Name: Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: למד טכניקת לנטיוירוס לתיווך גנטי וויזואליזציה של נוירונים סנסוריים חוש הריח בודדים in vivo. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי אקסונים ומורפולוגיות טרמינליות במערכת הריח המורכבת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי NIH DC052256 ו DC006015, ו-NSF 0324769 עד QG ו-T32 DC008072 ל BS.

1. הכנה הליך זה biosafety ברמה 2, לכן כל ההכנות הבאים עשויים במנדף Biohazard שבו נוהל microinjection מבוצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחממים 37 ° C מיטת מים: מילוי שקית אחסון מפלסטיק עם מים - חותם ולהגדיר על חימום רוקנה לחסום חממה. זה יאפשר עכברים להתאושש הזרקת הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי מיכל פסולת Biohazard עם אקונומיקה 10% בנפח מתאים לטבילה של פסולת מתוך כל התהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת לפתוח קטנה של אתנול 70% ו צלחת שנייה עם ddH2O מעוקרים מקום בארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מזרק קיבולת 5μL המילטון עם מחט 33-מד ידי ריסוס מטה את הגוף ואת המחט עם 70% אתנול עם הבוכנה שלף כל הדרך. שוב ושוב לשאוב אתנול מן הצלחת להוציא אותו ואת כל הדרך לפחות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המחסנית על ידי מזרק מים סטריליים aspirating ולהוציא לפחות 5 פעמים. המקום מזרק בבטחה בצד בשכונה תרבות ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מניות ויראלי מ -80 ° C אחסון במקפיא ומניחים על קרח על מנת לאפשר הפשרה. Microinjection דורש 2μL המניות וירוס לכל העכבר titre של 10 יחידות מדבק 9 / mL. Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצרים במעבדה לפי הפרוטוקול הוקמה (לויס et al., 2002). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשלב הזרקת המספק שטח מוגבה מעל פני השטח את מכסה המנוע - יכול להשתמש תרבות 10 ס&quot;מ צלחת מכוסה בסדין של Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר מגבונים אלכוהול ליד תחנת ההזרקה. </li></ol> 2. Microinjection של חלקיקים לתוך lentiviral אפיתל ההרחה הנהלים כל חיה שבוצעה בשיטה זו נעשים בהתאם להנחיות שאושרו IACUC. המתח מ.א.ס. מאסכאלאס C57BL/6J המודל בעלי חיים המשמשים כל הניסויים הדגימו כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הגורים העכבר על ידי היפותרמיה ידי לקיחת עכבר גור (P0-P3) מתוך הכלוב לשים את הגור על כפפה חתך פתוח על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה הגור להיות בהרדמה מלאה, 2μL לשאוב מניות נגיפי לתוך המזרק המילטון מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבי הגור בשלב ההזרקה. משוך בעדינות עור מן החלק העליון של הראש ליד האוזן לכיוון החלק העליון של הצוואר. זה אמור לספק משטח העור לימד על חלל האף וגם יקל ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף על 3mm מתחת לפני השטח של העור כדי להגיע אפיתל ההרחה. Microinject 0.5μL של פתרון וירוס לכל זריקה, בוחרים בשני אתרים לכל צד, הן על ימין ועל שמאל (ארבע זריקות בסך הכל לכל עכבר = 2μL של הנגיף הצורך). אתרי הזרקה יש כשל בנפרד אחד מהשני. עבור המיקוד של אתרי הזרקה נכונה, החיפוש פני הגולגולת הגב על קווי המתאר של הנורה חוש הריח. קו זה גלוי בקושי בלידה דרך העור שקופה למחצה לבין הגולגולת. כדי להפוך את שתי זריקות לכל צד, מטרת זריקה אחת מקורי רק להתוות נורה אחת על ציר המדיאלי. הפוך את הכניסה second לרוחב להתוות את הנורה, אך הקפד זווית זריקה מדיאלית, כך שאתה יכול להגיע אפיתל הריח שנמצא מתחת ventrally הנורה. הימנע חודר את הנורה חוש הריח! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם יבש כל פתרון וירוס שיורית או דם עלול להימלט מן הזריקה או פתחי הנחיריים באמצעות Kimwipe. מיד להיפטר Kimwipes את מיכל נוזל אקונומיקה מדוללת Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מוזרק על מיטת מים בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1-4 עבור כל העכברים להיות מוזרק, נזכר תצטרך 2μL על מניות וירוס לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו עכברים להתאושש על החממה מיטת מים במשך 30 דקות לפני החזרה להם כלוב קינון המקורי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הבמה microinjection, מגבונים sanitizing ואת כל נייר מוצרים נוספים ניקוי לרשות נוזל אקונומיקה Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק המילטון על ידי שאיפה חוזרות פליטה של ​​אתנול ואז מים כפי שנעשה בשלבים הכנה. אפשר המזרק לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת יעילות מקסימלית התמרה לחזור על הליך זה שוב 4 שעות. OSNs נגועים ניתן דמיינו בכל אורך של התא כמה כמו שלושה ימים. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה של צף סעיפים הנורה חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר מוזרק בנקודת הזמן הרצוי זלוף לתקן את הרקמה עם paraformaldehyde 4%. לנתח את OB. מדגירים את paraformaldehyde הלילה ואז סוכרוז 30% PBS לילה. שבץ בינוני הטבעה אוקטובר על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העטרה סעיפים OB מתקבלים על 60μm עובי באמצעות cryostat. טאטא סעיפים הנורה לתוך צלחת 10 ס&quot;מ תרבות עם 5 מ&quot;ל 1x PBS (pH 7.4). מדורים צריכים להיות כל הזמן צף PBS לאפשר אוקטובר עד דissolve. העברת חלקים צפים PBS לתוך בקבוקון 50 מ&quot;ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להסתפק בסעיפים לחלק התחתון של המכל. אבק את PBS בלי להתחנף כל הסעיפים. לשטוף חלקים עם רקמה PBS 20mL. חזור ליישב צעדים אבק. רקמה Resuspend עם 10 מ&quot;ל PBS וחתכים העברת צף חרוטי בקבוקון 15 מ&quot;ל עבור immunostaining. לאחר סעיפים רקמות התיישבו, האבק PBS supernatant מבלי להפריע רקמות. סעיפים Resuspend עם 0.3% טריטון X-100 ב 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx) המאפשר ניקוי כדי לנקב קרום התא. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אבק את supernatant ו הדגירה לחזור עם PBS-Tx פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים רקמות 10 מ&quot;ל של תמיסת חסימה (נסיוב סוס 5% PBS-Tx) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פתרון חסימת לפחות פעמיים עם PBS-Tx במשך 15 דקות כל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של פתרון הנוגדן העיקרי PBS-TX. ראה ריאגנטים בסעיף ציוד נוגדנים השתמשו בניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף לשטוף second PBS-Tx חסימת פתרון נוגדן ראשוני. לדגור על פלטפורמה מתנדנדת לאט (~ 30rpm) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות כדי להבטיח חדירה מעמיקה לתוך בסעיפים צף 60μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לאחזר בזהירות בעזרת פיפטה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש חוזר עוד פעמיים בתוך שבועיים ללא אובדן משמעותי של עוצמת מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין (~ 30rpm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של דילול נוגדנים משני PBS-TX. אבק מעל לשטוף האחרון ולהוסיף פתרון נוגדנים משני סעיפים רקמות. לעטוף את החלק החיצוני של הבקבוקון מכתים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור, אשר יכול לגרום photobleaching fluorophore. המקום עטוף הבקבוקון על פלטפורמה לאט הנדנדה דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פתרון נוגדנים משני על ידי שאיבת אבק משם. לשטוף חלקים פעם עם PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים נוספות עם PBS (pH 7.4) במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. הר בסעיפים רקמה צבעונית על גבי שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך באמצעות סעיפים מוכתם עבור אקסונים OSN נגוע חיובי טרמיני האקסון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות תצוגה תלת מימדי של התווית OSN האקסון ואת מסוף ארבור, ליצור סדרה של קטעים אופטי דרך עומק 60μm של הפרוסה היעד רקמות OB (לאורך ציר z) באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית זו של Z-סעיף תמונות יכול להיות מוקרן יחד לאחר מכן לשחזר פרספקטיבה 360 מעלות של סיבוב אחד שכותרתו OSN האקסון, כולל פירוט סוכת מסוף בשלמותה. זווית סיבוב אחד כל אחד יכול ליפול בפח ו מיוצא כקובץ תמונה (כלומר, JPG, TIFF) עבור מצגת בפורמט 2D. </li></ol> 4. נציג תוצאות בעזרת השיטות שתוארו כאן, אנו יכולים transduce עצב סנסורי על ידי חוש הריח lentivirus in vivo. יש לנו אפוא OSNs נגוע דמיינו רחוק עם GFP וכתבים mCherry ניאון, כמו גם עם חלבון myc-tagged היתוך דרך immunocytochemistry. טכניקה זו מספקת שפע של OSNs נגועים. ובכל זאת, התמרה מתרחשת לסירוגין מספיק כדי לספק OSNs שכותרתו בנפרד, ובכך מאפשר לניתוח מורפולוגיה תא בודד. אקסונים מסופי האקסון הם צילמו בתוך קטעי רקמה OB בתוך סביבה מולדתם על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 1). כל OSN האקסון מסוף סוכת יכול בדרך כלל להיות שבוי בתוך סעיף 40-50μm אופטי. הגדלה גבוהה של נגוע מסופי האקסון OSN מאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיה סוכת axonal בשכבת גלומרולרי. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> באיור 1. מסלולו של נוירון יחיד חושי הריח האקסון ואת מסוף סוכת שלה.) קטע העטרה של הנורה חוש הריח של העכבר P7 מראה את שכבת עצב ההרחה (ONL) immunostained עבור OMP (אדום) ואת השכבה גלומרולרי (GL) immunostained עם שני OMP ו Vglut2 (אפור). האקסון יחיד הריח נוירון חושי להביע GFP (ירוק) עובר בתוך ONL וחודר לתוך המבנה גלומרולרי. ב) מסוף האקסון מורפולוגיה סוכת בתוך glomerulus המסומן בבירור על ידי ביטוי של GFP. Vglut2 שיתוף מכתים באפור מאירה את אזור glomular הכולל שבתוכו ה-GFP חיובי האקסון מרחיב abor סופנית. ג) OSNs נגוע lentiviral להביע GFP (ירוק) ב OE. Cytostructure של אפיתל הריח מוצג עם מכתים DAPI (כחול). ביטוי של GFP מאפשר הדמיה של גופים OSN התא תהליכים תאיים שלהם OE. ד) האקסון OSN ומורפולוגיה מסוף עם הביטוי Rap1GAP2 עקום על ידי shRNA. Lentiviruses נושא קלטת ביטוי כפול עם Rap1GAP2 shRNA תחת מקדם את העכבר U6 ו-GFP תחתהאמרגן CMV יושמו OE. אינפקטד מסופי האקסון הריח הציג מסוף סוכת פשוטה יותר בהשוואה לזו של פקד ה-GFP בלבד. בר = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

פרוטוקול זה הוא ביו בטיחות ברמה 2 תואם. כל אמצעי הבלימה סביבת עבודה מתאימה, הגנה אישית, נגיפי פסולת הוקמו בהתאם. הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם להנחיות IACUC.

Microinjection תוצאות lentivirus בהעברת קבע בונה גנים לתוך הדנ&quot;א הגנומי OSN. גישה זו מאפשרת לנו לבצע מניפולציות לטווח קצר או לטווח ארוך של גנים מועמדים באמצעות overexpression או בתיווך shRNA עקום למטה. בנוסף, אנו יכולים fluorescently תווית OSNs יחיד בקו הקיים עכבר מהונדס לקיים שיתוף לוקליזציה של אוכלוסיות קולטן odorant. Microinjection נדרשת התמרה lentiviral של OSNs. יש לנו ניסיון הסמקה ההשעיה lentivirus לתוך חלל האף אל transduce OSNs ללא הצלחה. לפיכך, אנו מבצעים microinjectio...

Microinjection: עכברים יילוד היו microinjected באמצעות מזרק 5μL המילטון (Hamilton # 7647-01) מצויד במחט 33 מד (המילטון # 7762-06). Immunocytochemistry ריאגנטים: נוגדנים ראשי: נוגדן polyclonal ארנב GFP (בדיקות מולקולריות # A-6455), נוגדנים נגד עוף polyclonal OMP (מותאם אישית) (חן et al, 2005.) גיניאה חזיר polyclonal נוגדנים נגד VGlut2 (Millipore # AB2251). נוגדנים משני: Cy2-מצומדות חמור נגד ארנב (ג&#39;קסון Immunolab # 711-225-152), Cy3-מצומדות החמור נגד עוף (ג&#39;קסון Immunolab # 703-165-155) ו-Cy5 מצומדות נגד ניסיונות עז חזיר (ג&#39;קסון Immunolab # 106-175-008). מדורים היו רכוב על שקופיות הזכוכית עם Fluoromount G (דרום ביוטק # 0010-01) עם פתרון 50ng/mL הכרומטין DAPI הכתם. Confocal הדמיה: Z-ערימת התמונות צולמו באמצעות אולימפוס Flouview FV1000 מיקרוסקופ confocal ותמונות נאסף ומעובד על תחזיות 3D באמצעות אולימפוס FV10-ASW רכישת 2.01 confocal ותוכנה ניתוח.

lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

פיתוח מעגל חוש הריח המדויק מסתמך על תחזית מדויקת של חושי הריח נוירון (OSN) אקסונים מטרות הסינפטי שלהם הנורה חוש הריח (OB). מנגנונים מולקולריים של צמיחה האקסון OSN ומיקוד אינם מובנים היטב. ביטוי גנים מניפולציה ובעקבות חזותי של אקסונים OSN יחיד מסוף סוכת המורפולוגיה שלהם עד כה מאתגר. כדי לחקור תפקוד גנים ברמת תא בודד בתוך מסגרת הזמן המצוין, פיתחנו טכניקה המבוססת lentiviral לתפעל ביטוי גנים OSNs in vivo. חלקיקים lentiviral מועברות על ידי OSNs microinjection לתוך אפיתל ההרחה (OE). קלטות הביטוי אז הם משולבים באופן קבוע לתוך הגנום של OSNs transduced. חלבון הפלואורסצנט הירוק ביטוי מזהה OSNs נגוע מתאר מורפולוגיה כולו שלהם, כולל מסוף האקסון ארבור. בשל זמן אספקה ​​קצר בין microinjection זיהוי כתב, תפקוד לימודי הגן יכול להיות ממוקד בתוך פרק זמן צר מאוד של פיתוח. באמצעות שיטה זו, יש לנו לזהות ביטוי של GFP בתוך כמה כמו שלושה ימים עוד שלושה חודשים לאחר ההזרקה. השגנו גם יתר ביטוי shRNA בתיווך עקום על ידי microinjection lentiviral. שיטה זו מספקת מורפולוגיות מפורט של גופים OSN התא אקסונים ברמת תא בודד in vivo, ובכך מאפשר אפיון של פונקציה מועמד גנים במהלך התפתחות חוש הריח.

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

פיתוח של מעגל ריח מדויק נסמך על השלחה מדויקת של אקסונים של נוירונים תחושתיים ריחוניים (OSN) ליעדיהם הסינפטיים ב...

