הכנת אורגנואידים מגידולים: מודל גידול תלת מבחנה תלת ממדי

טוחנים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות. העבירו את החלקים לצינור עם מאגר עיכול. סיבי קולגן המקיפים את התאים מתפרקים, ופוגעים במטריצת הרקמה. לאחר מכן, גלו את החתיכות המעוכלות והשליכו את רוב מאגר העיכול. החלק את הצינור כדי לפרק את הגלולה.

הפתרון מורכב כעת מגושי תאים בגדלים שונים. השעו מחדש את גושי התאים בתמיסה של טריפסין ומעכב ROCK. הטריפסין ממשיך לפרק את הגידול והמעכב מונע מוות של תאים. במרווחי זמן קבועים, פיפטה את התמיסה כדי לפרק את הגושים ולפזר את התאים. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים בתמיסת מטריצה בריכוז המתאים.

מניחים טיפות מהתמיסה בצלחת תרבות ליצירת כיפות מטריצה. הניחו את הצלחות הפוכות בחממה ואפשרו למטריצה להתמצק לחלוטין. לאחר מכן, הוסף אמצעי תרבית תאים ודגירה, צד ימין כלפי מעלה. המטריצה מספקת פיגום לתמיכה בצמיחה תלת מימדית של האורגנואיד.

לאחר הטחינה, הנח את חתיכות הגידול בצינור של 15 מיליליטר של מאגר עיכול לעיכול של 1.5 עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בסוף העיכול, משקעים את הרקמה המעוכלת על ידי צנטריפוגה ומשליכים את הסופרנטנט.

החלק את הצינור כדי לשחרר את גלולת התא. השעו מחדש את התאים ב-1 מיליליטר של טריפסין שחומם מראש בתוספת מעכב Y-27632 ROCK מיקרו-מולרי למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, יש לשלש את תמיסת הרקמה חמש פעמים עם קצה הפיפטה הסטנדרטי P1000. החזירו את הצינור לאמבט המים למשך 5 דקות נוספות של דגירה וטריטורציה.

לציפוי כיפת מטריצה, יש לשטוף את התאים המעוכלים ב -9 מיליליטר של מדיום קר, ואז לאסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה. השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום טרי לספירה, ולאחר הספירה, אספו את התאים שוב על ידי צנטריפוגה. לדלל את תאי הגידול בנפח המטריצה המתאים.

זרוק בזהירות 200 מיקרוליטר של תמיסת תאי מטריצה לכל באר של צלחת מחוממת של 55 מעלות צלזיוס עם 6 בארות. הניחו לכיפות להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות לפני שמניחים את הצלחת הפוכה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

כאשר הכיפות התמצקו במלואן, הוסף 2 מיליליטר של מדיום אורגנואיד ערמונית בתוספת אנדרוגן R1881 ומעכב ROCK לכל באר. החזר את הצלחת לחממת תרבית התאים.