Name: מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: למד שיטה למדידת עומס חיידקי ויצירת תלייה תאית בודדת מכבד וטחול של עכברים נגועים ב-Listeria monocytogenes. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסון והשוואה בין זני עכברים רגישים ועמידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות אנה Walduck, כריסטינה לחיים, סטיוארט Berzins, דייל גודפרי, Yifan Zhan ויונתן Wilksch עבור ייעוץ ריאגנטים. עבודה זו מומנה על ידי סוכרת נעורים Research Foundation (1-2008-602) ואת הבריאות האוסטרלית הלאומית המועצה למחקר רפואי (575,552). NW נתמך על ידי פרס לתארים מתקדמים האוסטרלי. OW נתמך על ידי רייט RD אחוות מן האוסטרלי בריאות ממלכתי המועצה למחקר רפואי.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ליסטריה הוא אחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לאפיון תגובות חיסוניות של המאכסן לחיידקים תוך-תאיים6הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר למדוד את העומס החיידקי ואת התגובות של תאי מערכת החיסון בתוך אותה רקמה של עכבר נתון. מדידה כפולה זו של רקמה ספציפית עבור כל עכבר נגוע מאפשרת השוואות חסונות יותר בתוך קבוצות עכברים וביניהן (המייצגות זני עכברים שונים או נקודות זמן שונות לאחר ההדבקה). בעוד ש- ליסטריה ניתן להשתמש גם בהדבקה באמצעות מתן פה כדי לחקור תגובות חיסוניות בעכברים, אך לעיתים קרובות נעשה שימוש בהדבקה באמצעות הזרקה תוורידית מכיוון ש: 1) היא מבטיחה הגעה מהירה ויעילה לזרם הדם; 2) היא מביאה להדבקה סיסטמית מסונכרנת ועקבית; ו-3) ה- Mus המין נושא מוטציה בגן המקודד לרספטור E-cadherin, אשר מגבילה ליסטריה הדבקה באמצעות מתן דרך הפה (מוטציה זו משפיעה על ליסטריההיכולת להיקשר לקולטן E-cadherin של העכבר ולחצות ביעילות את הריפוי האפיתליאלי של דרכי העיכול)16-18.
בפרוטוקול זה ישנם מספר שלבים קריטיים. ראשית, יש להפיק את מלאי האינוקולום של Listeria מתרבית HBA טרייה שגדלה במהלך הלילה כדי להבטיח חיוניות וארגוניות (virulence). שנית, חשוב לקבוע במדויק את ריכוז ה-CFU של האינוקולום לפני ואחרי ההזרקה לכל העכברים, כדי להבטיח שריכוז ה-CFU אינו שונה משמעותית בין העכבר הראשון לאחרון שהוזרקו. שלישית, ההזרקה של Listeria לווריד הזנב חייבת להיות עקבית עבור כל העכברים. לבסוף, יש לבצע פרפוזיה לכבד כדי לרוקן לוקוציטים שאינם תושבי הכבד, זאת על מנת להבטיח מדידה מדויקת של תאי מערכת החיסון בתוך הכבד ולא של לוקוציטים העוברים דרכו בדם הפריפרי. אם שלבים אלו לא יבוצעו בהצלחה, הדבר עלול להוביל לשונות לא רצויה בעומס החיידקי ו/או בתגובות החיסוניות בין עכברים בודדים שהודבקו ב-Listeria.
שתי מגבלות של פרוטוקול זה הן מיומנות החוקר בהדבקת עכברים באמצעות הזרקה תוך-ורידית והגילוי של העומס החיידקי ברקמות. אם אדם אחד מזריק מספר רב של עכברים, חיוניות ה-Listeria (כלומר, ריכוז CFU) עשויה לרדת עם הזמן לאחר הפשרת האינוקולום הקפוא (למשל, &gt;2 שעות בין הזרקת העכבר הראשון לאחרון). על החוקר לקבוע כמה עכברים הוא/היא יכולים להזריק לפני שהאינוקולום יפגע. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שלא ניתן למדוד במדויק עומס Listeria הנמוך מ-100CFU/organ בשל הכמויות הקטנות יחסית של הומוגנאט רקמה שזורע (למשל, איור 3 מציין כי 100CFU/organ הוא גבול הגילוי). כדי למדוד ערכים נמוכים יותר של CFU/organ בדיוק רב יותר, ניתן לזרוע כמות גדולה יותר של הומוגנאט הרקמה (עד 0.5mL לצלחת, ניתן להשתמש במספר צלחות) כך שחלק גדול יותר של הרקמה יידגם לצורך גילוי Listeria. אם אין Stomacher זמין, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות להומוגניזציה של הרקמה, כגון שימוש בהומוגניזטור רקמות, עבור שלבים 7.1-7.2. מהבחינה המעשית, אם המקום באינקובטור של 37°C מוגבל לתרבית דגימות רקמה מעכברים מודבקים, ניתן להדגיר צלחות תרבית HBA בטמפרטורת החדר למשך 2-3 ימים (המושבות יגדלו לאט יותר בטמפרטורת החדר). עם זאת, אין להשתמש בטמפרטורת החדר בעת גידול תרביות להכנת מלאי Listeria קפוא.
