מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך חיוני לחקר היווצרות פקקת מיקרו-וסקולרית

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-חיונית שימושית לחקר האינדוקציה הפוטוטוקסית של היווצרות פקקת - קריש דם - באתר פגיעה מיקרו-וסקולרית.

התחל בלקיחת עכבר חסר שיער מורדם שהוזרק לו פוליסכריד פוטוטוקסי עם תווית פלואורופור. הנח את העכבר במצב שכיבה על משטח חימום כדי לשמור על הטמפרטורה הפיזיולוגית לזרימת דם תקינה.

הנח את החלק האפיקלי של האוזן מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך-חיוני. עם עירור עם אור, הפלואורופור פולט פלואורסצנטיות - מה שמאפשר ניטור של זרימת הדם המיקרו-וסקולרית. הגדל את עוצמת האור כדי לגרום להיווצרות פקקת.

הפלואורופור סופג את האור בעוצמה גבוהה ומגיב עם חמצן מולקולרי ליצירת מיני חמצן תגובתיים. מולקולות אלו גורמות למתח חמצוני בתאי האנדותל, ובכך מובילות לנזק לתאים ולחשיפה של המטריצה התת-אנדותלית.

התאים הפגועים משחררים מתווכים טרומבוטיים המגשרים בין הקולגן החשוף במטריצה התת-אנדותלית לבין טסיות הדם במחזור הדם, הנקשרות למתווכים באמצעות קולטנים ספציפיים.

הקישור מפעיל את טסיות הדם, וגורם לשחרור מולקולות אפקטור המפעילות ומגייסות טסיות דם אחרות במחזור לאתר הפציעה. חלבוני פיברינוגן במחזור נקשרים לקולטני הפיברינוגן על הטסיות המופעלות - ומקשרים אותם ליצירת פקק טסיות דם.

דמיין את זרימת הדם המוגבלת כדי לאשר את פקק הטסיות - השלב העיקרי של היווצרות פקקת.

הנח את החיה על הרציף מתחת לסטריאומיקרוסקופ. השתמש בהגדלה של פי 10. למיקרוסקופיה של האוזן הימנית, הכינו את וריד הצוואר השמאלי על ידי יצירת חתך של 5 מילימטר בעור הצוואר בכיוון גולגולת. לאחר מכן, השתמש במיקרו-מלקחיים ובמיקרו-מספריים כדי לנתח את הרקמה התת עורית. לאחר מכן, שחרר את הווריד מהאדוונטיטיה שלו מבלי לגעת בכלי.

כעת, השתמש במזרק האינסולין שהוכן בעבר להזרקת הצבע הפלורסנט. תפוס בזהירות את דופן הכלי בעזרת המיקרו-מלקחיים מבלי לנקב את הווריד. יש לחדור לדופן הכלי הנפוח עם מחט המזרק, ולהזריק FITC-דקסטרן לווריד. משוך את המחט ועצור את הדימום באמצעות צמר גפן. הימנע מזיהום דם וצבע של האוזן.

העבירו את החיה על צלחת החימום לקונסטרוקציית זכוכית אקרלית עם חריץ לצלחת החימום ומישור בגובה 0.5 ס"מ למיקום האוזן. תקן את החיה במצב נוטה על צלחת החימום באמצעות תחבושת דבק. הנח את הסחוס הקמור בבסיס האוזן ליד המישור לאוזן כך שניתן יהיה למקם את החלק האפיקלי של האוזן שטוח על המישור. הוסף טיפה אחת של אקווה בטמפרטורת החדר לצלחת הזכוכית האקרלית. בעזרת צמר גפן, ספגו את טיפת האקווה ותנו לכוחות נימיים לחבר את מישור האוזן לזכוכית האקרלית.

יש למקם את האפרכסת שטוחה ככל האפשר, למרות שהסחוס מעניק לאפרכסת צורה קמורה. לכן, יש למקם רק את החלק הדיסטלי הגמיש יותר של האפרכסת על צלחת הזכוכית האקרלית. כדי למנוע נזק לרקמות ובזבוז של הצבע הקפוא, גע באוזן כמה שפחות עם המלקחיים.

לאחר מכן, הוסף טיפה אחת של אקווה לצד הגבי הקמור של האוזן. הניחו בזהירות כיסוי אחד על האוזן מבלי לדחוס את כלי הבסיס הנכנסים לאוזן. השתמש בצמר גפן כדי להסיר כמה שיותר אקווה מתחת לכיסוי, כדי למזער את המרחק בין הכיסוי לכלי המטרה של האוזן.

התחל בהתאמת המיקרוסקופ הקרינה התוך-חיוני להדמיה של FITC-dextran. העבירו את החיה המוכנה לשולחן המיקרוסקופ הקרינה התוך-חיוני. באמצעות הגדלה של פי 5, פי 10 ו-20X ועוצמת אור של 20%, חפש כלי ורידי בקוטר של 50 עד 60 מיקרון ועם זרימת דם אנטרוגרדית.

הוסף טיפה אחת של מים בטמפרטורת החדר לכיסוי לטבילה במים של יעד ההגדלה פי 63. מיד לאחר מריחת טיפת המים, התחל להקליט את הכלי למשך 20 שניות להערכת הבסיס של הקוטר וזרימת הדם. התחל השראת פקקת 5 דקות לאחר הזרקת FITC-dextern. לשם כך, העלו את עוצמת האור ל 100%.

במהלך השראת פקקת פוטוטוקסית, סגור את פתח המיקרוסקופ למשך 2 שניות תוך פרק זמן של 30 שניות כדי לבדוק אם יש חסימה של זרימת הדם. אם זרימת הדם נמשכת, פתח שוב את הצמצם. הכלי מסווג כחסום אם הזרימה עומדת ללא תנועה במשך 30 שניות או יותר, או אם זרימת הדם נסוגה. בחר וחסום חמישה כלי דם לכל אוזן תוך פרק זמן של שעה לאחר הזרקת FITC-dextern.