בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

אבולוציה שיטתית של ליגנדים על ידי העשרה אקספוננציאלית, SELEX, מאפשרת זיהוי של רצפי RNA קושרי חלבון.

ראשית, השג מאגר RNA אקראי המכיל RNA עם תוויות רדיו עם רצפים אקראיים המתקפלים למבנים ספציפיים ביותר. דגירה עם חלבון המטרה. החלבון נקשר למולקולות RNA עם רצפים ספציפיים ומבנים תלת מימדיים, בעוד RNA לא ספציפי נשאר לא קשור.

העבירו את התערובת דרך פילטר ניטרוצלולוזה. RNA לא קשור עובר דרך נקבוביות המסנן, בעוד קומפלקסים של חלבון RNA נשארים נשמרים.

קוצצים את המסנן המכיל קומפלקס חלבון RNA לשברים. חזור על אינטראקציה של RNA-חלבון על ידי דגירה של מאגר ה-RNA עם ריכוז חלבון מטרה מופחת - מה שמאפשר רק קשירת רצף בעל זיקה גבוהה, בעוד שרצפים בעלי זיקה נמוכה אינם מצליחים להיקשר.

טען תערובת זו על ג'ל פוליאקרילאמיד ובצע אלקטרופורזה. קומפלקסי חלבון ה-RNA נודדים לאט דרך הג'ל בהשוואה ל-RNA לא קשור בעל זיקה נמוכה. הדמיית ג'ל רנטגן מראה שינוי פס המתאים למיקום קומפלקס חלבון ה-RNA.

פורסים את חלק הג'ל המכיל קומפלקס. הוסף פרוטאינאז K לשברי המסנן ולפרוסות הג'ל, מעכל את החלבונים ומשחרר RNA מהמתחם. הוסף פנול-כלורופורם וצנטריפוגה, המפרידים את ה- RNA מהחלבונים המעוכלים.

מערבבים את הסופרנטנט המכיל RNA עם נתרן אצטט ואתנול. צנטריפוגה כדי לזרז את ה-RNA. השעו במים ללא RNase. תמלול הפוך של ה-RNA ל-DNA משלים ו-PCR מגביר את ה-DNA.

חזור על מספר סבבים של הפרדה מבוססת פילטר ומבוססת ג'ל כדי להשיג מאגר של רצפי DNA ספציפיים לחלבון מטרה.

כדי לקשור חלבון ו-RNA בנפח תגובה של 100 מיקרוליטר, הכינו תחילה 10 מילי-מולרי טריס-הידרוכלוריד ב-pH 7.5, המכיל 50 מילי-מולרי אשלגן כלורי, מילי-מולרי DTT אחד, 0.09 מיקרוגרם למיקרוליטר אלבומין בסרום בקר, 0.5 יחידות למיקרוליטר RNAsin, 0.15 מיקרוגרם למיקרוליטר tRNA ו-1 מילי-מולרי EDTA. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של חלבון רקומביננטי PTB ו -10 מיקרוליטר RNA מהמאגר המתאים.

הנח את הצינורות המכילים את תגובות הקישור בגוש טמפרטורה למשך כ-30 דקות בחום של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פרקו את ה-RNA הקשור מה-RNA הלא קשור באמצעות ארבעה סבבים של בחירה והגברה. ראשית, סנן את הדגימה של 100 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר דרך מסנן ניטרוצלולוזה המחובר לסעפת ואקום. קומפלקס חלבון ה-RNA נשאר על המסנן.

בעזרת סכין גילוח סטרילי, קוצצים את המסנן לשברים ומכניסים אותם לצינור צנטריפוגה. טבלו את חלקי המסנן במאגר חלבון K והניחו אותו על למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה כדי לשחזר את ה-RNA.

כדי לנטרל את דגימת ה-RNA, הוסף נפח שווה של פנול-כלורופורם, מערבולת. ואז צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השג את השלב המימי, וחלץ שוב עם כלורופורם. לאחר מכן, ערבבו את הסופרנטנט עם נפח 1/10 של 3 נתרן אצטט מולארי ב-pH 5.2 ושניים עד שלושה נפחים של אתנול מוחלט.

השאירו את הצינור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה אותו במהירות גבוהה למשך 10 דקות. חזור על שלבי הכביסה והייבוש עם 70% אתנול, והמיס את ה-RNA במים שטופלו ב-DEPC. לאחר הסיבוב הראשון של בדיקת קשירת המסנן, בצע שלושה סבבים נוספים.

לאחר מכן, בצע שני סבבים של שעתוק, קשירה והגברה כדי להפריד את שברי ה-RNA הקשורים לחלבון מהשברים הלא קשורים. יצוק מראש ג'ל פוליאקרילאמיד מקורי של 5% עם יחס של 60 ל-1 אקרילאמיד ביסקרילאמיד במאגר TBE של 0.5x. לאחר מכן, הגדר את תגובת הקישור של RNA-חלבון.

מניחים את הג'ל במכשיר אלקטרופורזה מלא במאגר TBE 0.5x בחדר קר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש למרוח 250 וולט למשך 15 דקות, ולזרוק את תגובת הקישור לבארות שונות. לאחר מכן, בנוסף, פרקו את ה-RNA הקשור מה-RNA הבלתי קשור על ידי הפעלת האלקטרופורזה ב-250 וולט למשך שעה עד שעתיים.

לאחר מכן, חשפו את הג'ל לסרט רנטגן וזהו את מיקום ה-RNA הקשור באמצעות אוטורדיוגרפיה. חותכים את פרוסת הג'ל עם ה- RNA הקשור ומכניסים אותה לצינור. מועכים את פרוסת הג'ל ודוגרים במאגר הפרוטאינאז K למשך שלוש שעות או למשך הלילה. חזור על המיצוי עם פנול-כלורופורם וכלורופורם, כפי שתואר קודם לכן. לסנתז cDNA מה-RNA המומס.

הכן 20 מיקרוליטר של תגובה, כולל שני מיקרוליטר של מאגר 10x RT, שני מיקרוליטר של AMV reverse transcriptase, 1 מיקרוליטר של פריימר הפוך, 5 מיקרוליטר מים ו-10 מיקרוליטר של ה-RNA המומס. דגירה בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

הגבירו את ה-cDNA באמצעות 20 עד 25 מחזורי PCR כפי שתואר קודם לכן. חזור על תהליך סינתזת RNA, קשירת חלבון והפרדה של שברים קשורים לחלבון ולא קשורים.