רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

ישנן יחסית מעט תרופות זמינות לטיפול במיקובקטריום טוברקולוזיס, כך שעמידות לכל תרופה היא דאגה. מאמר וידאו זה מתאר הליך לבדיקת העמידות לאנטיביוטיקה של שחפת M ל-12 תרופות מיקרוביאליות שונות בו זמנית. לפיכך, היכולת לזהות במהירות עמידות אנטי-מיקרוביאלית של שחפת M חשובה מאוד במאמץ לשלוט בעלייה בזני העמידות כאן כדי לבדוק את הרגישות לאנטיביוטיקה.

שחפת M גדלה לראשונה על מוצק או במצע מרק, תרחיף חיידקים. החיסון מוכן ומתווסף לצלחת מיקרוטיטר המכילה ריכוזים שונים של 12 תרופות, כולל תרופות קו ראשון וקו שני לאחר הדגירה. מידת הגידול בכל באר נקבעת באופן ידני באמצעות קופסת מראה או באמצעות קורא צלחות חצי אוטומטי.

הנתונים המתקבלים מצביעים על הריכוז המעכב המינימלי עבור כל תרופה שנבדקה ומראים לאילו אנטיביוטיקה זן השחפת שנבדק עמיד. תוצאות אלו מסייעות בבחירת התרופה המתאימה לטיפול בשחפת. היי, שמי ננסי אק ואני מנהלת מעבדת הבקטריולוגיה של מיקו במרפאת מאיו ברוצ'סטר, מינסוטה.

היום נתאר שיטה לביצוע בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה למיקובקטריום טוברקולוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו דילול מרק מאקרו הוא שנקבע MIC לכל תרופה ו-12 אנטיביוטיקות נבדקות במקביל. מי שידגים את ההליך יהיה קורט ג'וד, מומחה איכות במעבדה שלי, שעובד על ספסל מעבדה.

התכוננו להליך זה על ידי תיוג צלחת אגר דם, שלוש צלחות Middlebrooks שבע H 10, צינור חרוז זכוכית טווין מלוח וצלחת מיקרוטיטר עם שם המטופל ומספר זיהוי הדגימה. בנוסף, סמן את אגר הדם ושבע צלחות H 10 כטוהר. בדוק סמן אחת משבע צלחות H 10 אלה כספירת מושבה אחת לאחת והשנייה כספירת מושבה אחת עד 50.

לאחר מכן הניחו את המגש במעבר. לאחר מכן, התכוננו לעבודה במתקן BSL 3 לבטיחות ביולוגית ברמה שלוש על ידי לבישת חלוק קדמי מוצק, כפפות כיסוי ראש, כיסויי נעליים ומכונת הנשמה. כאן משתמשים במכונת הנשמה פאפה.

לאחר מכן אחזר את המגש מהמעבר. לאחר מכן במתקן BSL שלוש, יש לחטא את פני ארון הבטיחות הביולוגי. לאחר מכן הניחו מגבת נייר ספוגה בחומר חיטוי בתוך מכסה המנוע, כשישה סנטימטרים מלוח האוורור ליד מגבת הנייר.

הניחו לולאות חיסון, צנרת וטיפים, מיכל פינוי פסולת מתאים, נפי, TER ומערבולת. לאחר הכנת מכסה המנוע, הניחו את האורגניזם על מגבת הנייר יחד עם מתלה עם מרק מקפרלנד 0.5 סטנדרטי A שבע H תשע עם OADC וצינור חרוזי מלח. הגדרה זו נעשית ממוצק, בינוני.

הכן חיסון מתרבית בינונית מוצקה מדגימה של מטופל. השתמש בלולאה סטרילית כדי לגרד את המושבות ולהעביר אותן לצינור חרוזי הזכוכית המלוחים. מערבולת את המתלים למשך 30 עד 60 שניות.

בדוק ויזואלית את הדגימה, והשווה אותה לתקן מקפרלנד. הסכום המועבר צריך להיות שווה או גדול מהתקן. אם לא, הוסף עוד מדגימת החיידקים והמערבולת. שוב.

לאחר התאמה לתקן מקפרלנד, אפשר לחיסון להתיישב במשך 15 דקות כדי לאפשר לגושי חיידקים גדולים יותר לשקוע. לאחר מכן, השתמש ב-nefi TER כדי למדוד את צפיפות החיידקים המרחפים לאפס. הנפיטר.

ראשית הנח צינור טווין חרוז מלח ריק בנפיטר. לחץ על לחצן הכיול כדי לאפס את המכשיר, ולאחר מכן הנח את תקן McFarland 0.5 בנפי טר ולחץ שוב על כפתור הכיול. לאחר כיול המכשיר, הסר את תקן מקפרלנד והכנס את החיסון.

