בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

תאים חד-גרעיניים במוח, הכוללים לימפוציטים ומונוציטים, ממלאים תפקידים מכריעים בשמירה על תפקוד המוח והומאוסטזיס.

כדי לבודד את התאים החד-גרעיניים הללו, ראשית, קחו מוח עכבר טרי שנקטף עם מי מלח.

הזלוף מאפשר הוצאת דם ומרכיביו מכלי הדם, ומאפשר בידוד של תאי חיסון השוכנים במוח בשלבים הבאים.

כעת, שטפו את המוח במדיה מתאימה להסרת כדוריות דם אדומות דביקות. עקוב אחר השטיפה עם טחינה כדי להשיג חתיכות רקמה קטנות.

הומוגניזציה של חלקי הרקמה כדי לקבל השעיה של תאים בודדים ושברי תאים.

למתלה זה, הוסף מדיה מקוררת ומדיום שיפוע צפיפות מתאים בנפחים מתאימים ליצירת מדיום שיפוע בצפיפות נמוכה.

לאחר מכן, הוסיפו נפח מסוים של מדרג צבע בצפיפות גבוהה. מדיית מעבר הצבע בצפיפות גבוהה יוצרת שכבה נפרדת בתחתית, ויוצרת מעבר צבע לא רציף.

צנטריפוגה את המתלים במהירות גבוהה ובתנאי טמפרטורה נמוכה. תאים חד-גרעיניים תופסים את הממשק בין שתי שכבות המדיה של שיפוע הצפיפות.

השליכו את השכבה העליונה המכילה פסולת תאית ומיאלין - מעטפת רקמת השומן המקיפה את אקסוני תאי העצב.

העבר את שכבת הממשק לצינור טרי המכיל מדיה וצנטריפוגה מתאימה.

תאים חד-גרעיניים מטוהרים משקעים כגלולה וניתן להשעות אותם מחדש במאגר לניתוח נוסף.

חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר ומעבירים את המוח של כל בעל חיים מקופסת הגולגולת לצינורות בודדים של 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של מדיום RPMI.

מערבבים היטב את הצינורות כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות הדבקות ולהסיר את המדיום על ידי שאיפה. הוסף 10 מיליליטר מדיום טרי לכל צינור והעביר את המוח לכלים בודדים של 100 מילימטר.

קוצצים דק כל מוח בעזרת סכין גילוח והשתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר כמה שיותר רקמה ממנה אחת בכל פעם ב -6 מיליליטר של מדיום להומוגניזטור זכוכית מסונטר קר כקרח של 7 מיליליטר.

טוחנים את המוח באמצעות הבוכנה ה"רופפת" של העלי לפני השימוש בבוכנה "ההדוקה" כדי להביא את הרקמה עד שהתרחיף הומוגני. לאחר מכן, שפכו את תמיסת הרקמות שהתקבלה לתוך צינור חרוטי מקורר מראש של 15 מיליליטר על קרח.

כאשר כל הדגימות הומוגניות, התאם את הנפח בכל צינור ל-7 מיליליטר עם מדיום טרי לפני הוספת כל תרחיף רקמה לצינור מקורר חדש של 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר של מטריצת ממברנת בסיס 100% לכל צינור.

מערבבים בהיפוך כמה פעמים ומשתמשים בפיפטה של 3 מיליליטר כדי להוסיף בזהירות ולאט לאט 1 מיליליטר של תמיסת שיפוע בצפיפות של 70% מתחת לכל דגימת תמיסת רקמות.

הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות והסר כמעט את כל השכבה העליונה, תוך הקפדה על הסרה מוחלטת של כל המיאלין.

העבירו את הממשק לצינור חדש של 15 מיליליטר והתאימו את עוצמת הקול ל -10 מיליליטר עם מדיום טרי. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הדגימות והסר את הסופרנטנט לפני השעיית הכדורים בכ-100 מיקרוליטר של מדיום לכל צינור.

• Centrifuge Isolators - Devices used to separate components of a (e.g., cell) mixture.
• Sucrose Gradient Media - Medium used to separate components based on their density.
• Density Gradient Centrifugation - Method to separate cellular components using density.
• Density Gradient Medium - Medium in which components are separated in gradient centrifugation.
• Resident Immune Cells - Immune cells that permanently inhabit tissues (e.g., brain).

• Introduce Centrifuge Isolators - Tools used in separating mixed (e.g., cellular) components.
• Key Concepts - Principles of density gradient centrifugation (e.g., using density).
• Underlying Mechanisms - The nature of separation by density, e.g., gradient centrifugation.
• Connect to Experiment - Use of centrifugation to isolate resident immune cells from brain tissue.

• What are centrifuge isolators and how do they help in cellular separation?
• What is the concept behind density gradient centrifugation?
• What role does the density gradient medium play in the separation process?

• Practical Applications - Centrifugation used in scientific and medical labs (e.g., diagnostics).
• Industry Impact - Fields like neuroscience and immunology benefit (e.g., studying brain diseases).
• Societal Importance - Advances in understanding innate immunity (e.g., resident immune cells).
• Link to Scientific Advancements - Enhanced precision in cell separation techniques.