מידול סרטן הערמונית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית: טכניקת עריכת גנים מקומית בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי האונה הקדמית של הערמונית בעכבר

התחל עם מודל עכבר CRISPR/Cas9 מורדם ומוכן הנושא גנום שהונדס לבטא אנדונוקלאזות Cas9 וחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים, או GFPs, על ידי מקדם חזק במעלה הזרם. קלטת FLOXED-STOP או LSL המוכנסת מיד במורד הזרם למקדם חוסמת את שעתוק Cas9 ו-GFP בתנאים רגילים.

חתכו את דופן הבטן של העכבר כדי לחשוף את אונת הערמונית הקדמית המחוברת לשלפוחית הזרע. הזרקו את התרחיף האדנוויראלי הרצוי לאונה הקדמית כדי להקל על העברת הגנום הנגיפי הממוקד לתאים. הנח את אונת הערמונית בחזרה לחלל הבטן ותפור את החתך.

בתוך תאים נגועים בנגיף, הגנום הנגיפי מבטא אנזימי Cre recombinase ו-Guide-RNAs המכוונים לגן שיש לעבור מוטציה. אנזימי ה-Cre מזהים את קלטת ה-LSL ומסירים את חוסם השעתוק המפוקס. שלב זה מאפשר למקדם להניע את הביטוי של אנדונוקלאזות Cas9 ו-GFPs.

לאחר מכן, אנדונוקלאזות Cas9 יוצרות קומפלקסים עם RNA מנחה מקודד וירוס המכוונים את הקומפלקסים הללו לרצף המטרה בתוך הגן המיועד למוטציה. לוקליזציה זו מאפשרת לאנדונוקלאז Cas9 לבקע את ה-DNA הגנומי בתוך גן המטרה, מה שמוביל לשינוי גנטי.

שינוי אונקוגני גורם לתאים שעברו מוטציה להפוך לסרטניים. הביטוי המשותף של חלבוני מדווח GFP בתוך תאים מוטנטיים מקל על זיהוי ומעקב אחר התקדמות הסרטן.

כדי להעביר את הנגיף לערמונית, לאחר הרדמת עכבר זכר בן 8 שבועות על פי פרוטוקול הטקסט, בדוק את עומק ההרדמה על ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגת דוושה ורפלקסים פלפברליים. כאשר נצפה אובדן רפלקסים, יש לגלח את הבטן התחתונה של החיה. בעזרת צמר גפן סטרילי, כסו בזהירות את עיני החיה במשחת עיניים וטרינרית כדי למנוע עיוורון הנגרם על ידי קסרופתלמיה. לאחר מכן, השתמש ב-70% אתנול ו-10% פובידון-יוד כדי לנגב את הבטן המגולחת כדי לחטא את אזור הניתוח.

לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים, בצע חתך עור אנכי של כסנטימטר אחד בקו האמצע של הבטן התחתונה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים נקודתיים, הרם את הצפק כדי למנוע נזק לאיברים המונחים מתחתיו, והשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע בזהירות חתך של 8 מילימטר או פחות דרך הצפק. הזיזו בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים טבעתיים, הרם בזהירות את שלפוחית הזרע עד שניתן יהיה לזהות את הערמונית הקדמית.

כעת, עם מזרק אינסולין של 0.5 מיליליטר ומחט 30G x 8 מילימטר, הזרקו נפח כולל של 30 מיקרוליטר של תמיסת וירוס לאפיתל הערמונית הקדמי. צמצם את הדליפה וודא שהנוזל נספג בתוך הרקמה ויוצר בועה קטנה. לאחר מכן, הנח את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.

כדי להבטיח שהנוזל ייספג בתוך הרקמה בבועה קטנה וללא דליפה, הקפידו להזריק במקביל לשלפוחית הזרע ולעקוב אחר צורת האונה הקדמית של הערמונית.

בעזרת מחט נקודתית מתחדדת ועיגול של 13 מילימטר, 3/8, תפר את הצפק בשניים עד שלושה תפרים קטועים פשוטים של תפר נספג 6-0. לאחר מכן, הרם את העור בעזרת מלקחיים כדי למנוע נזק לצפק, הדק את העור בשלושה קליפסים סטריליים בגודל 4.8 x 6.5 מילימטר.

להחלמה טובה יותר לאחר הניתוח, השתמש במזרק סטרילי של 1 מיליליטר ובמחט בגודל 27 גרם x 1/2 אינץ' כדי לתת את נוגדן ההרדמה במינון של 0.1 מיליליטר לגרם משקל גוף בהזרקה תוך צפקית. לאחר מכן, החזירו בזהירות את החיה לכלוב שלה.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.