Name: המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: למדו לייצר חיישני DNA אלקטרוכימיים ללא חומרי תגובה לזיהוי חומצות גרעין, חלבונים ומולקולות קטנות במטריצות ביולוגיות מורכבות כמו דם וסרום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק (OPP1015402) של ביל ומלינדה גייטס באמצעות יוזמת חקירות אתגרים גרנד, ועל ידי ה-NIH באמצעות מענקים GM062958-01 ו 2R01EB002046. עבודה זו בוצעה כחלק בחסות מחלקת האנרגיה של ארה&quot;ב על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344.

1. קביעת שלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכש את ה-DNA רלוונטיים, בדיקה שינוי כימי של חברת סינתזה אישית oligonucleotide כגון Biosearch טכנולוגיות (Novato, CA) או מידלנד מוסמך (מידלנד, טקסס). החללית הוא שונה במהלך הסינתזה על ידי תוספת של תיאול C6 בסוף 3'-שלה כחול חמזור פעילה מתילן בסוף 5'-שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את ה-DNA בדיקה שנאגרו פוספט pH 7.4 כדי מלוחים בריכוז של 200 מיקרומטר ולאמת שלו על ידי מדידת ריכוז ספיגת שלה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. בשל מחצית מתילן כחול על החללית DNA הפתרון צריך גוון כחול גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין טרי 1 מ"ל של תמיסה של 10 mM טריס (2-carboxyethyl) phosphine TCEP במים מזוקקים deionized (DI-מים). מניסיוננו, פתרונות אלה TCEP יישארו טריים למשך שבוע כאשר מאוחסנים בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את כל איגרות החוב דיסולפיד שעשוי להיות נוכח פתרון ה-DNA בדיקה, לשלב 1 μL של פתרון ה-DNA בדיקה מניות עם μL 2 של הפתרון TCEP ומערבבים בעדינות עם טפטפת. דגירה את התערובת למשך שעה אחת במיכל, כהה בקירור. הפתרון כחול בתחילה צריך להיות ברור כמו TCEP הפיך מפחית את מתילן כחול. אם הפתרון אינו ברור, לחזור על התהליך באמצעות פתרון TCEP טריים או, אולי, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה לדלל את ה-DNA מופחת בדיקה עם פתרון מ"ל 1 של חיץ, זה יהיה לדלל אותו ריכוז של 200nM. בהמשך, תוכלו דגירה קבוצה של אלקטרודות דיסק זהב 200 חלקים μL של פתרון זה בדיקה מדולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין לפחות 2 מ"ל של 2mm mercaptohexanol ב פוספט שנאגרו מלוחים. </li></ol> 2. חיישן הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים אבקת 0.05 מיקרון אלומינה עם מים על בד ליטוש עדין. פולין קבוצה של אלקטרודות זהב דיסק (CH מכשירים, אוסטין, טקסס) על ידי לחיצה על משטח זהב בחוזקה לתוך הבד רטוב, ומרגש אותם הספרה שמונה דפוס כשלוש דקות לכל אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את האלקטרודות מלוטש עם DI-מים לטבול אותם לתוך צינורות Eppendorf מלאים זהה. Sonicate במשך חמש דקות כדי להסיר כל אבקת אלומינה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האלקטרודות לתוך פתרון 0.5 חומצה גופרתית M, לצרף אותם potentiostat יחד עם מונה פלטינה וכסף / אלקטרודה כסף התייחסות כלוריד, ולהפעיל סדרה של voltammograms לחמצן, להקטין את electrochemically נקי השטח שלהם. בעקבות זאת לבצע ניקוי second אלקטרוכימיים בתמיסה של 0.01 M KCl חומצה גופרתית M 0.1. הפרטים קנס של הליכים אלה ניקוי ניתן למצוא במאמר שלנו הטבע הפרוטוקולים 1, וכן להשלים את הווידאו הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר סט של 2 צינורות מ"ל Eppendorf במעמד ולמלא כל אחד עם 200 μL של פתרון ה-DNA בדיקה. ריכוז ה-DNA בדיקה בפתרון זה יגדיר את הצפיפות שבה DNAs בדיקה לארוז על משטח החיישן. ביצועי חיישן תלויה מאוד על צפיפות בדיקה, עם צפיפות האופטימלי משתנה מארכיטקטורה one חיישן הבא. ריכוז החללית בשימוש בשלב זה צריך אפוא להיות מותאם לכל סוג חדש של חיישן 2. עבור ארכיטקטורות בדיקה לנו נחקר עד כה, ה-DNA ריכוזי בדיקה אנו מעסיקים בטווח זה צעד מן nM 15-2 מיקרומטר, עם 200 ננומטר להיות ערך טיפוסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את האלקטרודות דיסק זהב עם DI-מים, ואז לטבול אותם הפתרון DNA רלוונטיים בדיקה בצינור Eppendorf במשך שעה אחת. בשלב זה, את ה-DNA בדיקה יצרף פני האלקטרודה זהב דרך היווצרות של monolayer תיאול-on-זהב עצמית התאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים את האלקטרודות-DI, לטבול אותם 2mm mercaptohexanol בצינור Eppendorf ולאחסן אותם במקום חשוך למשך 3 שעות הלילה בטמפרטורת החדר כדי להבטיח היווצרות מלאה של monolayer התאספו עצמית. שלב זה כולל את mercaptohexanol כחלק monolayer מעורבת כדי להבטיח את היווצרות monolayer יציב. כדי למנוע אידוי מומלץ לאטום את האלקטרודה לתוך הצינור Eppendorf עם parafilm. חיישנים ניתן לאחסן את הפתרון הזה במשך כמה ימים אם יש צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להשתמש בחיישן, לשטוף אותו עם DI-מים ואז להשרות אותו חיץ לפחות עשר דקות. חיישנים שמטרתן זיהוי הנוגדן חייב גם להיות שקוע בפתרון של 100 ננומטר של גדיל את ההכרה הרלוונטיים לפני השימוש, ואחריו מהיר מאוד לשטוף עם חיץ. </li></ol> 3. בדיקת חיישן לזיהוי DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפרוטוקול זה, גדיל 17 בדיקה נוקלאוטיד מודבקת אלקטרודות זהב. יש כתב כחול מתילן חמזור בסוף 3'שלה (איור 1). כאשר מולקולה בדיקה מכליא עם גדיל ללכוד, הנוכחי דרך המעגל חיישן פוחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיישן טרי עם DI-מים לטבול אותו ריקמדגם חסר היעד על מנת להקליט את אות הרקע שהיא מייצרת. חבר את חיישן להוביל את האלקטרודה העבודה של potentiostat. המקום מונה פלטינה אלקטרודה כסף / כסף כלורי הפניה אלקטרודה לתוך התמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדידה גל ריבועי בין 0 ל -0.6 V עם אמפליטודה של mV 25 וגודל הצעד של 1mV. תדירות אופטימלית גל מרובע יהיה תלוי בפרטים של ארכיטקטורת בדיקה 2,3; עבור ארכיטקטורות בדיקה השתמשנו בערכים אופטימליים הם בדרך כלל בטווח של 60 עד 600 הרץ. אתה צריך לראות לשיא מעוגלות בכ -0.35 V, פוטנציאל חיזור כחול מתילן (פוטנציאל שיא עשויים להשתנות מעט בהתאם pH המדויק של פתרון המבחן שלך). גובה מתחילת המחקר הנוכחי לשיא זו היא מידתית להעביר את יעילות אלקטרון בין הכחול מתילן ואת האלקטרודה זהב (Figure2). שמור המדידה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את האלקטרודות לפתרון המכיל את מולקולת ה-DNA היעד של עניין, לאזן (5 עד 120 דקות בהתאם למבנה גודל, ריכוז target4, 5) וכן לאסוף voltammagram הגל השני מרובע. גובה השיא ב -0.35 V ישתנה מן המדידה, הרקע הראשוני. גודל השינוי הזה קשור ריכוז אנליטי. זה נתוני התפוקה העיקרית של חיישן זה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת שינוי אות יחסית, הירידה באחוז או הגדלת האות ביחס לשיא את הרקע, היא לעיתים קרובות יותר לשחזור מדידת שינוי מוחלט הנוכחית, כמו זו מתקנת עבור וריאציות באזור את פני השטח של האלקטרודה. כדי לעשות זאת, ההבדל בין זרם שיא השיא הנוכחי רקע מחולקים על ידי שיא הרקע הנוכחי. </li></ol> 4. חיישן התחדשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידות שלך מלא, הזז את החיישן לתוך מיכל מלא במים DI-30 עבור s, או להשפריץ את זה עם זרם קבוע של מים DI-30 s. חזור על פעולה זו עוד פעמיים עם מים deionized טריים. הערה: analytes כמה הם עמידים בפני גישה זו; להם לנסות אגרסיבי שטיפה ב hydrochloride 6 guanidine M או אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את חיישן בחזרה פתרון שבו יבוצעו מדידות. תוך דקה, את גובה שיא צריך לחזור לערכו המקורי. ראוי לציין כי חיישנים אלה מפגינים לעתים קרובות שינוי אות מעט גדול יותר במהלך המבחן הראשון שלהם מחזור התחדשות, והתוצאות עקביות מאוד במהלך המחזורים שלאחר מכן 6. </li></ol> 5. בדיקת חיישן לזיהוי נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפרוטוקול זה, בדיקה DNA מתילן כחול ו-תיאול שונה בשימוש חיישנים אלה משמש גדיל "עוגן" 7. היא מחוברת ישירות האלקטרודה זהב. זו הכלאה ואז עם השנייה, גדיל הדנ"א "הכרה" כי כבר מצומדות קוולנטית אל האנטיגן הרלוונטי (איור 4). היו לנו מזל עם בתים סינתזה מסחריים, כגון Biosearch טכנולוגיות Panagene, לסינתזה של DNA-אנטיגן מפלצות הצורך. צעד הכלאה מתבצעת על ידי העברת חיישן מראש מפוברק לתוך צינור Eppendorf המכיל 100 ננומטר של גדיל הדנ"א הרלוונטי הכרה PBS שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיישן בפתרון ריק הרלוונטיים. צרף את זה כדי להוביל את האלקטרודה העבודה של potentiostat ובמקום מונה פלטינה אלקטרודה וכסף / אלקטרודה כסף התייחסות כלוריד לתוך התמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע voltammetry גל ריבועי כמתואר לעיל. עבור ארכיטקטורת בדיקה מסוימת השתמשנו כאן את התדר האופטימלי גל מרובע הוא 60 הרץ. אתה צריך לראות לשיא מעוגלות סביב -0.35 V. שמור המדידה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את האלקטרודות לפתרון אנליטי המכיל את היעד, דגירה של 5 דקות עד 60, וכן לאסוף voltammagram הגל השני מרובע. אם היעד הוא נוגדן להציג את השיא ב -0.35 V תפחת. גודל השינוי הזה קשור ריכוז נוגדן. </li></ol> 6. בדיקת חיישן לזיהוי מולקולה קטנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה זה, המולקולה החללית על פני החיישן הוא aptamer, ה-DNA או RNA מולקולה כי נבחרה במבחנה לקשור אנליטי מולקולרית ספציפית, כי השינויים במבנה שלה (קפלים) על כבילת אנליטי היעד שלה 8,9 ( איור 5). כאן אנחנו מעסיקים קוקאין מחייב, aptamer דנ"א שפותח על ידי המעבדה 10,11 Stojanovic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיישן טרי עם DI-מים לטבול אותו מדגם ריק חסר היעד על מנת להקליט את אות הרקע שהיא מייצרת. חבר את חיישן להוביל את האלקטרודה העבודה של potentiostat. המקום מונה פלטינה התייחסות כסף / כסף כלורי לתוך התמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע voltammetry גל ריבועי כמתואר לעיל. עבור ארכיטקטורת בדיקה מסוימת השתמשנו כאן את התדר האופטימלי גל מרובע הוא 200Hz (אבל 60 הרץ גם עובד). אתה צריך לראות לשיא מעוגלות סביב -0.35 V. שמור המדידה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את האלקטרודות לפתרון אנליטי המכיל את היעד, דגירה של 5 דקות ~, ולאסוף voltammagram הגל השני מרובע. גובה השיא ב -0.35 V ישתנה. גודל השינוי הזה קשור ריכוז אנליטי היעד. אם אתה לא יכול לקבל מדגם קוקאין, פרוקאין, השימוש אשר אינה מוסדרת, יכול לשמש כתחליף. </li></ol> 7. נציג תוצאות: כאשר נעשה שימוש כדי לזהות DNA באמצעות ארכיטקטורה הראשונה, האות צריך ירידה של לפחות 60% כאשר equilibrated למטרה 200 ננומטר. לאחר שלוש שטיפות קצרה במים deionized, האות צריך לחזור קרוב מאוד (בטווח% 0.1-5) לערכו המקורי. חיישנים לגילוי נוגדנים צריך לעבור ירידה אות של 40% ל -80. Aptamer מבוססי חיישנים לגילוי של קוקאין התערוכה עלייה אות של עד 200% בהתאם כיסוי תדירות פני השטח שבו הם פועלים. עבור החיישן קוקאין, כיסוי השטח נמוכה היא הטובה ביותר 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. איתור של ה-DNA עם biosensor DNA אלקטרוכימיים. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור צילום מסך המציג את האות המיוצר על ידי biosensor E-DNA במהלך voltammetry גל מרובע. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור צילום מסך המציג את האותות המיוצרים על ידי biosensor E-DNA במהלך voltammetry גל מרובע, לפני ואחרי הכלאה עם אנליטי. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. איתור של נוגדנים עם biosensor פיגום. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. איתור של קוקאין או פרוקאין עם biosensor אלקטרוכימי aptamer. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אישית אוליגו </td><td> רצף </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> לינארי בדיקה DNA (LP17) </td><td> 5'-HS-(CH2) 6 TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 " </td><td> HPLC מטוהרים, ניתן להזמין עם אס </td></tr><tr><td> אנליטי יעד DNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> ללא שינוי </td></tr><tr><td> הכרה סטרנד </td><td> 5'-Antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 " </td><td></td></tr><tr><td> הפיגום עוגן </td><td> 5'-HS-(CH 2) 6 GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB </td><td> HPLC מטוהרים, ניתן להזמין עם אס </td></tr><tr><td> A4 קוקאין aptamer </td><td> 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 " </td><td> HPLC מטוהרים, ניתן להזמין עם אס </td></tr></tbody></table> טבלה 1. בדיקה ו-DNA רצפים היעד.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

