Name: ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למד ניתוח מורפולוגי של נוירוני ענפי דנדריטים בזחלי Drosophila באמצעות שיבוטים גנטיים מסומני GFP. שיטה זו מאפשרת חקר תוכניות גנטיות המשפיעות על זהות עצבית וצורת ענפים דנדריטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים RIKEN למימון. אנו מודים גם Cagri Yalgin, קרוליין Delandre, וג&#39;יי פריש לדיונים על פרוטוקולים גנטיים אימונוהיסטוכימיה.

1.Preparation של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ca + + ללא HL3.1 מלוחים 28. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במ"מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: Ca + + ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פולי-L-ליזין (PLL) coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 מ"ג PLL במים 4.2ml ולעשות aliquots 300μl צינורות Eppendorf ולהקפיא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני coverslips ציפוי, להפשיר הראשונה בה aliquot, ולהביא אותו עד 10 מ"ל ב DDH 2 O ולהוסיף 20μl של Kodak Photo-פלו; ריכוז PLL הסופית היא 0.7 מ"ג / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips לצלול עבור 30mins בפתרון PLL, להסיר ויבש, ולאחר מכן לשטוף עם מים לזמן קצר ויבש. חזור פעמיים. המטופלים coverslips האחרון כחודש. </li></ol></li></ol> 2. חוצה גנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> To ליצור שיבוטים MARCM. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג הפאן התובע 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, כטב"מ-mCD8: ה-GFP, גיגית, Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור Flp-out שיבוטים. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג IV ספציפיים בכיתה 8: פ.פ.ק. Gal4 x-YW, hsFLP; כטב"מ-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8: GFP </li></ol> 3. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור חוצה תסיסנית בבקבוק אוסף של 25 ° C ו לאסוף עוברים על התפשטות אגר מיץ תפוחים 29 צלחת בשכבה דקה של ממרח שמרים 30,31. </li></ol> 4. הלם חום טיפול של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת ריקה בניגוד צלחת אגר מיץ תפוחים שעליו עוברים נקבעו. חותם סביב אלה שתי צלחות עם Parafilm (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הלם חום, לצלול הצלחת דואר באמבט מים והחזק אותו באמצעות משקולת מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברי MARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים 2h ו דגירה בצלחת פטרי 10 ס"מ מוקף לחלח ברקמות של 25 מעלות צלזיוס במשך 2h נוספים. הערה: התאמת פרוטוקול הלם החום משנה את התדירות שבה הם שיבוטים שנוצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מספר קטן יותר של שיבוטים, מכוון נוירונים בודדים בודד, לצלול הלם החום באמבט מים 1h ב 38 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מספר גדול יותר של שיבוטים, הלם חום עבור 45mins ב 38 ° C, ולשחזר את 30mins RT, אז הלם החום שוב 30mins נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף Flp-out עוברים 24 שעות, ו הלם החום 1h ב 38 ° C. </li></ol> 5. הקרנת עבור שיבוטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ההלם חום, להסיר את המכסה של ההסדר האטומה למים והמקום צלחת אגר מיץ תפוחים בצלחת פטרי 10 ס"מ מוקף ברקמות לחלח. התרבות עוברים הזחלים לאחר מכן ב 25 ° C עד לנדודing 3 rd instar. הערה: התנאים תרבות, במיוחד תזונה, הוכחו לשנות התובע הדנדריטים מורפולוגיה סוכת 32,33. ודא כי הזחלים גדל גישה להדביק שמרים בכל עת, לפקח לחדש את השמרים להדביק כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך בפרוטוקול, לתמרן בעדינות באמצעות מלקחיים זחלי חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה בעדינות ולשטוף את הזחלים במי ברז ולאחר מכן מקום לצלחת אגר. הערה: צעד זה מפחית את הקרינה רקע אוטומטי מהמזון או לכלוך על פני הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הזחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי חזק לנתח. זיהוי הזחלים עם GFP חיובי נוירונים / תאים בדופן הגוף. </li></ol> 6. הדמיה in vivo של דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל לתוך כוס שקופית דיכאון עם טיפה קטנה של גליצרול 80%. מניחים coverslip בשקופית כדי לשתק את הזחל. ודא כי לא נותר אוויר בין הזחל לבין coversliעמ ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את coverslip לגלגל את הזחל כדי לאפשר ויזואליזציה של הנוירון של עניין. תמונת mCD8: GFP שכותרתו סוכת הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 7. הזחל לנתיחה הערה לפני שמתחילים: התובע דנדריטים נוירון לבזות במהירות לאחר תחילתו של דיסקציה. לנתח כל זחל בודדים פחות 5min כדי להבטיח מורפולוגיה דנדריט טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נדודים 3 rd הזחלים instar על צלחת Sylgard כפי שתואר לעיל 34 בשינויים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה של התובע נוירון האקסון טרמיני, להבטיח כי מערכת העצבים המרכזית הוא שלם את העצבים סגמנטלי לא שבורים. לאחר פתיחת זחלים, תחילה בזהירות לחתוך את הקשרים קנה הנשימה אל הקיר הגוף ואז בעדינות להסיר את הבטן כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה דנדריטים לבד, להסיר את מערכת העצבים המרכזית לאפשר להחמיא גובר. </li></ol></li></ol> 8. Fixatיונים חסימת פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הזחל ניצח עדיין הצלחת Sylgard, לתקן את זה PFA 4% PBS עבור 20mins ב RT על שייקר בעדינות מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עקבות של רקמות הזחל (שומן הגוף, הנשימה וכו ') לאחר קיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100) 10mins 3x על צלחת Sylgard ו שייקר. אם בוחנים Termini האקסון, לשמור על פילה בצלחת Sylgard. (אם דנדריטים מכתים אפשר להעביר את פילה הזחל אל צינור 0.5 מ"ל בשלב זה 34) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הזחלים עבור 20mins ב RT ב 5% נורמלי חמור בדם (NDS) ב PBST על שייקר. </li></ol> 9. הכתמה של פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון חסימת דגירה של הנוגדן הראשוני (ב 5% NDS / PBST) לילה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל פלסטיק קטן מוקף לחלח רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מתוך 4 ° C ו דגירה שעה נוספת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST. מוסיפים את antib משניody (ב 5% NDS / PBST), ומכסים על מנת למנוע צילום הלבנת fluorophore 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה או ב RT במשך שעתיים, או לילה ב 4 ° C ואחריו שעה אחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 10mins הזחלים 6x ב PBST והמשך גובר. </li></ol> 10. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של סוכת דנדריט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל פילה הזחל ישר ככל הניתן באמצעות מספריים או אזמל מנתחים לנתק את הראש (כולל ווים הפה), ואת האחורי (כולל spiracles) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה הזחל בשקופית לציפורן בצד למטה, לעלות ב 80% גליצרול ו לאטום את הצדדים של coverslip עם לק על "מהיר" הר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה קבוע תמונה ברורה יותר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה גזור הזחל שרירים בצד למטה על ירידה של PBS על coverslip PLL, זה יהיה מהר לדבוק coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כנוזל רב ככל האפשר לאחר הרכבה, however לא לאפשר לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את coverslip (עם פילה הזחל המצורפת) באמצעות סדרה אתנול: אתנול 35%, ואחריהם 50%, 70%, 95% ו 100% אתנול 2x בסופו של דבר כל אחד במשך 10 דקות (את פתרון 2 100% EtOH צריך להיות שונה לעיתים קרובות ;) סוף סוף, לשטוף 2-3x 10mins ב קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת DPX mountant (קסילן Distyrene plasticizer) בשקופית נקי בזהירות להניח את coverslip פילה בצד למטה למעלה. שמור בחושך, ולהמתין יום אחד עבור DPX להגדיר לפני הדמיה. </li></ol></li></ol> 11. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של Termini האקסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העצבים סגמנטלי רץ בין PNS ו CNS ללא פגע במהלך קיבעון לנתיחה, והכתים כדי לאפשר מעקב של אקסונים מן הפריפריה גוף תא עצב תחושתי על VNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל הזחל פילה לציפורן בצד למטה גליצרול 80% שקופית דיכאון. עקוב אחר אקסונים מגוף התא אל התובעVNC תחת מיקרוסקופ confocal. הערה: PNS הנוירונים בכל פרויקט קיר גוף קטע לקטע מאותו מקור של VNC. </li></ol> 12. נציג תוצאות: תוצאות נציג מוצגות דמויות 3-5. איור. 3 מציג את סוכת שלמה של IV בכיתה דה נוירון, שנתפסו in vivo תחת מיקרוסקופ confocal. איור. 4 מראה תקריב של חלק סוכת דנדריט של המעמד השלישי שכותרתו immunohistochemically נוירון כי תוקנה כראוי כדי לשמור על המורפולוגיה. הבלעה הקשורים מציגה את השפלה שעלול להתרחש לאחר דיסקציה כושל ועל קיבעון (שניהם מוכתמים נוגדן אנטי-GFP). איור. 5 מראה בכיתה אחת IV האקסון הסופית של מערכת העצבים המרכזית (אנטי GFP, ירוק); כל IV Termini בכיתה הם שיתוף מוכתם אנטי CD2 (מג'נטה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg"> איור 1 סקירת הפרוטוקול. א) איסוף ולאחר מכן חום עוברים זעזוע. ב) בחר הזחל עם GFP חיובי התובע נוירון לשבט, ואז התמונה GFP שכותרתו דנדריט סוכה הזחל לחיות. ג) מנתחים את הזחל, ולאחר מכן immunohistochemically הכתם פילה. ד) הר פילה מוכתם, ואז התמונה סוכת הדנדריטים ותחזיות axonal של נוירון התובע שיבוטים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg"> איור 2 הכנת צלחת אגר מיץ תפוחים להלם חום. קחו את הצלחת (חץ לבן, א.ב.), להוסיף המנה השנייה פטרי על גבי (אדום חץ ב) ו חותם מסביב עם Parafilm (חץ כחול, ב). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg"> איור 3 בתמונה vivo של סוכת דנדריט של mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM (גנוטיפ כמו 2.1) המייצג הרביעי בכיתה (v'ada) הנוירון של הזחל instar 3 rd. סרגל קנה המידה 50μm. d/3111/3111fig4.jpg "/&gt; איור 4 mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM של המעמד השלישי נוירון (ddaA) מוכתם נוגדן אנטי-GFP, מראה מורפולוגיה טוב לאחר דיסקציה קיבעון מוצלח (ירוק). מראה הבלעה השפלה דנדריט (חצים לבנים) המתרחשים לאחר דיסקציה קיבעון נכשל (מג'נטה). סרגל קנה המידה 25μm. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg"> איור 5 3 rd instar הזחל VNC. שיבוט Flp, מתוך מסוף יחיד בכיתה ו האקסון (vdaB) (גנוטיפ כמו 2.2) הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-GFP (ירוק). Anti-CD2 כל התוויות IV בכיתה טרמיני (מג'נטה). סרגל קנה המידה 25μm.

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li>
<li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+Knot%2FCollier%2C+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF%2FOlf-1+family%2C+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li>
<li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTB%2FPOZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li>
<li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+specification+of+axonal+arbors%3A+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li>
<li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington%27s+Disease-Like+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality%2C+soma+position%2C+and+proneural+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li>
<li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen%3A+origins%2C+dendritic+morphology%2C+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li>
<li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li>
<li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+Drosophila+neuropile%3A+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזחל תסיסנית מודל התובע נוירון מספקת מערכת אחת גנטי מעולה לחקור מנגנוני בקרה נוירון מורפולוגיה היווצרות מעגל. MARCM משמש בדרך כלל עבור תיוג ליצירת מוטציה התובע שיבוטים נוירון. עבור MARCM אנו משתמשים או מחבת-עצביים (למשל Gal4 c155) או התובע נוירון ספציפי הנהג. בעזרת הנהג הפאן עצביות אפשר להשתמש ישירות במניות מספר הנפוצה ממרכזי מניות לציבור. זאת באמצעות הנהג DA-נוירון מסוים יכול להיות יתרון, כי שיבוטים מסומן לא יופק במערכת העצבים המרכזית, ואת שיב...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> SZX16 לנתיחה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עם GFPHQ לסנן) </td><td> אולימפוס </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> חיים מלקחיים חרקים </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm דיכאון שקופיות זכוכית </td><td> Toshinriko ושות </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (או Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P-1524 </td><td> מוצר זה הוכח כיעיל ביותר </td></tr><tr><td> DPX הרכבה בינונית </td><td> סיגמא </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד ה-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> דילול 1:700 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> דילול 1:10 </td></tr></table>