אחד האתגרים בלימוד התפתחות במדעי המוח הוא לכידה של מורפולוגיות דנדריטיות ואקסונליות ברמת התא הבודד in vivo. במערכת הריח, נוירונים תחושתיים ריחוניים שולחים את האקסונים שלהם מהאפיתליום הריחוני באף אל הפקעת הריח במוח. ככל שמספר רב של נוירונים תחושתיים ריחוניים מקרינים לעבר הפקעת הריח, הם מתאגדים לאגודות.דבר זה מקשה על חקר מסלוליהם של אקסונים בודדים והמורפולוגיה של קצותיהם. פיתחנו שיטה להדמיה של נוירונים תחושתיים ריחניים בודדים in vivo באמצעות הזרקה מיקרוסקופית של מבנה GFP הנשאי לנטי-וירוס.טרנסדוקציה מוצלחת באמצעות לנטי-וירוס מאירה את כל אורכו של אקסון התחושה הריחית, כולל הענפיים הטרמינליים. בנוסף להדמיה של נוירונים תחושתיים ריחתיים בודדים, שיטה זו מאפשרת לנו למניפולציה של ביטוי גנים של גן ספציפי שמעניין אותנו כדי לחקור את תפקודו בהקשר של in vivo. הליך לנטי-וירוס זה מדורג כרמת בטיחות ביולוגית 2 ויש לבצעו במנדף זרימה למינרית.כדי לשמור על סביבה סטרילית, יש לרסס בתוך המנדף את כל הפריטים המוחדרים אליו ב-70% ethanol; הכין וחמם מראש מקבץ מים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 20 דקות לפחות לפני ההזרקה. אטום שקית אחסון מפלסטיק ממולאת למחצה במים והנח אותה על אינקובטור בעל בלוק חימום ריק.דבר זה יאפשר לעכברים להתאושש לאחר ההזרקה. מלאו מכל לפסולת ביו-סיכונית ב-10% bleach כדי לחטא את כל החומרים שנחשפו לנגיף. כחלק מהליך זה, הכינו צלחת פתוחה קטנה עם 70% ethanol וצלחת שנייה עם מים מזוקקים סטריליים.במבתר זרימה למינרית, נשתמש במזרק Hamilton בנפח של 5 µL עם מחט בכיול 33 gauge. דגם זה מאפשר לכוונן את התנגדות הבוכנה על ידי סיבוב חוגת מתיחה הממוקמת בחלקו העליון של תא הבוכנה. תכונה זו מספקת שליטה בנפח ההזרקה המיקרוסקופית לצורך עיקור המחט ותא המזרק.שאבו והחזירו את האתנול מהצלחת מספר פעמים באופן חוזר. שטפו את מחסנית המזרק על ידי שאיבה והזרקה של מים סטריליים מספר פעמים. הניחו את המזרק בבטחה בצד בתוך תא הזרימה הלמינרית.סדרו מגבונים אלכוהוליים ליד תחנת ההזרקה. הכינו במה להזרקה המספקת משטח מוגבה שיקל על מיקום העכבר. ניתן להשתמש בצלחת תרבית של 10 סנטימטר הפוכה המכוסה במגבוני Kim wipes.ניתן להרדימ גורי עכבר באמצעות היפותרמיה עד לגיל הגמילה. גזרו אצבע מכפפת גומי והניחו את גור העכבר בתוך קטע האצבע הגזור. לאחר מכן, הניחו על קרח למשך חמש דקות.הכפפה תמנע כוויות עור שעלולות להתרחש כתוצאה ממגע ישיר עם הקרח. כדי לוודא הרדמה מלאה, נבצע בדיקת קרח על ידי צביטה של האחוריים ושל ארבע רגלי הגור כדי לוודא שהחיה אינה מגיבה. אנו מוכנים כעת להזרקה מיקרוסקופית של lentivirus. נדגים את הפעולה על גור ניונוטלי.במידה ומשתמשים בעכבר בגיל מבוגר יותר, יש להחליף את המחט בכיסוי (gauge) 33 במחט רחבה יותר על מנת לחדור את פני השרימה. יש לעקר את שטח האף של העכבר על ידי ניגוב עם פד אלכוהול. הוצא את מלאי הלנטי-וירוס מהמקפיא והפשר על קרח.הפקנו לנטיווירוס במעבדה באופן עצמאי באמצעות שיטות מבוססות. במהלך פיתוח שיטה זו, מצאנו כי נדרש טיר viral minimal של 10⁹ יחידות זיהומיות למיל' כדי להשיג קצב טרנסדוקציה טוב. שאבו 2 µL מתמיסת המאגר של הלנטיווירוס למזרק Hamilton סטרילי.הניחו את גור העכבר על גבי במת ההזרקה. אחזו בעור בחלק העליון של הראש באזור האוזניים, ומשכו בעדינות לאחור. ציידנו את מבת העבודה (flow hood) שלנו במיקרוסקופ דיסקציה.על מנת להכווין את ההזרקות המיקרוסקופיות בצורה מדויקת, חפשו את קווי המתאר של הבצולת הריחית על פני השטח הגבי של הגולגולת באזור המוח הקדמי. יעדי ההזרקה המיקרוסקופית שלנו סוגרים מקרוב את הבצולת הריחית, אך אינם כוללים את הבצולת עצמה. אנו מבצעים ארבע הזרקות לאפיתל הריח של כל גור גור.מיקומים אלו, המיוצגים על ידי נקודות כחולות, דורשים החדרת מחט בזווית המופנית מדיאלית. שתי ההזרקות הנוספות, המיוצגות על ידי נקודות ירוקות, הן מדורגות, במקום מדיאלי ואנטריורי יותר לבצל האפוף (olfactory bulb). ניתן להחדיר הזריקות הללו בזווית תואמת.ההמלצות על זוויות המחט ניתנו בהתחשב במיקומו הגבאי של אפיתלריון הריח, הממוקם ברובו מתחת לפקעת הריח. לפיכך, גישה ניצבת היא מוגבלת. הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף, כ-3 מילימטרים מתחת לפני השטח של העור.כדי להגיע לאפיתול הריח. יד מיומנת צריכה להרגיש את הירידה בהתנגדות כאשר מגיעים לחלל הלומן של חלל האף. יש להימנע מאזור זה.בצע הזרקה מיקרוסקופית של 0.5 µL מתמיסת המלאי של הנגיף לכל מיקום. שוב, בבחירת שני אתרים לכל צד, הן בצד שמאל והן בצד ימין, ארבע הזרקות בסך הכל של 0.5 µL. עבור כל עכבר המשמעות היא צורך בשני µL של נגיף לסשן הזרקה בודד.