הערה חשובה היא שאף אחד הניסויים שתוארו לעיל יפעל כראוי אלא אם כן את האלקטרודות נוקו כראוי. הנה מדריך הנוהל שלנו ניקוי אלקטרוכימי. כאשר עובדים עם potentiostats CH מכשירים, גמר את השלבים לניקוי באמצעות סט של שלוש תוכניות מאקרו. שלב אפס (E-נקי O) לטבול את האלקטרודות 0.5MH 2 SO 4 ולחבר אותם אלקטרודות העבודה של potentiostat. כמו כן לצרף לטבול התייחסות Ag / AgCl ו לדלפק אלקטרודה פלטינה. התחל עם צעד חמצון (2 V עבור 5 ים) ולאחר מכן צעד הפחתה (0.35 V עבור 10 ות). שלב ראשון (E-נקי 1) ליזום חמצון סריקות הפחתה בתנאים חומציים זהה (0.5MH 2 SO 4) 0.35-1.5 V (20 סריקות בקצב סריקה של 4 V / s ו מרווח דגימה של 0.01 V, ואחריהם ארבעה סריקות בקצב סריקה של 0.1 V / s ו מרווח מדגם V 0.01). שלב שני (E-נקי 2) ניהול קבוצה נוספת של חמצון אלקטרוכימיים וסריקות הפחתה בתנאים חומציים (0.01 מ &#39;KCl/0.1 MH 2 SO 4) כיסוי four טווחי פוטנציאל שונים (ביצע כל בקצב סריקה של 0.1 V s 1 ו מרווח דגימה של 0.01 V עבור 10 מקטעים ): (i) טווח הפוטנציאל בין 0.2 ל V 0.75 (ii) טווח הפוטנציאל 0.2-1.0 V (iii) טווח הפוטנציאל של 0.2 עד 1.25 V; (iv) טווח הפוטנציאל 0.2-1.5 V. סוגים רבים של אלקטרודות זהב ניתן להשתמש כדי לנהל ניסויים אלו. בנוסף אלקטרודות דיסק זהב כמו המועסקים כאן, יש לנו הצלחה עם משטחים זהב microfabricated, חוטי זהב, זהב על מעגלים מודפסים. יחד עם חיישנים המתואר במאמר זה, רבים אחרים biosensor אלקטרוכימיים ארכיטקטורות DNA דווחו. זה כולל חיישנים עם pseudoknot 12, גדיל משולש 13, 14 כריך, כריך סופר 15, או 16 טריפלקס אדריכלות. בעתיד, אנו צופים כי חיישנים אלה ישמשו נקודת אבחון טיפול רפואי. הם השתלבו בהצלחה לתוך מכשירים microfluidic מספר 17,18, ומציעים יתרונות רבים על פני מערכות זיהוי אופטי אנליטי. בפרט, חיישנים אלה יכולים לתפקד עכור, סמיך מאוד אופטית אוטומטית פלורסנט דגימות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> דיסק אלקטרודות זהב </td><td> CH מכשירים </td><td> CHI101 </td><td> ניתן שימוש חוזר </td></tr><tr><td> דנ&quot;א סינתטי Probe </td><td> Biosearch טכנולוגיות </td><td> מנהג </td><td></td></tr><tr><td> יעד דנ&quot;א סינתטי </td><td> סיגמא Genosys </td><td> מנהג </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 725226-1G </td><td> אחסנו במקום קריר חשוך </td></tr><tr><td> פלטינום אלקטרודה </td><td> בשיא </td><td> MW-1032 </td><td> ניתן שימוש חוזר </td></tr><tr><td> Ag / AgCl הפניה </td><td> בשיא </td><td> MF-2052 </td><td> ניתן שימוש חוזר </td></tr><tr><td> ליטוש בד </td><td> החוקר </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> אלומינה פולנית </td><td> החוקר </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו הצפת מלוחים, pH 7.4 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH מכשירים 605A </td><td> CH מכשירים </td><td> 605A </td><td> השתמש בכל potentiostat </td></tr><tr><td> סרום סובך של יילוד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> N4637-500ml </td><td> Stored קפוא </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> ND-2000 </td><td> השתמש בכל UV-VIS </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Stored קפוא </td></tr><tr><td> קוקאין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C5776 </td><td> DEA רשיון חובה </td></tr><tr><td> פרוקאין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P9879 </td><td> תחליף קוקאין </td></tr><tr><td> Anti-Flag נוגדן </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

