מידול סרטן הערמונית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית: טכניקת עריכת גנים מקומית בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי האונה הקדמית של הערמונית בעכבר

התחל עם מודל עכבר CRISPR/Cas9 מורדם ומוכן הנושא גנום שהונדס לבטא אנדונוקלאזות Cas9 וחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים, או GFPs, על ידי מקדם חזק במעלה הזרם. קלטת FLOXED-STOP או LSL המוכנסת מיד במורד הזרם למקדם חוסמת את שעתוק Cas9 ו-GFP בתנאים רגילים.

חתכו את דופן הבטן של העכבר כדי לחשוף את אונת הערמונית הקדמית המחוברת לשלפוחית הזרע. הזרקו את התרחיף האדנוויראלי הרצוי לאונה הקדמית כדי להקל על העברת הגנום הנגיפי הממוקד לתאים. הנח את אונת הערמונית בחזרה לחלל הבטן ותפור את החתך.

בתוך תאים נגועים בנגיף, הגנום הנגיפי מבטא אנזימי Cre recombinase ו-Guide-RNAs המכוונים לגן שיש לעבור מוטציה. אנזימי ה-Cre מזהים את קלטת ה-LSL ומסירים את חוסם השעתוק המפוקס. שלב זה מאפשר למקדם להניע את הביטוי של אנדונוקלאזות Cas9 ו-GFPs.

לאחר מכן, אנדונוקלאזות Cas9 יוצרות קומפלקסים עם RNA מנחה מקודד וירוס המכוונים את הקומפלקסים הללו לרצף המטרה בתוך הגן המיועד למוטציה. לוקליזציה זו מאפשרת לאנדונוקלאז Cas9 לבקע את ה-DNA הגנומי בתוך גן המטרה, מה שמוביל לשינוי גנטי.

שינוי אונקוגני גורם לתאים שעברו מוטציה להפוך לסרטניים. הביטוי המשותף של חלבוני מדווח GFP בתוך תאים מוטנטיים מקל על זיהוי ומעקב אחר התקדמות הסרטן.

כדי להעביר את הנגיף לערמונית, לאחר הרדמת עכבר זכר בן 8 שבועות על פי פרוטוקול הטקסט, בדוק את עומק ההרדמה על ידי הערכ