Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo

אחד האתגרים בחקר ההתפתחות במדעי המוח הוא לכידת מורפולוגיות דנדריטיות ואקסונליות ברמת תא בודד in vivo. במערכת הריח, נוירונים חושי ריח מרחיבים את האקסונים שלהם מאפיתל הריח באף לפקעת הריח במוח. כאשר נוירונים חושי ריח מרובים מקרינים לעבר פקעת הריח, הם מתחברים לצרורות.

זה מסבך את המחקר של מסלולי אקסונים בודדים והמורפולוגיה הסופית שלהם. פיתחנו שיטה להמחשת נוירונים חושיים של חוש הריח היחיד in vivo על ידי הזרקת מיקרו מבנה GFP. נושא לנטי-וירוס.

התמרה מוצלחת עם lentivirus מאירה את כל אורך האקסון החושי של חוש הריח, כולל סוכת הטרמינל. בנוסף להדמיה של נוירונים חושיים של חוש הריח היחיד, שיטה זו מאפשרת לנו לתפעל את ביטוי הגנים של גן מסוים מעניין כדי לחקור את תפקודו בהקשר in vivo. הליך זה של lentivirus הוא ברמת בטיחות ביולוגית שנייה ויש לבצע אותו במכסה זרימה למינרית.

כדי לשמור על סביבה סטרילית, יש לרסס את כל מה שהוכנס למכסה המנוע עם אתנול 70% במכסה המנוע, להכין ולחמם מראש מיטת מים של 37 מעלות לפחות 20 דקות. לפני ההזרקה. אטמו שקית אחסון מפלסטיק מלאה למחצה במים והניחו אותה על חממת בלוק חימום ריקה.

זה יאפשר לעכברים להתאושש לאחר ההזרקה. מלאו מיכל פסולת ביולוגית ב-10% אקונומיקה כדי לטהר את כל החומר החשוף לנגיף. מהליך זה, הכינו צלחת פתוחה קטנה של 70% אתנול ומנה שנייה עם מים מזוקקים סטריליים.

במכסה זרימה למינרית, נשתמש במזרק המילטון בנפח חמישה מיקרוליטר עם מחט בגודל 33. דגם מסוים זה מאפשר לך להתאים את התנגדות הבוכנה על ידי סיבוב חוגת מתח הממוקמת בחלק העליון של תא הבוכנה. תכונה זו מספקת בקרת עוצמת מיקרו-הזרקה לעיקור המחט ותא המזרק.

שאפו שוב ושוב והוציאו אתנול מהמנה מספר פעמים. שטפו את מחסנית המזרק על ידי שאיבה ופליטה של מים סטריליים מספר פעמים. הנח את המזרק בבטחה בצד במכסה המנוע.

סדרו מגבוני אלכוהול ליד תחנת ההזרקה. הכן שלב הזרקה המספק משטח מוגבה שיקל על מיקום העכבר. אפשר להשתמש בצלחת תרבית הפוכה של 10 ס"מ מכוסה במגבוני קים.

גורי עכברים יכולים להיות מורדמים על ידי היפותרמיה עד גיל הגמילה. גזרו אצבע של כפפת גומי והניחו את גור העכבר בחיתוך האצבע. לאחר מכן מניחים על קרח למשך חמש דקות.

הכפפה תמנע כוויות עור שעלולות להתרחש ממגע ישיר של העור עם בדיקת הקרח להרדמה יסודית על ידי צביטה בחלק האחורי של הגור ובארבע הרגליים כדי לוודא שהחיה לא מגיבה. כעת אנו מוכנים למיקרו-הזרקה של וירוס הלנטי. אנחנו נדגים עם גור יילודים.

אם משתמשים בעכבר בגיל מבוגר יותר, יש להחליף את המחט בקוטר 33 במחט עבה יותר על מנת לחדור אל פני הגולגולת. עקר את פני האף של העכבר על ידי ניגובו עם פד אלכוהול. הסר את מלאי ה-lentivirus מאחסון המקפיא והפשיר על קרח.