המצאה של אלקטרוכימי-dna biosensors לגילוי reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

כמו ברפואה נהוגה כיום, רופאים לשלוח דגימות למעבדה מרכזית לבדיקה ולכן צריך לחכות שעות או ימים כדי לקבל את התוצאות. חולים רבים ייטב ידי, בדיקות מהיר ליד המיטה. לשם כך במעבדה שלנו ואחרים פיתחו פלטפורמה צדדי, biosensor reagentless התומך כמותי, זיהוי reagentless, אלקטרוכימיים של חומצות גרעין (DNA, RNA), חלבונים (כולל נוגדנים) לבין מולקולות קטנות analytes ישירות בדגימות קליניות וסביבתיות לא מעובדים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההכנה והשימוש biosensors כמה זה בכיתה &quot;E-DNA&quot;. בפרט, אנו לפברק ולהפגין חיישנים לגילוי של רצף ה-DNA היעד תערובת תגובת שרשרת פולימרז, נוגדן ל-HIV ספציפיים הקוקאין הסם. הליך הכנת דורש רק שלוש שעות של הידיים על המאמץ ואחריו הדגירה לילה, והשימוש בהם מצריך רק מספר דקות.

&quot;ה-DNA&quot; חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

במסגרת העיסוק הרפואי כיום, רופאים שולחים דגימות למעבדה מרכזית לצורך בדיקה, ובכך נאלגים להמתין שעות או ימים עד לקבלת התוצאות. ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכין ולהשתמש בחיישני DNA אלקטרוכימיים. דבר זה מושג תחילה על ידי רדוקציה של ה-DNA הפרוב (probe DNA), ולאחר מכן ניקוי של אלקטרודות הזהב שעליהן נבנים החיישנים. השלב הבא בפרוצדורה הוא שיקום של שכבה מונית עצמית (self-assembled monolayer) של תיול על זהב המכילה את ה-DNA הפרוב, על אלקטרודות הזהב.לאחר מכן, פני השטח של אלקטרודת הזהב ממולאים שוב במרקפטואתנול. כדי להבטיח יצירה של שכבה אחת שלמה ומובנית היטב, השלב הסופי של הפרוטוקול הוא שימוש בחיישנים ובדגימות כגון בופר, שתן, סרום או דם. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את ריכוזי האנליט באמצעות שינויים בזרם השיא של וולט גל ריבועי או זרם חילופין.לטכניקה זו השלכות רחבות בתחום האבחון המולקולרי, מכיוון שחיישנים אלו יכולים לזהות סממנים ביולוגיים ומולקולות תרופות רבות ושונות ישירות בשתן או בסרום. מר אהרון רו (Aaron Rowe), סטודנט לתואר מתקדמים בקבוצת המחקר שלי, ידגים את הפרוצדורה. הוא יסייע על ידי שני עמיתי פוסט-דוקטורט העובדים איתנו, ד"ר ריאן וייט (Ryan White) וד"ר אנדרו בונהאם (Andrew Bonham).כדי להתחיל, רכשו את הגשש (probe) הרלוונטי, DNA מחברה לסנתזה מותאמת אישית של אוליגנוקלאוטידים; הגשש עובר מודיפיקציה במהלך הסנתזה על ידי הוספת תיול בעל שש פחמנים בקצה ה-5' שלו ומתילן כחול (methylene blue) פעיל חמצונית בקצה ה-3' שלו. המיסו את ה-DNA של הגשש כדי לקבל תמיסה בעלת גוון כחול נראה הנובע מקבוצת המתילן כחול. אמתו את ריכוזו על ידי מדידת הבליעה ב-260 nanometers באמצעות ספקטרופוטומטר. הפחיתו קשרי דיסולפיד שעשויים להיות נוכחים בתמיסת ה-DNA של הגשש. ערבבו 1 µL של תמיסת המלאי של ה-DNA של הגשש עם 2 µL של תמיסת TEP שהוכנה טרייה.ערבבב בעדינות את התמיסה שהתקבלה באמצעות פיפט. דגרי את התערובת למשך שעה אחת במיכל קירור חשוך. במהלך הדגירה, התמיסה הכחולה אמורה להפוך לשקופה ככל שה-TEP מחזר באופן הפיך את ה-methylene blue.בשלב הבא, יש לדלל את תמיסת הגשש של ה-DNA המרודה באמצעות בופר PBS לריכוז הרצוי, שבדרך כלל נע בין 25 ל-1000. הכנת החיישן המולרי מתחילה בשילוב של אבקת Illumina בגודל 0.05 מיקרון עם מים על מטלית פוליש עדינה. השתמש במטלית זו כדי ללטש סט של אלקטרודות דיסק מזהב על ידי לחיצה חזקה של פני השטח של הזהב אל תוך המטלית הרטובה והזזתם בתבנית של הספרה שמונה למשך כ-שלוש דקות לכל אלקטרודה.