פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד: טכניקה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי נוקלאוטיד חיידקי חלבונים תוך-תאיים קושרי שליח שני

חיידקים מייצרים שליחים שניים של נוקלאוטידים, NSMs - מולקולות איתות תוך-תאיות - בתגובה לגירויים מתאימים. מולקולות אלו נקשרות לחלבוני מטרה ומווסתות את תפקודי החיידקים.

כדי לזהות את חלבוני המטרה הללו באמצעות פעולה נימית רדיאלית דיפרנציאלית של בדיקת ליגנד, קח צלחת מרובת בארות עם ליזאט תאי חיידקים המכיל חלבונים מסיסים. חלבונים אלה נגזרים משיבוטי חיידקים שונים המבטאים ORFs בודדים - מסגרות קריאה פתוחות - בגנום, מה שמבטיח שלכל באר יש חלבון נפרד.

הוסף תערובת של גואנוזין טטרה ופנטה-פוספטים - NSMs המסומנים בזרחן רדיואקטיבי. מולקולות אלו נקשרות לחלבוני מטרה בליזאט. בעזרת כלי סיכה, אספו כמות שווה של נוזלים מכל באר. הנח את הכלי על קרום ניטרוצלולוזה כדי להפקיד את הנוזל ככתמים.

חלבוני מטרה נקשרים לממברנה באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות המונעות את הדיפוזיה שלהם. זה מבודד את ה-NSMs הקשורים עם תווית רדיו בנקודת היישום המרכזית. NSMs חופשיים מתפזרים רדיאלית עם הפאזה הנוזלית באמצעות פעולה נימית.

השתמש בהדמיית זרחן כדי לזהות את האותות הרדיואקטיביים ולקבל תמונה דיגיטלית של הכתמים. הגדירו את הכתמים באמצעות שני עיגולים. החיצוני מתאר את הפריפריה של ה-NSMs המפוזרים. המעגל הפנימי מייצג את ה-NSMs המבודדים.

חשב את שבר הקישור - עוצמת הרדיואקטיביות שזוהתה מהמעגל הפנימי על פני סך הרדיואקטיביות של הנקודה המפוזרת. א