שוב, יש להיזהר שלא להחדיר לתוך הפקעת הריח (olfactory bulb) שאריות של תמיסת וירוס או דם שעלולים לדלוף מאתר ההזרקה או מפתחי הנחיריים. בעזרת מגבון אתנול, השליכו את המגבונים למכל המכיל תמיסת אקונומיקה מדוללת, והניחו מיד את העכבר המוזרק על אינקובטור מיטה-מים להחלמה. חטאו את המחט והמזרק על ידי חזרה על הליך הסטריליזציה שבוצע במהלך ההכנה. ניתן להחזיר את העכברים המוזרקים לכלובם 30 דקות לאחר ההחלמה באינקובטור מיטה-מים.ניתן לחזור על כל תהליך המיקרו-הזרקה שוב בעוד ארבע שעות. אם ברצונכם להגדיל את מספר הנוירונים החושיים האולפקטוריים שיוהדפו, ניתן יהיה להדמיות של נוירונים חושיים אולפקטוריים שהודפקו לאורך התא כולו תוך שלושה ימים בלבד. בעלי החיים יוקרבו ויעברו פרפוזיה לצורך תצפית בנקודת הזמן הרצויה.כדי להדמינ את מסלוליהם של נוירונים חושיים ריחיים בודדים שעברו טרנסדוקציה ואת קצות האקסונים שלהם, נבצע נתיחה וחיתוך של הפלורה האולפקטורית (olfactory bulb) במישור קורונלי בעובי של 60 מיקרון בשיטות סטנדרטיות. החיתוך יכיל כך את כל שכבות התאים של הפלורה האולפקטורית, כולל צרורי אקסונים של נוירונים חושיים ריחיים וטרמינלי אקסונים, היוצרים סינפסות במבני גלומרולריים השוכנים על פני השטח של הפלורה, כהכנה לביצוע אימונוהיסטוכימיה בשיטת ציפה (floating immunohistochemistry). נבצע חיתוכים סדרתיים של הפלורה האולפקטורית ונאסוף אותם יחד לתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר עם 5 מיליליטר של phosphate buffered saline.העבירו את החתכים הצפים לבקבוק קוני של 50 milliliter. לאחר שהחתכים שקעו לתחתית הבקבוק, שאבו החוצה את ה-phosphate buffered saline. היזהרו לא לשאוב את החתכים.ממלאים מחדש את המבחנות ב-10 milliliters של בופר טרי כדי לשטוף שאריות של חומר קיבוע או חומר הטמעה. מעבירים מיד באמצעות פיפט את התוך-תליה למבחנה קונוית של 15 milliliters, תוך הקפדה על איסוף כל הפרוסות הצפות, שואבים החוצה את תמיסת השטיפה, ומבצעים פרפורציה לפרוסות באמצעות תמיסה של 0.3%Triton X 100 ב-phosphate buffer saline ומניחים על פלטפורמת נדנדה למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, ניתן להמשיך בפרוטוקול צביעה אימונו-היסטוכימית סטנדרטי באותה המבחנה קונוית, תוך חזרה על שלבי השאיבה והנדנדה לפי הצורך עבור כלי בנפח זה, תוך שמירה על נפח של 10 milliliters לשלבי הצביעה והשטיפה.להלן רשימה של נוגדנים המשמשים אותנו לצביעה משולבת (cos stain) של נוירונים תחושתיים ריחוניים שעברו טרנסדוקציה חיובית, ושל אוכלוסיית הנוירונים התחושתיים הריחוניים הכללית. כדי להבטיח חדירה מלאה של הנוגדנים לתוך חתכי פקעת הריח בעובי 60 מיקרון, מומלץ לדגרי רפש למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. משך כל שלב של שטיפה לא יעלה על 20 דקות.פזרו בעדינות כל חיתוך על גבי למסלידה באמצעות מכחול, והצמידו כל סלידה באמצעות Flora Mount G בתוספת תמיסת צביעת כרומטין. השקיעו מאמץ להסיר את כל הבועות מתוך תווך ההצמדה. הצמידו את החיתוכים בשורות כדי לפשט את שלב הסריקה העוקב.סרקו שכבות אלו בחתכי הנורונים הצבועים בשיטת אימונו-סטינינג (immuno stain) כדי לאתר סיבי אקסונים וסיומים חיוביים ל-GFP. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן לצלם סיומי עצבים שהודבקו באופן חיובי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מומלץ לכייל את מישור המיקוד באזור העניין באמצעות ערוצי ה-DPI וחלבון הסימון האולפקטורי (olfactory marker protein).תוצאות אלו מציגות סיב של אקסון של נוירון תחושתי ריחני בודד וטרמינל של אקסון בתוך הגלומרולס, כאשר CO עם חלבון סימון ריחני (olfactory marker protein) מופיע באדום ו-vlu two באפור; ניתן להדמיאן גם את גופי התא של הנוירונים התחושתיים הריחניים המודבקים ואת הבליטות הדנדריטיות שלהם בתוך אפיתל הריח, במידה ורקמה זו נכללה בשלבי הדיסקציה והצביעה האימונוהיסטוכימית. היטל הקונפוקאל מספק לנו מורפולוגיה מפורטת מאוד של נתיב התפשטות אקסונלית ושל עץ הטרמינלים של נוירון תחושתי ריחני בודד. ניתן לראות את כיפוף סיב האקסון חזרה לעבר היעד הגלומרולרי שלו, כמו גם את פרטי תבנית ההסתעפות שלו בתוך הנוירופיל הגלומרולרי.שיטת המיקרו-הזרקה של לנטי-וירוס מאפשרת ויזואליזציה של אקסון של תא בודד, של מורפולוגיות של נוירונים תחושתיים ריחוניים, ומאפשרת מחקרים המניפולטיביים בביטוי גנים; טרנסדוקציה של לנטי-וירוס מביאה לאינטגרציה גנומית יציבה של קונסטרקטים. לנטי-וירוס אינו מדביק תאים שכנים באופן סינפטי. ניתן להשיג ויזואליזציה תוך שלושה ימים בלבד, ואושר כי היא נמשכת לפחות שלושה חודשים וככל הנראה נשמרת לפרקי זמן ארוכים יותר.נוירונים תחושתיים של חוש הריח אינם נדבקים בקלות באמצעות עירוי נזאלי של תמיסת לנטי-וירוס. לכן, בפרוצדורה זו נדרשת מיקרו-הזרקה דרך פני השטח. כך נראית פרוצדורת המיקרו-הזרקה של הלנטי-וירוס שלנו.אני מקווה שמצאתם את כל המידע הזה מועיל להשגת מורפולוגיות של תא בודד משלכם. בהצלחה במחקר.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית...