שטפו את האלקטרודות המלוטשות במים דה-יוניים לאחר השטיפה. טבלו אותן בנבובות EOR המלאות במים דה-יוניים. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לאלקטרודות למשך חמש דקות כדי להסיר שאריות של אבקת Illumina.לאחר הסוניקציה, הכניסו את האלקטרודות לתוך תמיסה של חומצה גופרתית בריכוז 0.5 molar. לאחר מכן, הכניסו לתמיסה אלקטרודת נגד של פלטינה ואלקטרודת ייחוס של כסף/כסוף כלוריד וחברו אותן לפוטנציוסטט. לאחר מכן, בצעו סדרה של וולטמטריות ציקליות כדי לנקות אלקטרוכימית את פני השטח של האלקטרודות.פירוט הנהלים הללו כלול בתוספת הכתובה לסרטון זה ובמאמר ב-nature protocols שפורסם בעבר על ידי קבוצה זו. לאחר מכן, בצע ניקוי אלקטרוכימי שני בתמיסה של KCL בחומצה גופרית בהתאם לנוהל שתואר בעבר. לאחר מכן, סדר סט של מבחנות einor בנפח שני מיליליטר בתוך רैक ומלא כל אחת ב-200 µL של תמיסת ה-probe DNA.ריכוז הגשושית, ה-DNA בתמיסה זו, יקבע את הצפיפות שבה ה-DNA של הגשושית ייארז על פני השטח של החיישן, ויש לבצע עבורו אופטימיזציה עבור כל סוג חדש של חיישן. שטפו את אלקטרודות דיסקות הזהב במים דה-יוניים. לאחר מכן, טבלו אותן בתמיסת ה-DNA של הגשושית המתאימה בתוך מבחנה מסוג einor למשך שעה אחת.בשלב זה, ה-DNA של הגשש ייקשר לפני השטח של אלקטרודת הזהב באמצעות יצירת שכבה עצמית מאורגנת (self-assembled monolayer) של תיול על זהב. לאחר שטיפה חוזרת של האלקטרודות במים דה-יוניים, טבול אותן במרקפטואנול בריכוז 2 mM בתוך מבחנת איינור (einor tube). פעולה זו ממלאת את הרווחים הפנויים על פני השטח ומבטיחה שכבה עצמית מאורגנת מלאה ויציבה.כדי למנוע התאיידות, אטמו את האלקטרודות בתוך צינור ה-einor באמצעות פאראפילם. אחסנו את האלקטרודות הטבולות במקום חשוך בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות ועד ללילה, כדי להבטיח יצירה מלאה של השכבה המונחית בעצמה (self-assembled monolayer). כדי להכין את החיישן לשימוש לאחר האינקובציה, שטפו את החיישן במים דאיוניים ולאחר מכן השרו אותו בבופר למשך 10 דקות לפחות.גילוי DNA באמצעות חיישנים מודגם באמצעות גדיל גשש בן 17 נוקלאוטידים המחובר לאלקטרודת זהב באמצעות תיול בקצה ה-5', הגשש מכיל רכיב דיווח חמצון-חיזור של מethylene blue בקצה ה-3'. כאשר מולקולת הגשש עוברת היברידיזציה עם גדיל לכידה, הזרם האלקטרוכימי הנוצר על ידי החיישן פוחת. לתחילת העבודה, שטפו חיישן חדש במים דה-יוניים וטבלו אותו בדגימה ריקה.על מנת להקליט את אות הרקע, יש לבצע מדידת גל ריבועי מאפס ועד ל-0.6- וולט עם אמפליטודה של 25 מילי-וולט ומתח שלב של מילי-וולט אחד. תדר הגל הריבועי האופטימלי יהיה תלוי בפרטי מבנה הפרובה. פיסגה מעוגלת צריכה להופיע בערך ב-0.25- וולט, פוטנציאל החימצון-חיזור של methylene blue.גובה זרם הבסיס עד לשיא זה פרופורציונלי ליעילות העברת האלקטרונים בין המethylene blue לבין אלקטרודת הזהב. שמור את מדידת הרקע זו. לאחר מכן, העבר את האלקטרודות לתמיסה המכילה את מולקולת ה-DNA של מטרה המבוקשת והמתן עד להשגת שיווי משקל.לחלופין, ניתן להוסיף DNA מטרה לתמיסה שבה טבולים החיישנים. בצע מדידה שנייה של וולטמטריה בגלי ריבוע (square wave voltammetry). גובה השיא ב-0.25- וולט ישתנה בהשוואה למדידת הרקע הראשונית.עוצמתו של שינוי זה קשורה לריכוז של האנליט. זהו נתון הפלט העיקרי של החיישן. לאחר המדידה, חשבו את השינוי היחסי באות.אחוז זה הוא לרוב הדיר יותר מאשר מדידה של השינוי המוחלט בזרם, שכן הוא מתקן את השונות בשטח הפנים בין אלקטרודה לאלקטרודה. לאחר השלמת הפרוצדורה, ניתן לחדש את החיישן כפי שמתואר בנוהל הכתוב הנלווה לזיהוי נוגדנים. בשימוש בחיישנים, DNA המשונה במתילן כחול ובתיול משמש כחוט עיגון ומוצמד ישירות לאלקטרודת הזהב.