פרוטוקול זה מספק גישה בסיסית לאפיון זיהום ב- Listeria בעכברים, וניתן להשתמש בו עם זני Listeria אחרים מלבד EGD. בנוסף לכבד ולטחול, ניתן להפיק תרחיפי תאים בודדים גם מקשרי לימפה. בכל אחד מהמקרים, ניתן להשתמש בתרחיפי תאים בודדים אלו למגוון ניתוחים, כולל מדידת תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, וסטימולציה in vitro של תאי חיסון ממוינים. לאחר שליטה בטכניקות הבסיסיות, ניתן להתאים פרוטוקול זה גם לצורך בידוד תאי T ספציפיים ל-Listeria19, אפיון תאים דנדריטיים20, או ביצוע דילול (depletion) של תאי חיסון בנקודות זמן מסוימות לאחר ההדבקה21,22, כדי לאפיין באופן מעמיק יותר את התגובה החיסונית בעכברים המודבקים ב- Listeria.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> דם על סוסים אגר בסיס מס &#39;2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> הכנת בסיס אגר עבור צלחות HBA </td></tr><tr><td> דם על סוסים (defibrinated) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> הוסף 5-10% לבסיס אגר </td></tr><tr><td> הלב והמוח עירוי (BHI), מרק (10 מ&quot;ל) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> הלב והמוח עירוי התקשורת מיובש </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96-היטב לתחתית צלחת שטוחה </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> תא 70 מיקרומטר מסננת </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי קטנים </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> במחוך 80 biomaster מעבדה מערכת </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שקיות פלסטיק במחוך </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS חיץ </td><td></td><td></td><td> 0.1% (w / v) בסרום שור אלבומין PBS </td></tr><tr><td> משקה ביד Percoll (33.75% בשנת Percoll PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, PBS 10x 3.75mL, 62.5mL 1x PBS עושה Percoll 100 מ&quot;ל איזוטוני </td></tr><tr><td> TAC הצפת </td><td></td><td></td><td> טריס 17mm, אמוניום כלוריד 140mM במים מזוקקים </td></tr><tr><td> FCS / EDTA חיץ </td><td></td><td></td><td> עגל בסרום עוברי 10mm עם EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA חיץ </td><td></td><td></td><td> FACS חיץ + EDTA 5mm </td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> סיגמא </td><td> T6146 </td><td> 0.4% (w / v) ב-PBS, מסנן מעוקר </td></tr><tr><td> 2ml Cryovial </td><td> גריינר ביו אחת </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 מזרק אינסולין gauge/1mL </td><td> Terumo מוצרים רפואיים </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> מחט </td><td> Terumo מוצרים רפואיים </td><td> NN-2516R (25 גרם 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> Terumo מוצרים רפואיים </td><td> SS-01T (1mL), SS-053 (5 מ&quot;ל), SS-10S (10 מ&quot;ל) </td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

