בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 6:30 דק׳ • July 8th, 2025
אבולוציה שיטתית של ליגנדים על ידי העשרה אקספוננציאלית, SELEX, מאפשרת זיהוי של רצפי RNA קושרי חלבון.
ראשית, השג מאגר RNA אקראי המכיל RNA עם תוויות רדיו עם רצפים אקראיים המתקפלים למבנים ספציפיים ביותר. דגירה עם חלבון המטרה. החלבון נקשר למולקולות RNA עם רצפים ספציפיים ומבנים תלת מימדיים, בעוד RNA לא ספציפי נשאר לא קשור.
העבירו את התערובת דרך פילטר ניטרוצלולוזה. RNA לא קשור עובר דרך נקבוביות המסנן, בעוד קומפלקסים של חלבון RNA נשארים נשמרים.
קוצצים את המסנן המכיל קומפלקס חלבון RNA לשברים. חזור על אינטראקציה של RNA-חלבון על ידי דגירה של מאגר ה-RNA עם ריכוז חלבון מטרה מופחת - מה שמאפשר רק קשירת רצף בעל זיקה גבוהה, בעוד שרצפים בעלי זיקה נמוכה אינם מצליחים להיקשר.
טען תערובת זו על ג'ל פוליאקרילאמיד ובצע אלקטרופורזה. קומפלקסי חלבון ה-RNA נודדים לאט דרך הג'ל בהשוואה ל-RNA לא קשור בעל זיקה נמוכה. הדמיית ג'ל רנטגן מראה שינוי פס המתאים למיקום קומפלקס חלבון ה-RNA.
פורסים את חלק הג'ל המכיל קומפלקס. הוסף פרוטאינאז K לשברי המסנן ולפרוסות הג'ל, מעכל את החלבונים ומשחרר RNA מהמתחם. הוסף פנול-כלורופורם וצנטריפוגה, המפרידים את ה- RNA מהחלבונים המעוכלים.
מערבבים את הסופרנטנט המכיל RNA עם נתרן אצטט ואתנול. צנטריפוגה כדי לזרז את ה-RNA. השעו במים ללא RNase. תמלול הפוך של ה-RNA ל-DNA משלים ו-PCR מגביר את ה-DN
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים