פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

חיידקים מייצרים שליחים שניים של נוקלאוטידים, NSMs - מולקולות איתות תוך-תאיות - בתגובה לגירויים מתאימים. מולקולות אלו נקשרות לחלבוני מטרה ומווסתות את תפקודי החיידקים.

כדי לזהות את חלבוני המטרה הללו באמצעות פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד, קח צלחת מרובת בארות עם ליזאט תאי חיידקים המכיל חלבונים מסיסים. חלבונים אלה נגזרים משיבוטי חיידקים שונים המבטאים ORFs בודדים - מסגרות קריאה פתוחות - בגנום, מה שמבטיח שלכל באר יש חלבון נפרד.

הוסף תערובת של גואנוזין טטרה ופנטה-פוספטים - NSMs המסומנים בזרחן רדיואקטיבי. מולקולות אלו נקשרות לחלבוני מטרה בליזאט. בעזרת כלי סיכה, אספו כמות שווה של נוזלים מכל באר. הנח את הכלי על קרום ניטרוצלולוזה כדי להפקיד את הנוזל ככתמים.

חלבוני מטרה נקשרים לממברנה באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות המונעות את הדיפוזיה שלהם. זה מבודד את ה-NSMs הקשורים עם תווית רדיו בנקודת היישום המרכזית. NSMs חופשיים מתפזרים רדיאלית עם הפאזה הנוזלית באמצעות פעולה נימית.

השתמש בהדמיית זרחן כדי לזהות את האותות הרדיואקטיביים ולקבל תמונה דיגיטלית של הכתמים. הגדירו את הכתמים באמצעות שני עיגולים. החיצוני מתאר את הפריפריה של ה-NSMs המפוזרים. המעגל הפנימי מייצג את ה-NSMs המבודדים.

חשב את שבר הקישור - עוצמת הרדיואקטיביות שזוהתה מהמעגל הפנימי על פני סך הרדיואקטיביות של הנקודה המפוזרת. אתר נקודות עם שברי קשירה גבוהים כדי לזהות את הבארות עם חלבוני מטרה הקשורים ל-NSM.

לסינון DRaCALA של חלבוני המטרה, הוסף 20 מיקרוליטר של ליזטים של תא שלם מופשר לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר עם תחתית V של 96 בארות, והוסף 2.5 יחידות של Serratia marcescens endonuclease לכל באר. לאחר 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הניחו את הליזטים על קרח למשך 20 דקות.

לאחר מכן, מערבבים כמויות שוות של זרחן 32 עם תווית גואנוזין פנטפוספט וגואנוסין טטרה-פוספט, ומוסיפים מאגר ליזה 1x #1 לתערובת כדי לקבל תמיסת גואנוזין פנטפוספט של ארבעה ננו-מולרים.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית וקצות פיפטה מסוננות, מערבבים 10 מיקרוליטר מתערובת הפנטפוספט של גואנוזין עם ליזאט התא לדגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, שטפו כלי סיכה 96X שלוש פעמים בתמיסה של 0.01% של חומר ניקוי לא יוני למשך 30 שניות, ולאחר מכן 30 שניות של ייבוש על מגבת נייר לכל כביסה, לפני הנחת כלי הסיכה בצלחת הדגימה של 96 בארות. לאחר 30 שניות, הרם את כלי הסיכה ישר כלפי מעלה והנח אותו ישר כלפי מטה על ממברנת ניטרוצלולוזה למשך 30 שניות.

לאחר חמש דקות של ייבוש, הנח את קרום הניטרוצלולוזה בתיקיית הפלסטיק השקופה לאחסון חשיפה למסך זרחן והדמיה על ידי הדמיית זרחן, כפי שהודגם.

כדי לכמת ולזהות חלבוני מטרה פוטנציאליים בתוכנת הניתוח המשויכת להדמיית הזרחן, פתח את קובץ ה-.gel של הלוחות החזותיים.

כדי להגדיר את הכתמים שיש לנתח, השתמש בפונקציה "ניתוח מערך" כדי להגדיר רשת של 12 עמודות על 8 שורות. כדי לתחום את הקצה החיצוני של כל הכתמים, הגדר עיגולים גדולים. ייצא את "נפח + רקע" ו"אזור" של העיגולים הגדולים המוגדרים לגיליון אלקטרוני, כדי לתחום את הנקודות הפנימיות הקטנות. הקטינו את העיגולים המוגדרים.

ייצא את "נפח + רקע" ו"אזור "של העיגולים הקטנים המוגדרים ושמור את כל הנתונים בגיליון האלקטרוני. מקם עיגולים כך שיחפפו לכתמים לפי הצורך, ושנה את גודלם למעט גדול יותר מהכתמים בפועל.

השתמש במשוואה כדי לחשב את שברי הכריכה בגיליון האלקטרוני והתווה את הנתונים. לאחר מכן, זהה את חלבוני הקישור הפוטנציאליים בבארות המציגים שברי קישור גבוהים בהשוואה לרוב הבארות האחרות.