוך בלוק ההעברה של קופסת רשתות הקריו. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את רשת ה-EM כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה. טפטפו שני מיקרוליטרים של תרחיף תאים בריכוז של 2×10⁶ תאים למיליליטר על החלק העליון של הרשת.הרכיבו את הפינצטה על הבוכנה הפנאומטית ושאבו את הנוזל מפני השטח של הרשת על ידי הצמדת פיסת נייר ניגוב כימי (chem wipe) קרוע לגב רשת ה-EM, ולאחר מכן טבלו אותה במהירות לתוך תמיחת אתאן נוזלי. העבירו במהירות את הרשת מהאתאן הנוזלי לתוך חנקן נוזלי והניחו אותה בקופסת רשתות קריו. כדי להשתמש בבמה הקריוגנית, התחילו במילוי הצלחת בחנקן נוזלי וכסו אותה עם לוח כסוי (clipboard).לאחר העברת קופסת רשמיות הקריו דרך החריץ בלוח הפלסטיק, הוצא רשמית אחת מהקופסה והנח אותה על משטח הצפייה של בלוק האלומיניום. לאחר הזזת במת הקריו למיקומה במיקרוסקופ, הנח את לוח הפלסטיק השני מעל הראשון והחלק בזהירות את לוח הפלסטיק הראשון החוצה.הכנס את העדשות האובייקטיביות והשתמש במיקרוסקופ כרגיל. התחל בסריקה ובהגדלה נמוכה כדי לאתר את מרכז הגריד המסומן על ידי שלושה לשוניות מתכת. בנקודה זו, בצע פוקוס בהגדלה של 50 x.ניתן לראות שכבה דקה של קרח זכוכיתי המכסה את הרשת משתנה לפלואורסצנציה. ניתן לראות את סמן ההיסטון CFP הממוקם בגרעין התא. כעת אני מחליף את העדשות לעדשת 100 x ומתמקד בתאי שמרים בודדים.כדי להסיר את במת הקירור (cryo stage) מהמיקרוסקופ, הניחו את לוח התמיכה הראשון מעל השני והחליקו בזהירות את לוח התמיכה התחתון החוצה. הסירו את במת הקירור מהמיקרוסקופ והחזירו את הרשת אל קופסת רשתות הקירור (cryo grid box) באמצעות החריץ שבלוח התמיכה. לבסוף, הברגו את מוט האחיזה של קופסת רשתות הקירור אל הקופסה והעבירו אותה לחנקן נוזלי לשמירה לצפייה במועד מאוחר יותר.ביציבות של במה במיקרוסקופיה אלקטרונית היא בעלת חשיבות רבה. במיקרוסקופיה, מצאנו שמרבית חוסר היציבות של התמונה במערכת שלנו נובעת מהמשקל הנוסף של במת הקריו על במת המיקרוסקופ. בהיעדר חנקן נוזלי, ניתן להבחין בחוסר יציבות ניכר כאשר מתמקדים בבלוק האלומיניום.על ידי הוספת תמיכה לחלקו הקדמי של בסיס המיקרוסקופ, חוסר היציבות מופחת באופן משמעותי. כאן אני מציג מבנה תמיכה המורכב ממנגנון בורג מתכוונן, אותו אני מציב בין בסיס המיקרוסקופ לבין המעמד שלו. התועלת של התמיכה הנוספת נראית גם במיקרוסקופיית אור קריוגנית, המראה כי חוסר היציבות נובע מהמשקל הנוסף ולא מבועות של חנקן נוזלי.כפי שניתן לראות, במת תאורה קריוגנית זו היא דרך זולה ומועילה לאסוף מידע פלואורסצנטי של תאים קפואים ומוהדרים. סריקה בשדה בהיר (brightfield) ובשדה חשוך (darkfield) מאפשרת למיפוי אזורים של קרח אחיד. ברגע שנסמנה את האזורים המעניינים הללו, נוכל להשתמש בערוץ הפלואורסצנציה כדי לראות את הפלואורופור המסמן חלבונים רלוונטיים, ובמקרה זה, סמן CFP histone.לאחר לכידת התמונות בבדיקת פלואורסצנציה בקריו, ניתן להשתמש בתמונות בהגדלה נמוכה כדי למפות ולאתר את אותה רשת ואותו ריבוע, ולדגום את אותם התאים במיקרוסקופיית אלקטרונים בקריו (cryo-electron microscopy). כפי שניתן לראות, תחנת תאורת קריו זו היא דרך שימושית וזולה להשגת תמונות פלואורסצנציה של דגימות מימן קפואות. ניתן לצפות באותו אזור גם ב-cryo EM באמצעות שימוש בטכניקות סטנדרטיות להעברה ודימות ב-cryo EM.במקרה זה, נתוני המיקרוסקופיה האורית בקריו משמשים כמפת ייחוס לזיהוי האזור המדויק למחקר קורלטיבי. שלב זה יכול להיות מיושם בדימות קורלטיבי של סוגים רבים של דגימות, כולל תאים שלמים בתגובות in vitro של קומפלקסים מקרו-מולקולריים או אברונים מבודדים וחתכים דקים של רקמה בקריו. תודה שצפיתם, ואני מקווה שתמצאו את שלב המיקרוסקופיה האורית בקריו שימושי כפי שאנו מוצאים אותו.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של &lt;1 מיקרומטר × &lt;1 מיקרומטר × &lt;3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100...

