טעינת חרוזים להחדרת חומצות גרעין לתאים מתורבתים דבקים: טכניקה לטעינת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטי לתאי יונקים דבקים

התחל בתרבית של תאי יונקים דבקים בצלחת תרבית. העבירו חרוזי זכוכית מעוקרים שטופלו באלקלי בגודל מיקרון לתא של מכשיר מעמיס חרוזים מותאם אישית. מכסים את פתח החדר באמצעות רשת עם פתחים בגודל אופטימלי כדי לאפשר לחרוזים לעבור במהלך הטעינה. אבטח את הרשת באמצעות מכלול תא הדמיה.

הסר מדיה מהצלחת. פיפטה השעיה של DNA פלסמיד מקודד חלבון מדווח פלואורסצנטי לתוך הצלחת לפיזור אחיד על התאים. בעזרת מנגנון מעמיס החרוזים, פזרו בעדינות שכבה אחת של חרוזי זכוכית על התאים. הקש קצרות על לוחית התרבות בכוח מתאים.

חרוזי הזכוכית מתגלגלים לזמן קצר על גבי התאים הדבקים, בעוד שהטיפול האלקלי גורם להם להיצמד פחות לתאים. ההשפעה של התנגשויות בין חרוזים לתאים מעבירה עומס מספיק ויוצרת שיבושים מקומיים בקרומי התא. נקבוביות חולפות שנוצרו במידות קטנות מקלות על ספיגת ה-DNA של הפלסמיד לתאים תוך מניעת כניסת חרוזים גדולים.

במהלך תקופת ההחלמה, קרום התא נאטם מחדש, משחזר את שלמות הממברנה ולוכד את ה- DNA של הפלסמיד. הוסף מדיה לצלחת ושאף בזהירות כל חרוז צף גלוי מהצלחת. דגרו את הצלחת.

תאים שעברו טרנספטציה מוצלחת המכילים DNA פלסמיד מבטאים את חלבוני הדיווח הפלואורסצנטיים, אותם ניתן לדמיין במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הסר את המדיום מהתאים, ושאף בעדינות את כל המדיום מסביב לשולי החדר. לאחר מכן, הטה את החדר בזווית של כ-45 מעלות, והסר את טיפת המדיה שנותרה במיקרו-באר המרכזית. העבר את תמיסת טעינת החרוזים בעדינות על מיקרובאר הזכוכית הקיימת במרכז החדר.

השתמש במנגנון טעינת החרוזים כדי לפזר בעדינות שכבה אחת של חרוזי זכוכית על גבי התאים. ודא שהחרוזים מכסים את התאים לחלוטין. צבט את החדר בשתי אצבעות. הרם אותו כשני סנטימטרים, והורד אותו בחוזקה באמצעות כוח שווה ערך בערך להפלת המנה מגובה זה.

הוסף בעדינות את המדיום בחזרה לתא על ידי פיפטינג איטי על צד הפלסטיק של החדר. שאפו כל חרוז צף מבלי להפריע לתאים. יש לבצע את כל הליך העמסת החרוזים במהירות יחסית, כך שהתאים לא יתייבשו כשהם ללא מדיום. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 0.5 עד שעתיים בחממה.