בדיקת נקודה לכימות גנום נגיפי

כדי לכמת DNA ויראלי באמצעות בדיקת כתם הנקודות, התחל עם תרחיף DNA ויראלי מבודד. טפל בתמיסה אלקליין כדי לנטרל את הדנ"א הדו-גדילי לגדילים בודדים לצורך הכלאה לאחר מכן.

הרכיבו את מנגנון כתם הנקודות עם קרום ניילון רטוב מראש. טען DNA ויראלי מפורק ותמיסות DNA פלסמיד סטנדרטיות ליניאריות לבארות. החל ואקום מתאים, המאפשר העברת DNA חד-גדילית ויראלית יעילה בעלת מטען שלילי וקשירה על פני הממברנה הטעונה חיובית באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, ויוצרות דפוסי נקודות.

לאחר הריצה, שטפו את הממברנה עם מאגר נתרן ציטראט, מה שעוזר לשפר את רגישות הבדיקה. לאחר הייבוש, חשפו את הממברנה לאור אולטרה סגול, וקשרו את ה- DNA המוכתם לקרום.

הוסף לממברנה שבר DNA מפורק בחום, לא הטרולוגי ותרחיף בדיקת DNA רדיואקטיבי ספציפי לגנום הנגיפי עם תווית זרחן במאגר הכלאה. דגירה, הקלה על הכלאה.

שברי ה-DNA פועלים כסוכנים חוסמים, נקשרים לאזורי הממברנה הנותרים, וממזערים את קשירת הבדיקה הלא ספציפית. הגשושית הרדיואקטיבית מתכלאת עם הרצף המשלים על ה-DNA החד-גדילי הנגיפי.

יש לשטוף עם מאגר כביסה כדי להסיר בדיקות לא היברידיות. באמצעות מערכת סריקת תמונת הזרחן, כמת את האותות הרדיואקטיביים הנפלטים מהבדיקות הרדיואקטיביות המוכלאות לגנום הנגיפי על הממברנה, כדי לקבל אותות כתמי נקודות.

מהעקומה הסטנדרטית, ניתן להשתמש בעוצמת האות של כל נקודה על הממברנה כדי לחשב את כמות ה-DNA הנגיפי בדגימה.

כדי לבצע את בדיקת כתם הנקודות, הכן תקני DNA פלסמיד על ידי דילול DNA פלסמיד גנום וקטור AAV ל-10 ננוגרם למיקרוליטר במים או במאגר Tris-HCl. העבירו כמות של 25 מיקרוליטר של ה-DNA של הפלסמיד המדולל לצינור טרי, והפכו אותו לליניארי עם אנזים הגבלה מתאים בנפח תגובה של 50 מיקרוליטר למשך שעה.

הוסף 450 מיקרוליטר מים או TE לצינור המכיל את תקן ה-DNA של הפלסמיד המעוכל, וערבב היטב. לאחר מכן, העבירו 70 מיקרוליטר מתערובת זו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר עם 1,330 מיקרוליטר מים או TE כדי ליצור תקן פלסמיד מדולל.

כדי להגדיר את מנגנון כתם הנקודות, בעזרת מספריים, חותכים את קרום הספיגה לגודל מתאים למספר הדגימות והתקנים. משרים את הממברנה במים למשך 10 דקות, לפני שמניחים אותה על מנגנון כתם הנקודות. לאחר מכן, כסו את הבארות שאינן בשימוש. הוסף מים לבארות שאליהן יוטענו הדגימות. החל ואקום, משוך את המים דרך הבארות, בדוק אם יש שגיאות ואז הדק מחדש את הברגים. בדוק שוב במידת הצורך.

החל 400 מיקרוליטר מכל תקן DNA פלסמיד מדולל על כל באר והפעל ארבעה נתיבים של דילולים סטנדרטיים. השתמש בשתי מכסות נפרדות של התקציר הסטנדרטי, וטען כל אחת בכפולות. לאחר מכן, יש למרוח 200 מיקרוליטר לבאר של כל דגימת DNA נגיפית. הפעל ואקום עדין כדי לאגור את תמיסות ה-DNA דרך הבארות. לאחר מכן, לאחר שכל הבארות התרוקנו, שחרר את הוואקום על ידי כוונון השסתום התלת-כיווני.

הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסה אלקליין 1X לכל באר. לאחר מכן, המתן חמש דקות לפני החלת ואקום מחדש כדי לרוקן את הבארות. החל מחדש את הוואקום ופרק את מנגנון כתמי הנקודות. לאחר מכן, הסר את הממברנה ושטוף אותה עם 2X SSC.

הניחו את הממברנה על מגבת נייר נקייה, כשהצד הקשור ל-DNA פונה כלפי מעלה, כדי להסיר עודפי מאגר. השתמש בקישור צולב UV מתאים כדי להצליב UV את ה-DNA המוכתם לממברנה. הממברנה מוכנה כעת להכלאה.

הניחו את הממברנה בבקבוק הכלאה כשהצד הקשור ל-DNA כלפי מעלה. שטפו את הממברנה עם 5 עד 10 מיליליטר של מאגר הכלאה מחומם מראש, והשליכו את המאגר. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיליליטר של מאגר הכלאה מחומם מראש, והכניסו את הבקבוק לתנור הכלאה מסתובב המוגדר ל-65 מעלות צלזיוס. סובב את הבקבוק למשך חמש דקות לפחות.

הוסף במהירות את ה-DNA של הזרע המפורק ואת הבדיקה הרדיואקטיבית למאגר ההכלאה בבקבוק, ונער אותו במשך 10 שניות לערבוב. מחזירים את הבקבוק לתנור של 65 מעלות צלזיוס ומדגרים אותו בסיבוב בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות.

לאחר השלמת ההכלאה, עצור את הסיבוב, הסר את בקבוק ההכלאה ולאחר מכן שפך את תמיסת הבדיקה הרדיואקטיבית לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם מכסה אטם תקע חסין דליפות. כדי לשטוף את הממברנה, הוסף 20 עד 30 מיקרוליטר של מאגר כביסה מחומם מראש לבקבוק ההכלאה, וסובב אותו למשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.

לאחר הכביסה השלישית, הסר את הממברנה מבקבוק ההכלאה, ובעזרת מגבות נייר, הסר את המאגר העודף מהקרום. לאחר מכן, הנח את הממברנה במחזיק נייר פלסטיק שקוף. בעזרת מונה גייגר, בדוק את האותות הרדיואקטיביים על הממברנה.

[טרלינג]

לאחר חשיפת מסך הדמיית הזרחן שנמחק לממברנה, סרוק את המסך באמצעות מערכת סריקת תמונת זרחן, וקבל את הנתונים על עוצמת האות של כל נקודה.