חיידקי ליסטריה (ליסטריה) הוא הפתוגן גראם חיוביים שברשות תאיים 1. מחקרים מאוס בדרך כלל להעסיק הזרקה תוך ורידית של ליסטריה, שתוצאתה זיהום מערכתי 2. לאחר ההזרקה, ליסטריה במהירות מפיצה את הטחול והכבד בשל ספיגת ידי + תאים דנדריטים ותאי CD8α Kupffer 3,4. Phagocytosed פעם, חלבונים חיידקי ליסטריה שונים לאפשר להימלט phagosome, לשרוד בתוך cytosol, ואת להדביק תאים שכנים 5. במהלך שלושת הימים הראשונים של זיהום, שונה תאים חיסוניים מולדים (כגון מונוציטים, נויטרופילים, תאים NK, תאים דנדריטים) לתווך מנגנוני bactericidal כי למזער את התפשטות ליסטריה. CD8 + T תאים מגויסים לאחר מכן אחראי על פינוי עתידי של ליסטריה מהמחשב המארח, בדרך כלל תוך 10 ימים של זיהום 6. פינוי מוצלח של ליסטריה מן עכברים נגועים תלוי תחילת המתאים התגובות מארח החיסון 6. יש מגוון רחב של רגישויות בין זנים טהורים עכבר 7,8. באופן כללי, בעכברים עם רגישות מוגברת לזיהום ליסטריה מסוגלים פחות לשלוט התפשטות חיידקים, הוכחת עומס חיידקי מוגבר ו / או אישור מושהה לעומת עכברים עמידים. מחקרים גנטיים, כולל ניתוחים הצמדה עכבר זנים בנוקאאוט, זיהו גנים שונים אשר משפיע על וריאציה רצף התגובות מארח לזיהום ליסטריה 6,8-14. קביעת והשוואה של קינטיקה זיהום בין זנים שונים העכבר ולכן שיטה חשובה לזיהוי גורמים גנטיים מארח שתורמים התגובות החיסוניות נגד ליסטריה. השוואה בין תגובות המארח ליסטריה זנים שונים גם דרך יעילה לזהות גורמים ארסיות חיידקים שעשויים לשמש מטרות פוטנציאליות עבור טיפול אנטיביוטי או עיצוב החיסון. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה למדידת עומס בקטריאלי (יחידות המושבה להרכיב [CFU] לכל רקמה) והכנת תא בודד השעיות של הכבד והטחול לניתוח FACS של התגובה החיסונית של ליסטריה עכברים נגועים. שיטה זו שימושית במיוחד עבור אפיון ראשוני של זיהום ליסטריה בשנת זנים עכבר הרומן, כמו גם השוואה של התגובה החיסונית בין זנים שונים העכבר נגוע ליסטריה. אנו משתמשים חיידקי ליסטריה EGD זן 15, כאשר בתרבית על אגר דם, תערוכות אזור הילה מאפיין סביב המושבה כל בשל המוליזה β-1 (איור 1). עומס חיידקים התגובה החיסונית ניתן לקבוע בשלב-עת לאחר זיהום על ידי homogenate culturing רקמות על צלחות אגר דם והכנת תא השעיות רקמות לניתוח FACS באמצעות פרוטוקולים כמתואר להלן. היינו לציין כי אנשים הם immunocompromised או בהריון לא צריכה להתמודד עם ליסטריה, ואת הרלוונטיות מוסדיים biosafety ועדה וניהול חיה מתקן יש להתייעץ לפני העבודה מתחילה.

