מבנה של HIV-1 הרכבות capsid על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים cryo-ו איטרטיבי לשיקום שטח נדל סליל

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק שיטה לקבלת מבנה תלת-ממדי של מולקולות המורכבות בצורה הלייקלית באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים. הפרוטוקול מתחיל בהכנת דגימה ל-cryo EM תוך שימוש בשיטת דילול מהיר ובניגוב אחורי (backside blotting) כדי להפחית באופן זמני את ריכוז המלח בעת הכנת רשת ה-EM הקפואה והמהוהית. תהליך זה מבטיח את יציבות החלבון תוך הפחתת רעשי רקע ושיפור יחס האות לרעש במהלך איסוף הנתונים במינון נמוך ב-cryo EM, המבוצע לאחר איסוף הנתונים.

אינדקס ספירלי של תבניות העקיפה הושלם. לאחר מכן מבוצע עיבוד תמונה, ואחריו שחזור תלת-ממדי במרחב הממשי, המביאים למפת הצפיפות הסופית של קפסיד ה-HIV או של צינור ca. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה בביצועה, כיוון שישנן מספר נקודות קריטיות לאיסוף נתונים וניתוח אופטימליים.

לדוגמה, במקרה של HIV, התלכדות של מבני קפסייד צינוריים שנוצרים רק בתמיסה מולרית אחת, להובילה הפחתה מהירה של ריכוז המלח מבלי להשפיע על המבנה. קבלת תמונות cryo EM באיכות גבוהה היא קריטית. בהינתן תמונת צינור, קשה מאוד ללמוד כיצד לבצע אינדקס לצינור קריטי ובאיזו תוכנה ניתן להשתמש לצורך שחזור תלת-ממדי (3D reconstruction).

סרטון זה מספק גישה מפורטת ופשוטה לקבלת שחזור תלת-ממדי של אובייקטים פיזיים ויכול לשמש כייחוס עבור הניסוי שלכם. אני אדגים את הפרוצדורה יחד עם ד"ר Puja. שנינו פוסט-דוקטורנטים מהמעבדה של ד"ר [שם המעבדה]. כדי להכין מכלולי חלבוני הקפסיד של HIV-1 עבור cryo-EM, התחילו בביצוע glow discharge לצד הפחמן של רשתות נחושת בעובי 200 mesh, תחת 25 milliamps למשך 25 שניות.

השתמשו בנבלייזר כדי להביא את הלחות ל-80% בתא הסביבתי, שהואו plunger כבידה ידני מתוכסב. במקביל, קררו את האיתאן הנוזלי בתוך vitro bott plunger doer באמצעות חנקן נוזלי, והרכיבו את ה-plunge freezing doer על ה-plunger הכבידה הידני. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לסגור את הצבטים על קצה הרשת.

טפטפו 2.5 µL של תמיסת חלבון שהורכבה מראש על צד הפחמן של הרשת. לאחר מכן, הניחו את הפינצטה על הבוכנה כאשר צד הפחמן של הרשת פונה החוצה. הוסיפו 3 µL של באפר דילול בעל ריכוז מלח נמוך לצד האחורי של הרשת.

ספגו מיד את הרשת עם פיסת נייר סינון באותו צד. השאירו את כל השטח האחורי של הרשת במגע הדוק עם נייר הסינון למשך כשש שניות. לאחר הסרת נייר הסינון, טבלו את הרשת מיד באתאן נוזלי.

לבסוף, הסירו את הפינצטה מהבוכנה והעבירו במהירות את הרשת לקופסת אחסון רשתות. התחילו את המיקרוסקופיה האלקטרונית בקירור (cryo-electron microscopy) על ידי טעינת הרשת ההידרטית הקפואה לתוך מיקרוסקופ אלקטרוני FEI polar G two. המכשיר פועל במתח של 200 kilovolts ומצויד במצלמת CCD מדגם gatin 4K by 4K.

במצב חיפוש במינון נמוך, הגדירו הגדלה של כ-200 x. סרקו את כל הגריד כדי למצוא אזורים עם קרח מתאים. שמרו את המיקומים של אזורים אלו בקובץ הבמה (stage file).

שחזרו את המיקומים השמורים ובצעו סריקה נוספת של אזורים אלו. הוסיפו הגדלה של 3,900 x במצב חיפוש במינון נמוך (low dose search mode). בחרו לאיסוף נתונים את האזורים בעלי שכבת קרח דקה ואחידה, המאופיינים בנוכחות של צינורות ארוכים התלויים מעל חור.