לאחר מכן מבצעים היברידיזציה עם גדיל DNA זיהוי שני, אשר קושר באופן קוולנטי לאנטיגן הרלוונטי. לאחר מכן מוסיפים דגירה עם נוגדן מטרה ספציפי. בצע את שלב ההיברידיזציה על ידי העברת חיישן שהוכן מראש לשפופרת einor המכילה 100 nano molar של גדיל הזיהוי הרלוונטי.דגרו את החיישן עם גדיל DNA ב-PBS למשך שעה אחת. לאחר מכן, טבלו את החיישן בבופר PBS כדי להסיר פרובים שאינם היברידיים לפני ההעברה לתמיסת הבלנק. לאחר מכן, הניחו את החיישן בתמיסת הבלנק המתאימה והכניסו לתמיסה אלקטרודת נגד מפלטינה ואלקטרודת ייחוס של כסף/כסוף כלוריד.חברו את האלקטרודות לפוטנציוסטט. בצעו וולטמטריה של גלי ריבוע כפי שתואר קודם לכן; התדר האופטימלי של גלי הריבוע עבור ארכיטקטורת הפרובה הספציפית המשמשת בדוגמה זו הוא 60 hertz. שיא מעוגל אמור להופיע סביב 0.25- volts.שמרו מדידת רקע זו. העבירו את האלקטרודות לתמיסה המכילה את האנליט המטרה לאחר דגירה של 5 עד 60 דקות, ואספו מדידת square wave voltammetry שנייה. אם הנוגדן המטרה נוכח, השיא ב-0.25 וולט שלילי יפחת.גודל שינוי זה קשור לריכוז הנוגדנים. כדי להדגים זיהוי של מולקולות קטנות, ה-DNA של הגשש על פני השטח של החיישן הוא aptr. aptr הוא מולקולת DNA או RNA שנבחרה in vitro כדי להיקשר לאנליט מולקולרי ספציפי.ניתן לעיתים קרובות להנדס מחדש אפטמרים כדי לשנות את המבנה שלהם. בעת קישור כזה, האפטימה המשמשת כאן משנה את הקונפורמציה שלה בעת הקישור לסם הקוקאין.لتחילת התהליך, שטפו חיישן חדש במים דה-יוניים וטבלו אותו בדגימה ריקה, ללא המטרה, כדי להקליט את אות הרקע שהוא מייצר. לאחר מכן, הכניסו לתוך התמיסה אלקטרודת נגדית מפלטינה ואלקטרודת ייחוס של כסף/כסוף כלוריד. חברו את האלקטרודות לחיבורים של פוטנציוסטט, ובצעו מדידת וולטמטריית גל ריבועי או זרם חילופין.כפי שתואר קודם לכן, תדר גל הריבוע האופטימלי עבור ארכיטקטורת הפרובה הספציפית שנעשה בה שימוש כאן הוא 60 hertz. שוב, פיסגה מעוגלת צריכה להופיע סביב 0.25- volts ויש לשמור אותה כמדידת הרקע. לאחר מכן, העבירו את האלקטרודות לתמיסה המכילה את האנליט המטרה.לאחר דגירה של 32 דקות, רשמו גרף מתח שני בזרם חילופין או בגלי ריבוע. גובה השיא ב-0.25- וולט ישתנה. גודל שינוי זה קשור לריכוז של האנליט המטרה.בעת שימוש בחיישנים ביואלקטרוכימיים של DNA לזיהוי DNA עם ארכיטקטורת הפרובה המתוארת כאן, האות אמור לרדת בלפחות 60%. לאחר שיווי משקל עם מטרה בריכוז 200 nanomolar ואחרי שלושה שטיפות קצרות במים דה-יוניים, האות אמור לחזור לטווח של 0.1% עד 5% מערכו המקורי. באופן דומה, כאשר החיישנים המתוארים כאן משמשים לזיהוי נוגדנים, האות אמור לרדת בין 40% ל-80% בעת קישור של נוגדן. לעומת זאת, חיישנים המבוססים על aptamer לזיהוי קוקאין מראים עלייה באות עד ל-200% בעת קישור של מולקולות קטנות.גודלו של שינוי זה תלוי בתדר הבדיקה האלקטרוכימית ובכיסוי הפני השטח על החיישנים. עבור חיישן הקוקאין, כיסוי פני שטח נמוך יחסית הוא המומלץ ביותר. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הייצור והשימוש בחיישנים אלו ביום אחד.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שפרמטרים כגון תדר גל ריבועי (square wave frequency), או צפיפות הגשש על פני השטח של האלקטרודה, משפיעים רבות על ביצועי החיישן. לאחר צפייה בסרטון זה, תדעו כיצד להכין חיישנים ביוכימיים אלקטרוכימיים, חיישני DNA, חיישני אפטמר וחיישני פיגום (scaffold biosensors), ותדעו כיצד להשתמש בהם למגוון רחב של מדידות בסיסיות. הסיכונים המשמעותיים היחידים בפרוטוקול זה הם השימוש בחומצה גופריתית, שהיא כמובן חומר קורוזיבי, ולכן הגנה על העיניים וכפפות הן חובה.