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

מקור: Kozin, E. D., et.al. הדמיה ישירה של גרעין השבלול הגבי של העכברים לגירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר (DCN) כדי לאפשר גירוי שמיעתי המושרה על ידי אור. וקטור ויראלי המקודד אופסין, תעלת יונים רגישה לאור, מוזרק לתוך ה-DCN לאחר קרניוטומיה ושאיפת מוח לגישה ישירה. האופסינים המבוטאים מאפשרים להפעיל נוירונים על ידי אור, ומספקים מודל לחקר תגובות מסלול השמיעה באמצעות אופטוגנטיקה.

העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר לגירוי שמיעתי המושרה על ידי אור

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג in vivo של נוירונים חושי ריח על ידי אלקטרופורציה ולאחר מכן סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופ רב-פוטוני כדי להמחיש את המורפולוגיה העצבית והתפתחותה לאורך זמן.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה In vivo

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

אנו מתארים כאן שיטות להשראת וניתוח שיפוץ תלוי חוויית ריח של גלומרולי סינפטי של אונת אנטנה במוח הצעיר של דרוזופילה .

עיצוב מחדש תלוי ניסיון של נוירון חושי חושי הריח של המוח הצעיר קישוריות סינפטית בתקופה קריטית לחיים מוקדמים

למד טכניקת לנטיוירוס לתיווך גנטי וויזואליזציה של נוירונים סנסוריים חוש הריח בודדים in vivo. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי אקסונים ומורפולוגיות טרמינליות במערכת הריח המורכבת.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo

גלה סרטונים נוספים