שמרו את כל האזורים בקובץ שלב שני. עברו למצב חשיפה. הגדירו הגדלה של 59,000 x והכניסו מפתח אובייקטיב של 100 micrometer.

לאחר מכן, כוון את הסטיגמטיזם של העדשה ואת עוצמת הגרה למנה של כ-15 אלקטרונים לכל אנגסטרום רבוע לכל חשיפה. חזור למצב חיפוש במינון נמוך והת desloce למיקום שמור. זהה ומקם במרכז שפופרת מתאימה.

בעזרת מצלמת ה-CCD עברו למצב מיקוד (focus mode), כווננו את המיקוד וקבעו ערך defocus, בדרך כלל בין 0.5 ל-2.5 micrometers. לאחר מכן עברו למצב חשיפה (exposure mode) וקבעו זמן חשיפה של 0.3 עד 0.5 שניות עבור מינון של 15 electrons per angstrom squared. אספו את התמונות באמצעות מצלמת פלטה (plate camera), תוך מתן זמן של 10 שניות להתייצבות הסרטים לפני ביצוע החשיפה.

לאחר איסוף התמונות, עברו למיקום השמור הבא וחזרו על תהליך זה כדי לאסוף תמונות נוספות. פתחו את הסרטים ב-D 19 בריכוז מלא למשך 12 דקות. לאחר מכן, בצעו דיגיטציה של התמונות באמצעות סורק Nikon Super cool scan 9, 000 ED ברזולוציה של 6.35 micrometers לפיקסל.

ניתן לאפיין אובייקט ספירלי באמצעות שני פרמטרים: סדר בסל N ומספר קו השכבה L בטרנספורמציה של סריג הפנים של אובייקט ספירלי. כל קו שכבה מאופיין על ידי N ו-L ומתאים לקבוצה של קווים על סריג הפנים, כפי שמסומן על ידי האינדקסים H ו-K.

כדי להתחיל באינדקס ספירלי, השתמש בתוכנת Helix boxer של Iman כדי להגדיר תיבה (box out) סביב צינור ישר וארוך יחסית בעל קוטר אחיד, ושמור את התמונה בפורמט MRC. לאחר מכן, מדוד את רדיוס הצינור באמצעות תוכנת ה-boxer של Iman. קבע את מרחק החזרת הספירלה (HEL repeat distance) באמצעות תוכנה המבוססת על מתאם הצלבה (cross correlation), כגון I-M-G-C-C-F בחבילת ה-MRC.

לאחר מכן חשב את ה-foyer. בצע טרנספורמציה עם אורך קופסה חדש המהווה מספר שלם של מרחק החזרה. לאחר מכן, בחר שני קווי שכבה עיקריים המגדירים שני וקטורי סריג משטחיים בסיסיים, one zero ו-zero one, ביחידות של פיקסל FFT.

קבעו את מספרי קווי השכבה (layer line numbers) וכן את רדיאסי האמפליטודה המקסימלית עבור שני קווי השכבה העיקריים בטרנספורמציית פורייה. בהינתן מספרי קווי השכבה וערכי סדרי בצ'ל (Bessel orders) עבור שני קווי השכבה העיקריים, ניתן להפיק את הזווית שבין תתי-היחידות ואת העלייה הצירית של סליל כוכב אחד באמצעות כלל הבחירה, כפי שמתואר בפרוצדורה הכתובה. שני מספרים ממשיים אלו מתארים את סימטריית הבורג של הצינור.

שחזור תלת-ממדי מתחיל בסגמנטציה של חלקיקים באמצעות תוכנת Iman.Boxer. לאחר פתיחת מיקרוגרף המכיל חלקיקי סליל, חתוך חלקיק למקטעים חופפים בלוח הבקרה של boxer. בחר במצב helix והגדר את הפרמטרים עבור ה-boxing.

גודל התא צריך להיות גדול מקוטר החלקיק, והערך עבור OLA צריך להיות כ-90% מגודל התא. לאחר מכן, לחיצה על כל אחד מקצוות תא החלקיק תייצר באופן אוטומטי סדרה של תאי חלקיקים לאורך הסליל, ותשמור את המקטעים הממסגור ואת הקואורדינטות שלהם. השלב הבא הוא ביצוע שחזור תלת-ממדי ראשוני באמצעות שיטת שחזור המרחב הממשי ההליקלי האיטרטיבית I-H-R-S-R לפני העיבוד באמצעות I-H-R-S-R.

הפוך את הניגודיות (contrast) של תמונות ה-cryo-EM והחל סינון LOWPASS. לאחר מכן, פתח את הממשק הגרפי של תוכנת I-H-R-S-R על ידי הקלדת generator. הזן בממשק הגרפי את כל המידע עבור ערימת החלקיקים הממוסגרים (boxed particles stack), כולל השם ונתיב הקובץ של הערימה, מספר התמונות בערימה והערכים עבור פרמטרי הסימטריה.