חיידקי ליסטריה הוא אורגניזם מודל ללימוד המערכת החיסונית ורגישות גנטית תאיים לחיידקים בעכברים. שיטה זו מאפשרת למדוד עומס חיידקים ליצור תא בודד השעיות של הכבד והטחול מעכברים לניתוח FACS לקבוע שינויים בתאי המערכת החיסונית עקב זיהום ליסטריה.

*Listeria monocytogenes* (*Listeria*) הוא פתוגן תוך-תאי פקולטטיבי גרם-חיובי1. מחקרי עכברים משתמשים בדרך כלל בהזרקה תוך-ורידית של...

סרטון זה מדגים שיטה למדידת העומס הבקטריאלי ולהפקה וניתוח של תרחיפי תאים בודדים מכבד וטחול של עכברים. תחילה, מוכן אינוקולום של listeria ומוזרק לווריד של העכברים. לאחר מכן, נאספים דם, כבד וטחול מעכברים שהורגזו בנקודות זמן נבחרות.תגסוסי תאים בודדים מוכנים מרקמות שנאספו ומהומוגנאטים של רקמות שגודלו על מצעי agar עם דם סוס. ניתן לאחר כך לנתח את תגסוסי התאים שהתקבלו כדי לבחון את החיות ואת תכולת התאים החיסוניים באמצעות אנליזת fax, בעוד שהעומס החיידקי נקבע על בסיס יחידות יוצרות מושבות (colony forming units). שיטה זו יכולה לסייע באפיון תגובות חיסוניות לזיהום בסטרואידים, כגון אלו שבין זני mal רגישים לעמידים, תוך קביעה סימולטנית של העומס החיידקי באיברים מזוהמים.התחילו את הפרוצדורה בהכנת תרבית ה-listeria לריכוז הרצוי; הוראות לתרבית, אחסון והכנה של listeria ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב המצורף. ברגע שהתרבית מוכנה, העבירו שתי מנות של 100 µL למבחנות מיקרו-פיוז סטריליות המכילות 900 µL של PBS כדי ליצור דילול של 1:10, לאחר מכן העבירו 100 µL מכל דילול לצלחות אגר דם סוס (HBA) ופזרו את התרבית ביסודיות בעזרת פוזר סטרילי לצורך ספירת יחידות יוצרות מושבות (CFU), ולאחר מכן דגרו את הצלחות כשהן הפוכות בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. לאחר מכן, העבירו את העכברים לכלוב נקי.הנח את הכלוב במרחק של 50 סנטימטרים מתחת למנורת אינפרה-אדום של 250 וואט למשך חמש דקות, כדי להבטיח הרחבה של וריד הזנב. דבר זה מאפשר ויזואליזציה טובה יותר במהלך ההזרקה. כאן, זן העכברים העמיד לליסטריה, C 57 black six, וזן העכברים הרגיש לליסטריה, Valve C, יוזרקו. ערבב בעדינות את תרחיף הליסטריה על ידי היפוך המבחנה מספר פעמים.לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 ml עם מחט בכילייב (gauge) 27 להזרקה של 200 µL לכל עכבר. ודאו כי בועות אוויר בתוך המזרק הוסרו לפני ההזרקה. הניחו את העכבר במכשיר קיבוע.לאחר מכן, איתרו את הווריד הצדי בזנב העכבר על ידי זיהוי עורק הזנב, הנמצא במרכז הצד הגבי. לאחר מכן, סובבו את הזנב מעט לכיוון הצד כדי לזהות את הווריד. נגבו בעדינות את הזנב עם מטלית 70% ethanol והזריקו לאחר הוצאת המזרק.הפעילו לחץ קצר על פצע הכניסה באמצעות ריבוע גזה סטרילי. שימו לב כי זיהוי וריד הזנב בעכברים בעלי פרווה שחורה קשה הרבה יותר לאחר ההזרקה. החזירו את העכבר לכלובו לאחר ההזרקה לכל העכברים בלוח, והדגירו את שארית התמיסה להערכת מספר יחידות יוצרות מושבות (colony forming unit counts).כפי שנעשה ביום הקודם, ספרו את מספר המושבות וקבעו את ריכוזי האינוקולום של ה-listeria לפני ההזרקה ואחריה. ההילה האופיינית המקיפה מושבות בודדות, כפי שמוצג כאן, נובעת מ-beta hemolysis. לאחר קביעת הספירות שלפני ההזרקה ואחריה, חשבו את ממוצע יחידות יוצרות מושבות (CFU) על ידי חיבור ספירות יחידות יוצרות מושבות שלפני ההזרקה ואחריה וחילוקן בשניים.