ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר הומו-אוליגומריזציה של חלבונים

ספקטרוסקופיה של תנודות פלואורסצנטיות יכולה לקבוע את מצב האוליגומריזציה של חלבונים בדגימה.

כדי להתחיל, קח שקופית תא המכילה תמיסת מונומר חלבון עם תווית פלואורסצנטית. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי. מקד את קרן הלייזר על חלק קטן מהדגימה - הנפח הקונפוקלי - כדי לעורר את מונומרים החלבונים.

מולקולות החלבון מתפזרות פנימה והחוצה מהנפח הקונפוקלי עקב תנועה בראונית. תנועה זו גורמת לשינויים מהירים בעוצמת הקרינה, מה שמוביל לתנודות בעוצמת הקרינה לאורך זמן.

הוסף את חומר הדימריזציה - ליגנד דו-ערכי המסייע לשני מונומרים חלבונים להיקשר ובכך ליצור דימר. עקב דימריזציה, שתי תוויות פלואורסצנטיות מתאחדות ליצירת חלקיק יחיד, מה שמגביר את עוצמת הקרינה לכל חלקיק - הבהירות המולקולרית.

העלייה בבהירות המולקולרית עקב דימריזציה מגדילה את משרעת תנודות הקרינה - כאשר שתי תוויות פלואורסצנטיות נכנסות ויוצאות מהנפח הקונפוקלי יחד.

השג תמונות של הנפח הקונפוקלי לאורך זמן לפני ואחרי הוספת חומר הדימריזציה.

חשב את הבהירות של הפיקסלים הבודדים בתמונות הקונפוקליות, וקבל את עקומת הבהירות הממוצעת לאורך זמן.

הוספת החומר הדימריזציה מביאה לעלייה כפולה בבהירות עקב אותות הקרינה הכפולים מכל חלקיק, בעוד שהמספר הכולל של מולקולות החלבון נשאר זהה - מה שמעיד על היווצרות דימרים.

כדי להגדיר את מערך הלוחות הרב-באר, ראשית, הכינו תמיסה של