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

התפתחות מערכת העצבים מחייב את המפרט הנכון של נוירון עמדה וזהות, ואחריו התפתחות דנדריטים מדויק בכיתה ספציפית נוירון וחיווט axonal. לאחרונה הדנדריטי (DA) arborization עצב סנסורי של המערכת תסיסנית הזחל העצבים ההיקפית (PNS) הפכו מודלים גנטי חזק שבו להבהיר שני מנגנונים כלליים בכיתה ספציפית של בידול נוירון. ישנם ארבעה הראשי התובע כיתות נוירון (I-IV) 1. הם שם לפי סדר המורכבות הגוברת סוכת דנדריט, יש מעמד ספציפי ההבדלים בשליטה הגנטי של בידול שלהם 20-10. המערכת החושית התובע הוא מודל מעשי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי שליטתה של מורפולוגיה הדנדריטים 11-13 כי: 1) הוא יכול לנצל את הכלים גנטי חזק זמין זבוב הפירות, 2) התובע דנדריט נוירון סוכת פורשת רק 2 מימדים מתחת אופטית CLEלציפורן ar הזחל ולכן קל לדמיין עם רזולוציה גבוהה in vivo, 3) את המגוון בכיתה ספציפית במורפולוגיה הדנדריטים מאפשרת ניתוח השוואתי למצוא אלמנטים מרכזיים שליטה על היווצרות של עצים דנדריטים פשוט מול מסועפת מאוד, 4) סוכת הדנדריטים סטריאוטיפיות צורות שונות של נוירונים התובע להקל על ניתוחים סטטיסטיים morphometric. פעילות התובע נוירון משנה את הפלט של גנרטור דפוס הזחל מרכזי תנועה 14-16. שונה התובע כיתות נוירון יש שיטות שונות חושית, והפעלה שלהם מעוררת תגובות התנהגותיות שונות 14,16-20. מעמדות שונים ועוד לשלוח תחזיות axonal סטריאוטיפי לתוך מערכת הזחל תסיסנית מרכזי העצבים בחוט עצב הגחון (VNC) 21. תחזיות אלו לסיים עם ייצוגים הטופוגרפי של מודליות הן התובע נוירון חושי את המיקום בקיר גוף השדה הדנדריטים 7,22, 23. לפיכך, בחינה של תחזיות התובע axonal יכול לשמש כדי להבהיר המנגנונים מיפוי טופוגרפי 7,22,23, כמו גם את החיווט של תנועה הזחל פשוט ויסות מעגל 14-17. אנו מציגים כאן מדריך מעשי ליצור ולנתח פסיפסים גנטי 24 נוירונים סימון התובע באמצעות MARCM (ניתוח פסיפס עם מרקר תא Repressible) 1,10,25 ו Flp-out 22,26,27 טכניקות (מסוכם באיור. 1).