קריאת החיסון צריכה להיות שווה לקריאה הסטנדרטית של מקפרלנד. אם הקריאה נמוכה מדי, הסר את הצינור והעביר חיידקים נוספים מהצלחת. ואז מערבולת וקוראים שוב את הדגימה.

אם הקריאה גבוהה מדי, הוסף טווין מי מלח למערבולת הצינור. לאחר מכן קרא שוב את הדוגמה. המשך להתאים את החיסון לפי הצורך עד שריכוז החיידקים תואם את תקן מקפרלנד.

לאחר מכן, השתמש בפיפטר של 200 מיקרוליטר ובקצה פיפטה ארוך עמיד לתרסיס כדי להסיר 100 מיקרוליטר של חיסון מהשליש העליון של הצינור. כדי למנוע גושים שמתיישבים בתחתית החיסון, מרק מידלברוק שבע H תשע מערבל לאט את המרק המחוסן למשך 20 שניות לצלחת החיסון התחל בהסרת צלחת המיקרוטיטר מאריזת היצרן. אם חומר הייבוש כחול או אם אריזת נייר הכסף פגומה, אל תשתמש בה.

הצלחת כבר מכילה את 12 התרופות האנטי-מיקרוביאליות שייבדקו בכל באר, כולל תרופות הקו הראשון היעילות ביותר ותרופות הקו השני. יוצקים בזהירות את חיסון מרק 7 H 9 לתוך trth תוך הקפדה לא לייצר אירוסולים. לאחר מכן הנח את לוחית המיקרו טיטר כשהתווית פונה החוצה כפי שמוצג כאן, והשתמש בצנרת 12 תעלות כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של החיסון לכל באר.

לאחר מכן, הכינו צלחות לביצוע ספירת מושבות. ראשית, הכינו צלחת לא מדוללת על ידי העברת לולאת מיקרוליטר אחת של דגימה מבאר הבקרה החיובית לצלחת שבע H 10 המסומנת אחד לאחד. לאחר מכן השתמש בלולאה כדי לפספס את הצלחת כפי שמוצג כאן.

לאחר מכן, להכנת דילול של אחד עד 50, העבירו לולאה של מיקרוליטר אחד מבאר הבקרה החיובית וסובבו אותה לתוך הצינור עם 50 מיקרוליטר פס מים. מיקרוליטר אחד של דילול זה על הצלחת סומן 1 עד 50. חיסון לוחות הטוהר על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של החיסון מהטר על אגר דם מסומן כראוי ושבע צלחות H 10 ופס לבידוד.

לאחר מכן ערמו טרט נוסף על גבי הטר המחוסן והניחו אותם בעדינות במיכל ההשלכה. הנח אטם דבק על לוחית המיקרוטיטר. לאחר מכן בעזרת הגיבוי הלבן, לחץ בחוזקה על כל באר כדי להבטיח תקרה נאותה, וודא שאין קמטים.

יש לחטא את צלחת המיקרו על ידי ניגובה במגבת נייר ספוגה בחומר חיטוי שחפתית. לאחר מכן הניחו את צלחת המיקרוטיטר בשקית ניילון וסגרו אותה עם אטם חום. לבסוף יש לחטא את כל החומרים, כולל הנפי, מערבולת הליטר, הצלחות והצינורות על ידי ניגובם בחומר חיטוי צידלי שחפת.

כאן משתמשים בתרסיס פרו לאחר שחלף מספיק זמן כדי להבטיח חיטוי. 15 דקות לתרסיס פרו. הצלחות מודבקות בסקוטש המונחות בשקיות ניילון ואספקה אטומה מוסרת מארון הבטיחות הביולוגית ומונחת במעבר.

השקית האדומה לזרוק סגורה ואטומה בעניבת טוויסט בשלב זה, הסירה את השמלה, המגפונים והכפפות. לאחר שתמשיך לחדר ההמתנה ושטיפת ידיים, הסר את מכונת ההנשמה וחטא ואחסן אותה לאחר שטיפת ידיים שוב, לבש חלוק טרי וצא מסוויטת BSL שלוש. לאחר מכן, מיכל ההשלכה עובר חיטוי.

לאחר מכן דגרו את לוחית המיקרוטיטר ואת שבעת לוחות H 10 ומקדחת הדם בצד ימין כלפי מעלה באינקובטור של 35 עד 37 מעלות צלזיוס עם 5 עד 10% CO2 במעבדה BSL שתיים. זה מקובל מכיוון שהצלחת אטומה היטב ובשקית ניילון, יצירת מיקובקטריום טוברקולוזיס הזמן הוא כ-12 עד 24 שעות, כך שיעבור לפחות שבוע לפני שניתן יהיה לראות את הצמיחה כהיווצרות של כדור תא בתחתית הביקורת. ובכן, ביום 10, בצע קריאת מראה ידנית על ידי הנחת להב המיקרו טיטר ST האטום על הפלטפורמה של תיבת המראה.

השתמש במנורת שולחן כדי לסייע בהדמיית התאמת הצמיחה לפי הצורך כדי לקבל את הניגודיות הטובה ביותר. בדוק את בארות בקרת הצמיחה במקרה זה, H 11 ו- H 12 על ידי התבוננות במראה. אם יש צמיחה, הבאר תיראה מעוננת או תיראה שיש בה משקעים כפי שמוצג כאן.

אם אין צמיחה כפי שמוצג בדוגמה זו, הבאר תיראה פנויה. במקרה זה, החזירו את הצלחת לחממה והמשיכו לדגור עד 21 יום. עבור כל מצב, השווה את הגידול לביקורת.

ובכן, עבור כל רשומת תרופה, הדילול הראשון שאין לו צמיחה. זהו הריכוז המעכב המינימלי או MIC עבור התרופה לבחינת תוצאות באמצעות קורא צלחות אוטומטי כגון הראייה להתחיל בפתיחת Myco TB, תוכנת לוחית ST ורישום הצלחת האטומה כשהברקוד פונה החוצה. כפי שמוצג כאן, הצמיחה מופיעה כעכירות או כמשקע של תאים בתחתית באר על מסך המחשב.

ראשית, בחנו את בקרות הגדילה. כמו קודם. אם זה שלילי לצמיחה, החזירו את הצלחת לחממה עד 21 יום.

אם זה חיובי, רשום את התוצאות על ידי נגיעה בבאר הראשונה, שאינה מראה צמיחה על המסך עבור כל תרופה. במקרים מסוימים, חיידקים, משקעים או תרופות משקעים לקרקעית הבאר. תופעה זו, המכונה נגררת, מסומנת על ידי מספר בארות עם כדור בגודל זהה ואינה נחשבת למעשה לצמיחה חיובית.

לאחר מכן, נבדקים שבע צלחות H 10 ואגר הדם כדי לקבוע את ריכוזי החיידקים ולהעריך את הטוהר. צלחת אגר הדם לא אמורה להראות צמיחה לאחר 48 שעות. גידול על צלחת אגר הדם מעיד על זיהומים בחיידקים הגדלים במהירות.

אם יש צמיחה, יש לחזור על בדיקת המיקרוטיטר. צלחת הטוהר של שבע H 10 צריכה להיות בעלת צמיחה של אורגניזם אחד. שחפת מסוג EM צריכה להיראות בוהקה, צבעונית, מקומטת ומחוספסת אם היא מזוהמת, יש לחזור על בדיקת המיקרוטיטר מתרבית טהורה.

כדי להעריך את ריכוז החיידקים, ספרו את המושבות על צלחת שבעת H 10. לאחר מכן באמצעות הטבלה במסמך הכתוב הנלווה, חשב את ספירת המושבות. מיקובקטריום טוברקולוזיס גדל מדגימת מטופל והעמידות לאנטיביוטיקה הוערכה כמתואר בסרטון זה בלוח המוצג כאן, 12 תרופות שונות קיימות בריכוזים הולכים וגדלים עם הריכוזים הגבוהים ביותר בחלק העליון והריכוזים הנמוכים ביותר בתחתית.

הריכוז המעכב המינימלי, או MIC של התרופה צוין על ידי הריכוז הנמוך ביותר של התרופה שלא הראה כל צמיחה והוא מוקף בעיגול בתמונה המוצגת כאן באמצעות נקודות שבירה סטנדרטיות שנקבעו על ידי מכון התקנים הקליניים והמעבדתיים. הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שזן זה של שחפת יהיה עמיד לאיסיד וריפמפין. במבחנה, המיקרופונים הגבוהים שנראו במספר תרופות אחרות, כולל oin, moxifloxacin, streptomycin, ו-rifabutin מרמזים על עמידות של זן השחפת EM לחומרים אלה.

יש להשתמש בתוצאות ה-MIC על ידי מומחה למחלות זיהומיות המנוסה בטיפול בשחפת כדי לפתח תוכנית טיפול אישית לאחר שליטה בטכניקה זו לוקח כ-40 דקות להגדיר מבודד אחד. בזמן שאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור שמדובר בפתוגן נשימתי וברגע שאתה מייצר אירוסולים, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיר Mycobacterium tuberculosis, בדיקת רגישות מיקרוביאלית בשיטת דילול מיקרו מרק. אל תשכח שעבודה עם מיקובקטריום טוברקולוזיס יכולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הגנה על הנשימה היכן שאנו נדרשים.