ייצרנו בעצמנו לנטי-וירוס במעבדה בשיטות מבוססות. בפיתוח שיטה זו, מצאנו כי נדרש טיטר ויראלי מינימלי של 10 עד תשיעית יחידות זיהומיות למיל לקצב התמרה טוב. שאפו שני מיקרוליטרים של תמיסת מלאי lentivirus למזרק המילטון המעוקר.

הנח את גור העכבר על גבי ההזרקהtagה. אחוז בעור על גבי הראש באוזניים, ומשוך בעדינות לאחור. ציידנו את מכסה המנוע שלנו בטווח ניתוח.

על מנת לכוון במדויק את הזרקות המיקרו, חפש במשטח הגולגולת הגבי במוח הקדמי אחר מתאר של פקעת הריח. מטרות הזרקת המיקרו שלנו מקיפות מקרוב את נורת הריח, אך לא צריכות לכלול את הנורה עצמה. אנו נותנים ארבע זריקות לאפיתל הריח של כל גור.

מיקומים אלה המיוצגים בנקודות כחולות דורשים החדרת המחט בזווית מכוונת מדיאלית. שתי הזריקות הנוספות המיוצגות בנקודות ירוקות מדורגות, מדיאליות יותר וקדמיות לפקעת הריח. ניתן לכוון את הזריקות הללו בזווית.

ההצעות לזוויות המחט נעשות בהתחשב במיקום הגחון של אפיתל הריח, הממוקם ברובו מתחת לפקעת הריח. הגישה הניצבת מוגבלת אפוא. הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף כשלושה מילימטרים מתחת לפני העור.

כדי להגיע לאפיתל הריח. יד מאומנת צריכה להרגיש את הירידה בהתנגדות כאשר מגיעים לחלל הלומינלי של חלל האף. יש להימנע מאזור זה.

מיקרו מזריקים 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי וירוסים לכל עמדה. שוב, בחירת שני אתרים לכל צד, שמאל וימין, ארבע זריקות בסך הכל 0.5 מיקרוליטר. כל עכבר פירושו שני מיקרוליטרים של וירוס הדרושים לכל עכבר בסשן הזרקה יחיד.

שוב, היזהר לא להזריק את כתם נורת הריח לייבש כל שאריות תמיסת וירוס או דם שעלול לברוח ממקום ההזרקה או מפתחי הנחיריים. בעזרת מגבון אתנול, השלך מגבונים למיכל הנוזל המדולל המולבן, הנח מיד את העכבר המוזרק על חממת מיטת המים להתאוששות. טיהור מזרק מחט על ידי חזרה על הליך עיקור שבוצע במהלך ההכנה ניתן להחזיר עכברים שהוזרקו לכלוב שלהם 30 דקות לאחר ההחלמה באינקובטור מיטת המים.

ניתן לחזור על כל המיקרו-הזרקה הזו שוב תוך ארבע שעות. אם תרצו להגדיל את מספר נוירוני חוש הריח שיידבקו, ניתן לראות נוירונים חושי ריח נגועים לכל אורך התא תוך שלושה ימים בלבד. בעלי החיים הוקרבו והועברו לתצפית בנקודת הזמן הרצויה.

שימוש בשיטות סטנדרטיות על מנת לדמיין מסלולי נוירונים חושי ריח של תא יחיד וטרמיני אקסון, אנו מנתחים וחותכים את פקעת הריח בעובי של 60 מיקרון. החלק יכיל אפוא את כל שכבות התאים של פקעת הריח, כולל צרורות אקסונים של נוירונים חושי ריח, ומסופי אקסון, המסונפסים במבנים גלומרולרים הקשורים על פני הנורה כהכנה לאימונוהיסטוכימיה צפה. חלקים סדרתיים של נורת הריח מיוצרים ונסחפים באופן קולקטיבי לתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר עם חמישה מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט.