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

התפתחות מערכת העצבים דורשת קביעה נכונה של מיקום הנוירונים וזהותם, ולאחריה התפתחות מדויקת של דנדריטים הספציפיים למחלקה הנוירונית...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות את המורפולוגיה המפורטת של נוירונים בעלי ענפות דנדריטיות בפגית של דרוסופיליה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוףו של עוברים, יישון שלהם, ויצירת שיבוטים גנטיים המסומנים ב-GFP באמצעות ביטוי של lipase המושרה על ידי הלם תרמי. השלב השני הוא בחירת פגיתים עם שיבוטי נוירונים פלואורסצנטיים וצילום של ה-ABAs הדנדריטיים שלהם.לאחר הדמיית הלבה, הם מנוסחים, מקובעים ועוברים צביעה אימונוהיסטוכימית כדי שניתן יהיה להניחם על תשתית ולהדגים את המורפולוגיות של נמלי הדנדריטים והטרמינליות האקסונליות באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה קונפוקלית. היום הדגמתי פרוטוקול לאנליזה מורפולוגית של sula lower peripheral sensor OIDs ואקסונים באמצעות genetic mos. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון מהן התוכניות הגנטיות השולטות בזהות עצבית, בצורת הדנדריטים ובחיווט החיצוני?התחילו את הפרוטוקול זה על ידי איסוף עוברים על צלחות מיץ תפוחים. הלם החום מבוצע באמבט מים בטמפרטורה של 38 degrees Celsius, והמשך הפעולה משתנה בהתאם לגנטיקה של העובר ולגודלי השיבוטים הרצויים. עבור פרוטוקול זה, צרו שיבוטים מסומנים מעוברים עם דרייבר של נוירון בעל עץ דנדריטי (pand dendritic arborization neuron driver). לפני הלם החום, החזיקו את עוברי הסימון בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, מוקפים ברקמות לחות, למשך שעתיים.הכינו את פלטות האיסוף להלם חום על ידי הפיכתן לניתנות לטבילה באמצעות פלטות ריקות ו-para fill. לאחר מכן, חשפו את עוברי הסמן להלם חום למשך שעה כדי להפיק שיבוטים קטנים או סימון של נוירון בודד. כדי להגדיל את מספר השיבוטים, השתמשו בהלם חום ממושך על ידי דגירה למשך 45 דקות באמבט, לאחר מכן 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז 30 דקות נוספות באמבט.כדי להפיק שיבוטים מסוג flipout, אספו עוברים במשך 24 שעות רצופות. פרוטוקול זה משתמש בדרייבר ספציפי מסוג class four. בצעו הלם חום לעוברי ה-flipout למשך שעה לאחר ההלם החום.הניחו את פלטות האיסוף בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 centimeter, המוקפת ברקמות לחות ובתרבית. העוברים נשמרים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius במהלך גידול העוברים; יש לנטר ולהשלים את משחת השמרים לפי הצורך, מכיוון שהתזונה משפיעה באופן קריטי על ההתפתחות העצבית.יש לתחזק את התרבית עד שניתן יהיה לאסוף זחלים בשלב הגלילה של הגוזל השלישי (wandering third instar). יש לשטוף את הזחלים בשלב הגוזל השלישי בעדינות ובקיצור במי ברז ולהעבירם לצלחת אגר. כעת, יש לבחון את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי עוצמתי ופינצטה לחרקים. יש לזהות זחלים בעלי נוירונים חיוביים ל-GFP בדופן הגוף ולהעבירם לזכוכית כיסויה עם שקע (depression slide) המכילה טיפה של 80% glycerol.הנח זכוכית כיסוי על הפסית כדי לקבע את ה larva. ודא שלא נותר אוויר בין ה larva לבין זכוכית הכיסוי. השתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית כדי לדמות את הנוירונים הרלוונטיים דרך הקוטיקולה של ה larva.כדי לשנות את מיקום הלבה לזווית צפייה משופרת, לחצו בעדינות על כיסוי הזכוכית (cover slip) כדי לגלגל את הלבה. התחילו פרוטוקול זה על ידי העברת לבה ללוח ההגנה של ה-SIL באמצעות פינצטה לחרקים. לאחר מכן, הצמידו אותה באמצעות סיכות בקצוות הקדמי והאחורי.לאחר מכן, הוסיפו באפר HL 3.1 נטול סידן. כעת, בצעו חיתוך עד למחצית בשני קצות הלבה, בניצב לציר הקדמי-אחורי. לאחר מכן, חתכו לאורך קו האמצע שבין שתי הקנה.חתכו בזהירות כל חיבור טרכיאלי בודד לדופן הגוף לפני הסרה עדינה של מערכת העיכול. פעולה זו שומרת על שלמותם של העצבים הסגמנטליים העוברים בין ה-PNS ל-CNS. כאשר הזחל עדיין מהוהן לפלטת מגן התא, קבעו אותו ב-4%Para formaldehyde ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסתובב בעדינות; בצעו כל דיסקציה בתוך פחות מחמש דקות.אחרת, הניטריטים של נוירוני ההרשאה הדנדריטיים יתחילו להתפרק. לאחר הקיבוע, הסר רקמות זחלים עודפות. לאחר מכן, שטוף את הפילטים שלוש פעמים עם PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה.לאחר השטיפות, הדגרי את הזחלים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בתמיסת חסימה (blocking solution) תחת ניעור עדין. עם השלמת החסימה, החליפי את תמיסת החסימה בתמיסת הנוגדן הראשוני. הניחי את הדגימה במכל פלסטיק קטן המוקף ברקמות לחות והדגירי אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, המשיכי את ההדגרה למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן יש לשטוף את נתח הלבה שש פעמים ב-PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה. כעת יש להוסיף את הנוגדן המשני ולהניח את הנתחים במיכל חשוך כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) של הפלואורופור. יש להדגיר את הנתחים למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C, ולאחר מכן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לבסוף, שטפו את הפרוסות שש פעמים ב-PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן הרקמות מוכנות להרכבה. כדי להדמיץ את קצות האקסונים, פשוט הרכיבו את פרוסת הזחל כאשר צד הקוטיקולה פונה כלפי מטה ב-80% glycerol בתוך תג העמקה.כדי להפיק תמונות ברורות יותר של דנדריטים, הכינו דגימה קבועה באמצעות לביבות כיסוי מצופות ב-PLL. כדי לסמן את לביבות הכיסוי, הכינו מנה של PLL. השלימו לנפח של 10 milliliters של מים מזוקקים פעמיים והוסיפו 20 microliters של Kodak photo flow.הטבילו את לבישות הכיסוי למשך 30 דקות בתמיסת ה-PLL והניחו להן להתייבש באוויר לאחר ההוצאה. לאחר מכן, שטפו אותן קצרות במים ובאוויר. ייבשו אותן שוב.חזור על תהליך זה פעמיים. החל מהטבילה ב-PLL, לזכוכיות הכיסוי המטופלות יהיה תוקף של כחודש. כעת, העבר פיליה של זחל מנותח כאשר צד השריר פונה כלפי מטה אל תוך טיפה של PBS על זכוכית כיסוי מצופה ב-PLL.הפרוסה תידבק במהירות לזכוכית המכסה באמצעות פיסת נייר סופג. הסר כמה שיותר נוזלים, אך אל תאפשר לדגימה להתייבש לחלוטין. לאחר מכן, בצע דהידרטציה לפרוסות הזחלים באמצעות סדרה של רחצונות באתנול למשך 10 דקות כל אחד, החל מ-35% ethanol, ולאחר מכן 50%, ואז 70%, ואז 95%, ואז 100%, ולבסוף רחצון שני ב-100% ethanol.לאחר רחצונות האתנול, בצעו שני או שלושה רחצונות של 10 דקות ב-xylene. לאחר מכן, הניחו טיפה של DPX על סלייד נקי והניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי על ה-DPX, כאשר הצד הפונה למטה ממלא את השטח. שמרו את הסלייד בחושך והמתינו יום אחד עד להתייבסות ה-DPX.לפני הדמיית הרקמה באמצעות מיקרוסקופיה מוקדית ובתוך הגוף (in vivo), ניתן ללכוד תמונות כדוגמה זו. העץ הדנדריטי השלם של נוירון עם עץ דנדריטי מסוג Class four. זוהי תמונה תקריבה של עץ דנדריטי מנוירון מסוג class three שסומן ב-IHC וקובע כראוי כדי לשמר את המורפולוגיה.התמונה המוכנסת מראה את הפירוק שעלול להתרחש לאחר נתיחה וקיבוע לא מוצלחים. שכבה זו מראה סיומת אקסון בודדת מסוג class four ב-CNS. האקסון מסומן עם anti GFP בירוק וכל סיומות האקסונים מסוג class four צבועות יחד עם anti CD two במגנטה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע דיסקציה וקיבוע של הדגימות במהירות על ידי מעקב אחר האקסונים מהפריפריה אל ה-CNS. כדאי לזכור כי נוירונים של ה-PNS בכל גוף יבצעו הקרנה סגמנטלית לסגמנט הקוגניטיבי של קוד העצב הוונטרלי. כמו כן, אם ברצונכם להדמיאן רק דנדריטים, הסירו את ה-CNAs במהלך הדיסקציה, וניתן לבצע את הצביעה בתוך מבחנות במקום על פלטות.בעת קיבוע פילטים אלו לצילום דנדריטים, חתכו תחילה את הראש באמצעות ווים פה (mouth hooks) ואת החלק האחורי באמצעות מספריים דקים (sparkles), לצורך הכנה מיטבית.

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

מקור: Ting, C., et al., ניתוח מורפולוגיה דנדריטית בעמודות ושכבות. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההליך של הכנת מוח דרוזופילה, לכידת ערימות תמונות אופקיות וקדמיות של דנדריטים מדולה עם תווית GFP תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ויצירת שחזור תלת מימדי לניתוח המורפולוגיה שלהם על פני שכבות ועמודות.

ניתוח מורפולוגיה דנדריטית על פני שכבות ועמודים של מדולה דרוזופילה

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את מיקוד עצב עם חלבון נמכרות ברגליים למבוגרים של זבוב החומץ על ידי קיבוע, הרכבה, הדמיה, ההדמיה שלאחר צעדים.

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

למד ניתוח מורפולוגי של נוירוני ענפי דנדריטים בזחלי Drosophila באמצעות שיבוטים גנטיים מסומני GFP. שיטה זו מאפשרת חקר תוכניות גנטיות המשפיעות על זהות עצבית וצורת ענפים דנדריטיים.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

גלה סרטונים נוספים