לחצו על כפתור הסיום (finish) כדי ליצור את סקריפט השחזור. עבור B 25 SP.I השתמשו בגליל מלא או חלול כנקודת ייחוס ראשונית ואפשרו להליך לעבור מחזורים עד שלא יחולו שינויים בסימטריית הבורג המוגדרת, מה שקורה בדרך כלל לאחר מספר מחזורים. סימטריית סליל ימנית צריכה להניב שחזור בעל התכנסות יציבה.

השחזור שנוצר במחזור האחרון ישמש כרפרנס ראשוני לזיכוך נוסף. לבסוף, בצעו שחזור תלת-ממדי עם זיכוך איטרטיבי, תוך שימוש במפת הצפיפות התלת-ממדית שנוצרה על ידי I-H-R-S-R כרפרנס ראשוני לזיכוך נוסף במהלך תהליך הזיכוך. הסימטריה ההליקלית מקובעת לפי הסיבוב בין תתי-היחידות והעלייה הבלתי רדיאלית (axial rise), אשר נקבעו מהליך ה-I-H-R-S-R.

בשלב הבא, קבעו את הדיפוקוס (defocus) ואת האסטיגמטיזם הקיימים במיקרוגרף באמצעות התוכניות CTF find ו-CTF tilt מתוך חבילת התוכניות spider, המכונה FT, והכפילו את מקטעי החלקיקים בפונקציית העברה של ניגודיות (contrast transfer function), המקוצרת כ-CTF. בצעו התאמת היטלים (projection matching) על ידי השוואת היטלים של נפחי הייחוס עם התמונות המתוקנות ל-CTF באמצעות יישור רב-ייחוס (multi reference alignment). השונות בזווית ההטיה מחוץ למישור מוגבלת ל-plus or minus 10 מעלות ונדגמה במרווחים של מעלה אחת. הגדירו אילוצים כגון מקדמי מתאם גבוהים בזוויות במישור הקרובות ל-0 מעלות או 180 מעלות, והסטות X מוגבלות.

עבור פרמטרי היישור של כל סגמנט, הכלל בשחזור רק את אותם סגמנטים העומדים באילוצים. לאחר כל מחזור של זיכוך איטרטיבי, נוצר שחזור תלת-ממדי באמצעות הקרנה לאחור (back projection) המחולק בערך מסוים של ה-CTF בריבוע; לאחר מכן מוטל סימטריה ספירלית כדי ליצור נפח סימטרי. הזיכוך האיטרטיבי מסתיים כאשר לא חל שיפור נוסף ברזולוציה של השחזור התלת-ממדי החדש.

הרכבת קפסיד בודדת של HIV-1, בצורת צינור עם רדיוס של 92 Å, הותמה וחושבה עבורה התמורה של פורייה לצורך אינדקס סלילילי (helical indexing). נקבעו שני הרדיוסים, מספרי קווי השכבה (layer lines) והרדיוסים של האמפליטודה המקסימלית עבור קווי השכבה 10 ו-01. ערכי קצה של 12- ו-11 חושבו לאחר מכן עבור 10 ו-01 בהתאמה, עם מרחק חזרתי של 5195.48 angstroms. הסימטריה הבורגית של הצינור נקבעה כ-delta Z השווה ל-6.81 angstroms ו-delta five השווה ל-328.88 degrees. delta Z ו-delta five זוקקו ל-7.13 angstroms ו-328.86 degrees באמצעות I-H-R-S-R, ושחזור ראשוני הופק לאחר 10 מחזורי איטרציה.

השחזור הסופי לאחר זיכוך איטרטיבי שיפר באופן משמעותי את מפת הצפיפות בהשוואה למודל הראשוני שחושב באמצעות I-H-R-S-R. מפת הצפיפות של צינורות הרכבת הקפסיד מוצגת כשלושה חתכים אורתוגונליים: מקבילים לציר הצינור וקרובים לפני השטח, ניצבים לציר הצינור, ומקבילים ובמעבר דרך ציר הצינור. המבנה המוצג הוא תוצאה של רינדור פני השטח של מפת הצפיפות התלת-ממדית, שקוותרה ב-1.8 Sigma המקיפה 100% נפח.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה מעמיקה של האופן שבו ניתן להשיג מבנה תלת-ממדי של מולקולה המורכבת מרב-יחידות באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית קריו-גנית (cryo-electron microscopy).