העבירו את החלקים הצפים לבקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר שהחלקים התיישבו בתחתית הבקבוקון, שואבים את המלח הפוספט. היזהר לא לשאוב אבק.

החלקים שלך מתמלאים ב-10 מיליליטר של חיץ טרי כדי לשטוף כל שאריות של חומר קיבוע או הטבעה. הכניסו מיד את המתלה הזה לבקבוקון חרוטי של 15 מיליליטר, הקפידו ללכוד את כל החלקים הצפים, לשאוב את תמיסת השטיפה ולנקב את החלקים בתמיסה של 0.3% טריטון X 100 בהנחת מלח מאגר פוספט על פלטפורמת נדנדה למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, לאחר מכן תוכל להמשיך בפרוטוקול צביעה חיסוני סטנדרטי באותו בקבוקון חרוטי, לחזור על שלבי הוואקום והנדנדה לפי הצורך עבור כלי בגודל זה, לשמור על נפח של 10 מיליליטר לשלבי צביעה ושטיפה.

להלן רשימה של נוגדנים בהם אנו משתמשים כדי להכתים נוירונים חושי ריח שעברו התמרה חיובית, ואת אוכלוסיית נוירוני חוש הריח הכללית. לחדירה יסודית של נוגדנים לקטעי נורת 60 מיקרון, מומלץ לדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. עומק הכביסה צריך להיות גם לא פחות מ-20 דקות כל אחד.

מורחים בעדינות כל חלק על שקופית זכוכית עם תושבת מכחול כל שקופית עם פלורה הר G בתוספת תמיסת כתם כרומטין. עשו מאמצים לחסל את כל הבועות ממדיום ההרכבה. הרכיב את המקטעים שלך בשורות כדי לפשט את שלב הסינון הבא.

סרוק את השכבות הללו על חלקי נורת הכתם החיסוני שלך לאיתור סיבי האקסון החיוביים של GFP וטרמיני. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן לדמות מסופי עצבים נגועים חיובית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. כדאי לכייל את מישור המוקד באזור העניין שלך באמצעות תעלות חלבון DPI וסמן ריח.

תוצאות אלה מראות סיב אקסון נוירון יחיד של חיישן ריח ומסוף אקסון בתוך הגלומרולוס, שהוא CO עם חלבון סמן ריח באדום ו-vlu 2 בגופי תאי עצב של חיישן ריח נגוע באפור והכפתור הדנדריטי שלהם ניתן לדמיין גם בתוך אפיתל הריח אם רקמה זו נכללה בשלבי החיתוך והצביעה החיסונית. היי, ההקרנה הקונפוקלית שלי מספקת לנו מורפולוגיה מפורטת מאוד של נתיב הארכה אקסונלי של נוירון חושי ריח יחיד וסוכת טרמינל. אפשר לראות את החיבור של סיב האקסון בחזרה לעבר המטרה הגלומרולרית שלו, כמו גם את הפרטים של דפוס ההסתעפות שלו בתוך הגלולה העצבית הגלומרולרית.

שיטת המיקרו-הזרקה הלנטי-ויראלית מאפשרת הדמיה של אקסון תא בודד, מורפולוגיות של נוירונים חושי ריח, ומאפשרת מחקרים המתמרנים את ביטוי הגנים, התמרת לנטי-וירוס מביאה לאינטגרציה גנומית יציבה של מבנים. Lentivirus אינו מדביק תאים שכנים באופן סינפטי. ניתן להשיג הדמיה תוך שלושה ימים בלבד ואושר כי היא נמשכת לפחות שלושה חודשים וככל הנראה נמשכת לתקופות ארוכות יותר.

נוירונים חושי ריח אינם נגועים בקלות על ידי עירוי אף של תמיסת לנטי-וירוס. לכן, נדרשת מיקרו-הזרקה דרך פני השטח בהליך זה. אז זה נוהל המיקרו-הזרקה של וירוס הלנטי שלנו.

אני מקווה שמצאת את כל המידע הזה שימושי להשגת מורפולוגיות של תא בודד של ציד שמח משלך.