לבסוף, בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה, אספו דם ודגמו את הכבד והטחול מעכברים לאחר הדשייה (euthanasia). אם תבוצע אנליזת fC, יש לבצע פרפוזיה לכבד לפני הסרתו כדי להוציא את הדם, לבצע דימום מהלב מיד לאחר ההדשייה ולאסוף כמה שיותר דם לשפופרת איסוף מתאימה. כדי לבצע פרפוזיה לכבד, ראשית פתחו את חלל הבטן והסירו והשליכו את כיס המרה.הוריד הראשי התחתון (vena cava inferior) הוא וריד העובר במקביל לעמוד השדרה ומעביר דם מהחלק התחתון של הגוף, כולל מהכבד, אל הלב. בעזרת מספריים, חתכו את הוריד ממש מתחת ללב כדי ליצור פתח ליציאת נוזל הפרפוזיה. לאחר מכן, הפנו את אוני הכבד לכיוון הראש והזיזו את המעיים ימינה כדי לחשוף את הוריד השערני (hepatic portal vein), המוזן אל בסיס הכבד.מהצד הימני התחתון, הכניסו מחט כפופה בכישור 26 ובאורך של חצי אינץ' לווריד השער הכבדי (hepatic portal vein) והזריקו 10 milliliters של PBS. לאחר הזרקה של מיליליטר אחד עד שניים של PBS, צבע הכבד ישתנה מאדום כהה לחום בהיר. התמיסה המוזרקת תצא דרך הווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) החתוך. פרפוזיה של הכבד מבטיחה שהתאים שנאספו הם מהכבד ולא מהדם הזורם.בשלב הבא, הוצא את הכבד שעבר פרפוזיה מחלל הגוף של העכבר והטבל אותו בשפופרת עם תמיסת facts על קרח. לאחר מכן, הוצא את הטחול והנח אותו על קרח לעיבוד באופן דומה לזה המתואר בסעיף הבא. כדי להפיק תרחיפי תאי כבד בודדים מהכבד, התחל בהעברת הכבד שעבר פרפוזיה מתמיסת fax למסנן תאים של 70 micron המונח בתוך צלחת פטרי של 60 millimeter.באמצעות בוכנה של מזרק בנפח חמישה ליטר, דחפו את הרקמה דרך מסנן התאים אל תוך צלחת פטרי. העבירו את תרחיף התאים הבודדים למבחנה קונית עם מכסה הברגה בנפח 50 מיליליטר והביאו את הנפח הכולל ל-40 מיליליטר, בעזרת cold fax buffer.ערבבו את תרחיף התאים באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הפרידו מנה של 1 mL לצורך קביעת העומס הבקטריאלי. בהמשך הפרוצדורה, הניחו את המבחנה בנפח 50 mL בצנטריפוגה והשקיעו את התאים על ידי סבוב של 500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר השליפת של הנוזל העליון (supernatant), חזור על שלב שטיפה זה על ידי השהיית המשקע ב-40 milliliters של בופר fax קר וסבב במערך צנטריפוגי. שוב, השהה את המשקע ב-20 milliliters של תמיסת isotonic per hole בטמפרטורת החדר וסבב את תמיסת התאים בצנטריפוגה ב-700 ×g למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.בעקבות הסבוב, שכבה דמוית דיסק של הפטוציטים תצוף על גבי ה-perol והלוקוציטים ישקעו שוב בתחתית המבחנה; השליכו את שכבת ההפטוציטים ואת ה-perol על ידי שפיכתם למכל פסולת. לאחר מכן, השביו את המשקע המכיל את הלוקוציטים ב-4 milliliters של בופר TAC כדי ל lysed Erythrocytes, והדגירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך עד 10 דקות תוך היפוך תכוף של המבחנה. לאחר ההדגרה, סננו את תרחיף התאים דרך ממבנה ניילון של 100 micron אל תוך מבחנת צנטריפוגה חדשה של 10 milliliters.הוסיפו מתחת לתססית התאים המסוננת מיליליטר אחד של בופר fax EDTA כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-350 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבב, השעיקו מחדש בחמישה מיליליטרים של בופר fax EDTA, סבבו שוב בצנטריפוגה ושעיקו את המשקע ב-0.5 עד 3 מיליליטרים של בופר fax EDTA, בהתאם לגודל המשקע. קבעו את מספר הלוקוציטים הכבדיים החיוניים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) על בסיס דחיקת צבע trypan blue מהכבד.ניתן לסמן תרחיפי תאים בודדים באמצעות נוגדנים ספציפיים לסמני שטח התא הרצויים ולנתח אותם באמצעות FACS. לאחר יצירת תרחיפי תאים בודדים מרקמת כבד וטחול, ייקבעו העומסים הבקטריאליים עבור חלקים מהפרוצדורה. מכשיר הומוגניזציה של קיבה ישמש להומוגניזציה של הרקמה, כאשר שק ER של קיבה ייסגר כדי למנוע דליפה.התחילו בהנחתו בצורה שטוחה על משטח עבודה נקי. גלגלו עט עגול ועבה מעל הרקמה עד שהרקמה תימעך בתוך השקית. הוסיפו 5 mL של PBS לכל שקית קיבה המכילה רקמה מעוכה.הניחו את הקיבה או את השקיות לתוך מכשיר ההומוגן (stomach) והפעילו במהירות גבוהה למשך 10 דקות. למכשיר ההומוגן יש שני להבים הלוחצים על הקיבה או השקיות במהירות מוגדרת, ומערבבים את התוכן להומוגנאט אחיד תוך מניעת פליטת אירוסולים. בעזרת פיפטה, ערבבו את ההומוגנאט בתוך השקית. לאחר מכן, העבירו 300 µL בשכפולים ללוח 96 בארות בעל תחתית שטוחה.בתוך בארות פלטת 96 הבארות, בצעו דילול סדרתי של 1:10 עד לדילול של 10⁻⁵. עבור כל דגימת הומוגנאט רקמה, השתמשו בזהירות בפוזר סטרילי כדי לפרוס 0.1 milliliters מכל דילול על פלטת HBA מיובשת מראש. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה.ביום למחרת, ספרו את מספר יחידותי התג (colony forming units) עבור כל דילול וחשבו את מספר יחידותי התג לרקמה, תוך התחשבות בחלק מהרקמה, בגורמי הדילול ובנפח ההומוגנאט. בדקו אם עכברי C 57 black six הודבקו בכ-2000 יחידות תג של listeria; שלושה ושבעה ימים לאחר ההדבקה, העכברים הומתו, והכבד נשטף (perfused) ונאסף יחד עם הטחול. דילולים של הומוגנאט מהטחול או סספנסיית תאים בודדים מהכבד זרעו על מצעי HBA כדי לקבוע את העומס החיידקי.בתוצאות המוצגות כאן, הקו המקווקו מציין את סף הגילוי של 100 colony forming units לאיבר. שימו לב כי עומס הליסטריה גבוה יותר ביום השלישי מאשר ביום השביעי. זאת מכיוון שעד היום השביעי, תאי חיסון שונים מובילים לסילוק הליסטריה.בשני רקמות אלו, שלב והכבד, סספנסיות של תאים בודדים נצבעו ב-trypan blue והועמסו על סופר תאים (hemocytometer). תאים בתוך אזור הספירה המסומן בריבוע האדום ייספרו. תאים שאינם חיוניים יספגו את ה-trypan blue וייראו בצבע כחול, בעוד שתאים חיוניים יישארו ללא צבע.כפי שמוצג כאן, מספר התאים החיים בטחול המוצג משמאל ומספר הלוקוציטים החיים בכבד המוצג מימין עולים במהלך ההדבקה. עלייה זו נובעת מתאי מערכת החיסון, כולל נויטרופילים ולימפוציטים, אשר הופכים לפעילים, מבצעים פרוליפרציה ונודדים לשני אתרי ההדבקה הללו. כדוגמה לרמות תאי מערכת החיסון במהלך הדבקה ב-listeria, מוצגים כאן גרפי fax מייצגים ומספר תאי T חיוביים ל-CD eight.מספר תאי ה-T החיוביים ל-CD8 פוחת באופן זמני עקב לימפופניה בטחול ביום השני עד השלישי, ולאחר מכן עולה באופן ניכר החל מהיום החמישי לאחר ההדבקה, הן בטחול והן בכבד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון תנודות של אנדרוגנים, זיהוי תאי T ספציפיים לאנטיגן ובדיקות תפקודיות של תאי מערכת החיסון שמומנו, כדי לאפיין באופן מעמיק יותר את התגובות החיסוניות להדבקה ב-listeria.

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: לו, ב. ס. ואחרים. זיהום כרוני בסלמונלה פיברוזיס במעי. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון מדגים את כימות העומס החיידקי במודל עכבר של זיהום כרוני בסלמונלה טיפימוריום עמידה לסטרפטומיצין. לאחר המתת חסד וניתוח סטרילי, רקמות ציקלי וטחול נקצרות, הומוגניות עם חרוזי פלדה לשחרור חיידקים, ומדוללות באופן סדרתי. הדילול מצופה על אגר סלקטיבי, ומושבות נראות נספרות להערכת עומס חיידקי לגרם רקמה באתרים מעיים ומערכתיים.

כימות עומס חיידקי רקמה במודל עכבר של זיהום כרוני במעי

מקור: McMullen, P. D., Freitag, N. E. הערכת פלישה חיידקית לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של לב בעכברים נגועים באמצעות Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון הזה מדגים את הזרקת ליסטריה מונוציטוגנס לווריד הזנב של עכבר כדי להוביל זיהום מערכתית. הוא מציג זרימת דם חיידקית, קולוניזציה של איברים, וכימות עומס חיידקים בלב על ידי הומוגניזציה של רקמות, ביצוע דילול סדרתי וציפוי.

כימות עומס חיידקים בלב העכבר לאחר הזרקת ליסטריה מונוציטוגנס לווריד הזנב

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

סרטון זה מדגים את כימות העומס החיידקי הזיהומי ממוח העכבר המחורר הנגוע בליסטריה מונוציטוגנים.

הערכת התיישבות חיידקים במוח עכבר בעקבות זיהום ליסטריה מונוציטוגנים

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לזיהום אוראלי של עכברים...

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות.  תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה.  כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב במבחנה קולוניזציה לב בבעלי חיים נגועים.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחסן עכברי C57BL/6J בזן EGD של ליסטריה מונוציטוגנס (L. monocytogenes) ולמדוד תגובות אינטרפרון-γ (IFN-γ) על ידי תאי הרג טבעי (NK), תאי T הורגים טבעיים (NKT) ולימפוציטים מסוג T אדפטיביים לאחר הדבקה. פרוטוקול זה מתאר גם כיצד לבצע מחקרי הישרדות בעכברים לאחר הדבקה במינון LD50 שונה של הפתוגן.

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

במהלך זיהום, ליסטריה הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם - מוח ליישב את המוח. ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד להעריך מושבת חיידקים של איברים בעקבות זיהום של עכברים. הליך כדי לבצע כל האיבר זלוף לקביעת ספציפי של חיידקי מספרים ב- parenchyma המוח מסופק.

ליסטריה דלקת של המוח

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

למד שיטה למדידת עומס חיידקי ויצירת תלייה תאית בודדת מכבד וטחול של עכברים נגועים ב-Listeria monocytogenes. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסון והשוואה בין זני עכברים רגישים ועמידים.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה

גלה סרטונים נוספים