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

אנו מתארים את ייצור מכשיר מדידה ולפרוטוקול biosensors בתדר גבוה המבוסס על צינורות פחמן. טכניקת חישת התדירות הגבוהה מפחית את הסיכון (דביי) השפעת ההקרנה יונית הבסיסית ומאפשרת Nanotube biosensor להיות מופעל בפתרונות כוח יוניים גבוהים שבי biosensors אלקטרוני קונבנציונלי נכשלים. הטכנולוגיה שלנו מספקת פלטפורמה ייחודית לbiosensors אלקטרוני הפועלים בתנאים פיסיולוגיים רלוונטיים נקודה של הטיפול (POC).

המצאה של Biosensor Nanotube פחמן בתדירות גבוהה Nanoelectronic לחישה בפתרוני כוח יוניים גבוהים

אנו מציגים biochip אלקטרוכימיים המבוסס על microfluidic לגילוי הכלאת DNA. בעקבות functionalization הבדיקה ssDNA, הסגוליות, הרגישות, וגבול הגילוי נלמדים ביעדי ssDNA משלימים ולא משלימים. תוצאות ממחישות את השפעתם של אירועי הכלאת DNA על מערכת אלקטרוכימיים, עם גבול גילוי של 3.8 ננומטר.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

הסינתזה של מינים אסימטריים של פרוקן מאתגרת באמצעות טכניקות תמיסה.  דוח זה מתמקד בשיטות שבוצעו לייצור ביו-מצומד פרוקן-ביוטין באמצעות תגובות קלות ונקיות המושגות באמצעות סינתזה בשלב מוצק.  שילוב של חלק תיולט הוכח כמקנה את היכולת לקיבוע על משטחי זהב.

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

אנו מתארים שלבים מרכזיים לחישה ביולוגית על ידי שימוש בטרנזיסטורי אפקט שדה של ננו-חוטי פוליסיליקון, כולל הכנת המכשיר וקיבוע ואישור של בדיקה מולקולרית של DNA על פני הננו-חוטים, כמו גם תנאים לחישת DNA.

הכנת טרנזיסטור הסיליקון Nanowire שדה ותוצאה עבור יישומים כימיים biosensing

חומצות גרעין הן אנליטים נפוצים להערכת מערכות ביולוגיות; עם זאת, הטיה ממניפולציה אנזימטית עלולה לגרום לדאגה. כאן מתוארת שיטה לזיהוי ללא תווית של חומצות גרעין באמצעות פוליאנילין. טכנולוגיית חיישנים רגישה וחסכונית זו יכולה להבחין בהבדלים בין נוקלאוטידים בודדים בין מולקולות.

חיישן מבוסס-Polyaniline של חומצות גרעין

פלטפורמה ביוסנסור microfluidic תוכנן של מפוברק בטכנולוגיית photoresist הסרט יבש בעלות נמוכה עבור כימות מהיר ורגיש של analytes שונים. מערכת זו לשימוש יחיד מאפשרת מדידה אלקטרוכימי של--צ'יפ-משותק מבחני מקושרים-אנזים באמצעות הטכניקה להפסיק זרימה.

פלטפורמה מבוססת Photoresist ביוסנסור אלקטרוכימי Microfluidic הסרט יבש: ייצור המכשיר, הכנה על שבב Assay, ותפעול המערכת

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

שיטת ייצור אלקטרודות interdigitated בסדר (מרווח ורוחב: 20 מיקרומטר) בקצה של מחט תת-עורית (קוטר: 720 מיקרומטר) הוכח באמצעות תרסיס ציפוי גמיש סרט photomask בתהליך פוטוליתוגרפיה.

ייצור של אלקטרודות בסדר על הקצה של מחט Hypodermic באמצעות תרסיס Photoresist ציפוי גמיש Photomask ביו יישומים

פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

למדו לייצר חיישני DNA אלקטרוכימיים ללא חומרי תגובה לזיהוי חומצות גרעין, חלבונים ומולקולות קטנות במטריצות ביולוגיות מורכבות כמו דם וסרום.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

גלה סרטונים נוספים