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

כאן, אנו מייצרים מבני מיקרו/ננו פולימריים תלת מימדיים שבהם ניתן להנדס הן את הצורה והן את היישור המולקולרי בדיוק בקנה מידה ננומטרי על ידי שימוש בכתיבה ישירה בלייזר. ניתן לשלוט בעיוות המושרה על ידי אור של מספר סוגים של מיקרו-מבנים של אלסטומר גבישי נוזלי בקנה מידה מיקרוסקופי.

מתנעים אור בצורה חופשית - ייצור ובקרה של Actuation ב בקנה מידה מיקרוסקופי

שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

פרוטוקול זה מדגים כיצד לדמיין דגימות ביולוגיות שנשמרו על ידי קריו באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית קריו. אנו מדגימים את המתודולוגיה על ידי הדמיית הציטוסקלטון של תאי U2OS.

איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

הפרוטוקול מתאר יצירת כדוריות בתפוקה גבוהה להדפסה ביולוגית באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של החמצון שלהם ומוות התאים שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. ניתן ליישם גישה זו כדי לשלוט בכדאיות הספרואידים ולבצע סטנדרטיזציה, החשובה במידול רקמה תלת-ממדית, מיקרו-סביבה של הגידול וביו-פבריקציה מוצלחת (מיקרו)של רקמות.

מיקרופריקציה ביולוגית בסיוע מיקרוסקופיית חמצן במחיר סביר של ספרואידים רב-תאיים

מסגרת הדמיה היפרספקטרלית מהירה ורב-מודאלית פותחה כדי לקבל תמונות בפס רחב של יצירת סכום תדר רטט (VSFG), יחד עם שיטות הדמיה של שדה בהיר, דור הרמוני שני (SHG). בשל היותו של תדר האינפרא אדום מהדהד עם תנודות מולקולריות, מתגלה ידע מבני מיקרוסקופי ומורפולוגיה מזוסקופית על דגימות המותרות לסימטריה.

הדמיה כימית היפרספקטרלית מולטימודאלית לא ליניארית באמצעות מיקרוסקופ יצירת סכום תדר רטט בסריקת קווים

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל מטרה אחת ויריעות אור ואת השימוש בו להדמיית רשתות שלד.

תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

למדו לבנות במה קריוגנית בעלות נמוכה לצילום קורלטיבי בין מיקרוסקופיית אור לקריוגנית ואלקטרונית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לתעד תאים קפואים במחיר סביר ולשמר את מבנה הדגימות.

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים