השתקת גנים בתיווך siRNA בתאי גזע עצביים

קחו לדוגמה RNA מפריע קטן, או siRNA, סוג של RNA המעורב בהשתקת גנים.

הוסף שלפוחיות שומנים כדוריות הנקראות ליפוזומים.

הליפוזום עוטף את ה-siRNA, ומגן עליו מפני פירוק.

הוסף קומפלקסים של siRNA-ליפוזום לתרבית המכילה היטב תאי גזע עצביים. שמור אחד היטב כבקרה, ודגירה.

הליפוזום מתמזג עם קרום התא ומשחרר את ה-siRNA.

ה-siRNA נקשר לקומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA, או RISC, שבו מסירים גדיל אחד.

הגדיל הנותר מכוון ל-mRNA האחראי על התמיינות התאים, מה שמוביל לפירוקו.

הוסף מדיום בידול מתאים לבארות.

בבאר הבקרה, גורמי הגדילה וחומרים מזינים אחרים במדיום מקדמים את ההתמיינות של תאי גזע עצביים לאוסטאובלסטים.

באמצעות טכניקות צביעה מתאימות, צבעו סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים על התאים וצבעו את הגרעין בצבע פלואורסצנטי כחול.

היעדר סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים בתאים המושתקים בגנים מעיד על חוסר יכולתם להתמיין.

כדי לבצע נוק-דאון של siRNA בתאי O9-1 מתאוששים וזורעים את התאים. לדלל ליפוזומים בנפח מתאים של מדיה נטולת סרום. לאחר מכן, יש לדלל את siRNA במדיה נטולת סרום בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף את ה-siRNA המדולל לליפוזומים המדוללים לפי הוראות היצרן. מערבבים את התמיסה על ידי פיפטינג ודוגרים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף נפח מתאים של קומפלקס siRNA-ליפידים לתאים. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 24 שעות בחממת תרבית תאים רגילה. תאי O9-1 יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים בתנאי תרבית התמיינות ספציפיים. כדי להבדיל תאי O9-1 לאוסטאובלסטים, הכינו אמצעי התמיינות אוסטאוגניים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לבסוף, זהה את סמן האוסטאובלסטים אוסטאוקלצין באוסטיאובלסטים מובחנים על ידי צביעה חיסונית.