אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:12 דק׳ • July 8th, 2025
הסרת חלבונים לא מקופלים בתא מווסתת בעיקר על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום התאית, שבה החלבון מזוהה ומתויג לראשונה על ידי יוביקוויטין, חלבון רגולטורי קטן, ומועבר לפרוטאזום, קומפלקס מולטי-חלבוני, להידרוליזה ופינוי.
פגיעה בפעילות מערכת היוביקוויטין-פרוטאוזום, תופעה שכיחה במחלות נוירודגנרטיביות, עלולה לגרום לחלבונים לא מקופלים להצטבר בתוך התאים, וליצור אגרגטים של חלבונים בלתי מסיסים עם השפעות ציטוטוקסיות.
כדי לדמיין ולכמת צבירת חלבונים במבחנה, השג תרחיף של תאי יונקים מותמרים - המבטאים חלבון מוטנטי בעל תווית פלואורסצנטית המאמץ קונפורמציה לא מקופלת עם שאריות הידרופוביות חשופות - במדיה מתאימה.
פיפטה מגדילה את הריכוזים של מעכב פרוטאזום לבארות של צלחת שחורה מרובת בארות כדי למזער את הקרינה ברקע במהלך ההדמיה. זרע את תרחיף תאי היונקים לבארות. דגירה כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הצלחת ולהתרבות.
ברגע שנכנס פנימה, מעכב הפרוטאזום נקשר לאתרים הפרוטאוליטיים של הפרוטאזום וחוסם את פעילותו, מה שגורם לחלבונים המוטנטיים המתבטאים להצטבר, אשר לאחר מכן מתקשרים באמצעות השאריות ההידרופוביות החשופות שלהם ויוצרים אגרגטים ציטופלזמיים, מה שמוביל בסופו של דבר למוות של תאים.
הוסף צבע קושר DNA פלואורסצנטי כדי לצבוע את גרעיני התא. דמיינו את הצלחת. אגרגטי החלבון המוטנטיים הפלואורסצנטיים נראים מפוזרים בתוך הציטופלזמה
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים