ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

ספקטרוסקופיה של תנודות פלואורסצנטיות יכולה לקבוע את מצב האוליגומריזציה של חלבונים בדגימה.

כדי להתחיל, קח שקופית תא המכילה תמיסת מונומר חלבון עם תווית פלואורסצנטית. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי. מקד את קרן הלייזר על חלק קטן מהדגימה - הנפח הקונפוקלי - כדי לעורר את מונומרים החלבונים.

מולקולות החלבון מתפזרות פנימה והחוצה מהנפח הקונפוקלי עקב תנועה בראונית. תנועה זו גורמת לשינויים מהירים בעוצמת הקרינה, מה שמוביל לתנודות בעוצמת הקרינה לאורך זמן.

הוסף את חומר הדימריזציה - ליגנד דו-ערכי המסייע לשני מונומרים חלבונים להיקשר ובכך ליצור דימר. עקב דימריזציה, שתי תוויות פלואורסצנטיות מתאחדות ליצירת חלקיק יחיד, מה שמגביר את עוצמת הקרינה לכל חלקיק - הבהירות המולקולרית.

העלייה בבהירות המולקולרית עקב דימריזציה מגדילה את משרעת תנודות הקרינה - כאשר שתי תוויות פלואורסצנטיות נכנסות ויוצאות מהנפח הקונפוקלי יחד.

השג תמונות של הנפח הקונפוקלי לאורך זמן לפני ואחרי הוספת חומר הדימריזציה.

חשב את הבהירות של הפיקסלים הבודדים בתמונות הקונפוקליות, וקבל את עקומת הבהירות הממוצעת לאורך זמן.

הוספת החומר הדימריזציה מביאה לעלייה כפולה בבהירות עקב אותות הקרינה הכפולים מכל חלקיק, בעוד שהמספר הכולל של מולקולות החלבון נשאר זהה - מה שמעיד על היווצרות דימרים.

כדי להגדיר את מערך הלוחות הרב-באר, ראשית, הכינו תמיסה של 100 ננו-מולרי FKBP12 מטוהר באותו מאגר המשמש לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. סוניקט וצנטריפוגה עם סיבוב מהיר של 13,000 סל"ד למניעת היווצרות אגרגטים.

כעת, פיפטה 100 עד 200 מיקרוליטר מהחלבון המדולל לתוך תא תצפית בן 8 בארות עם תחתית זכוכית. הוסף את דימריזר BB לריכוזים סופיים של 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ו-500 ננו-מולר. כהפניה, הכינו תמיסה של 100 mVenus ננו-מולרית בלבד כדי להעריך את השפעות הצבירה והמשקעים הפוטנציאליות, ולשחזר ערך בהירות עבור המונומר עם אותן הגדרות רכישה.

ניתן להשתמש בכל מערכת קונפוקלית של מיקרוסקופ סריקת אור המצוידת בגלאים דיגיטליים או גלאים אנלוגיים מאופיינים היטב, ומסוגלת לשמור על זמן שהייה קבוע עבור כל פיקסל שנרכש. בחר את מטרת הטבילה במים לתיקון הצווארון המיועדת לספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי.

כעת הוסף טיפת מים למטרת טבילת המים לתיקון הצווארון. הרכיבו את תא התצפית בן 8 הבארות לבמה. הגדר את נתיב אלומת העירור על ידי הפעלת הלייזר של 514 ננומטר, והגדרתו בהספק של 20 עד 100 ננו-וואט ביציאה מהמטרה. הפעל גלאי HyD אחד. עדיפים גלאים המסוגלים לספירת פוטונים. בחר את חלון הפליטה בין 520 ל-560 ננומטר.

עבור מצב הרכישה, השתמש ב-16 על 16 פיקסלים.

הגדר את זמן השתהות הפיקסלים כך שזמן המסגרת יהיה ארוך יותר מפיזור החלבון, וזמן השהייה של הפיקסלים קצר בהרבה. זה תואם להגדרת זמן השהות לכ-13 מיקרו-שניות עבור המערכת המשמשת בהדגמה זו.

הגדר את חור הסיכה ביחידת Airy אחת לפליטה מתאימה של כ-545 ננומטר. בחר את מצב הרכישה בזמן xy ובחר את מספר הפריימים שיש לרכוש לכל רכישה ובכן. כעת, הגדר את גודל הפיקסלים לכ-120 ננומטר.

אם המערכת מצוידת במצב תפוקה גבוהה, הצג את הקואורדינטות של כל באר ואת מספר הרכישות לבאר כדי להפוך את התהליך לאוטומטי. אם המערכת מצוידת במערכת זלוף, טען את פתרון ה-BB ותכנת את הזלוף כך שיתחיל מיד לאחר המסגרת ה-5,000 כדי להעריך את הקינטיקה של הדימריזציה תוך רכישת 10,000 תמונות.

בחר את הבאר הנכונה והתמקד בפתרון. לאחר מכן, התחל את הרכישה ושמור את ערימת התמונות המתקבלת בפורמט TIFF.