ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי
7 בנובמבר 2011
Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של תסיסנית הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לדמות את המורפולוגיה המפורטת של נוירונים בעלי ענפות דנדריטיות בפגית של דרוסופיליה. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוףו של עוברים, יישון שלהם, ויצירת שיבוטים גנטיים המסומנים ב-GFP באמצעות ביטוי של lipase המושרה על ידי הלם תרמי. השלב השני הוא בחירת פגיתים עם שיבוטי נוירונים פלואורסצנטיים וצילום של ה-ABAs הדנדריטיים שלהם.
לאחר הדמיית הלבה, הם מנוסחים, מקובעים ועוברים צביעה אימונוהיסטוכימית כדי שניתן יהיה להניחם על תשתית ולהדגים את המורפולוגיות של נמלי הדנדריטים והטרמינליות האקסונליות באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה קונפוקלית. היום הדגמתי פרוטוקול לאנליזה מורפולוגית של sula lower peripheral sensor OIDs ואקסונים באמצעות genetic mos. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון מהן התוכניות הגנטיות השולטות בזהות עצבית, בצורת הדנדריטים ובחיווט החיצוני?
התחילו את הפרוטוקול זה על ידי איסוף עוברים על צלחות מיץ תפוחים. הלם החום מבוצע באמבט מים בטמפרטורה של 38 degrees Celsius, והמשך הפעולה משתנה בהתאם לגנטיקה של העובר ולגודלי השיבוטים הרצויים. עבור פרוטוקול זה, צרו שיבוטים מסומנים מעוברים עם דרייבר של נוירון בעל עץ דנדריטי (pand dendritic arborization neuron driver). לפני הלם החום, החזיקו את עוברי הסימון בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, מוקפים ברקמות לחות, למשך שעתיים.
הכינו את פלטות האיסוף להלם חום על ידי הפיכתן לניתנות לטבילה באמצעות פלטות ריקות ו-para fill. לאחר מכן, חשפו את עוברי הסמן להלם חום למשך שעה כדי להפיק שיבוטים קטנים או סימון של נוירון בודד. כדי להגדיל את מספר השיבוטים, השתמשו בהלם חום ממושך על ידי דגירה למשך 45 דקות באמבט, לאחר מכן 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז 30 דקות נוספות באמבט.
כדי להפיק שיבוטים מסוג flipout, אספו עוברים במשך 24 שעות רצופות. פרוטוקול זה משתמש בדרייבר ספציפי מסוג class four. בצעו הלם חום לעוברי ה-flipout למשך שעה לאחר ההלם החום.
הניחו את פלטות האיסוף בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 centimeter, המוקפת ברקמות לחות ובתרבית. העוברים נשמרים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius במהלך גידול העוברים; יש לנטר ולהשלים את משחת השמרים לפי הצורך, מכיוון שהתזונה משפיעה באופן קריטי על ההתפתחות העצבית.
יש לתחזק את התרבית עד שניתן יהיה לאסוף זחלים בשלב הגלילה של הגוזל השלישי (wandering third instar). יש לשטוף את הזחלים בשלב הגוזל השלישי בעדינות ובקיצור במי ברז ולהעבירם לצלחת אגר. כעת, יש לבחון את הזחלים באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי עוצמתי ופינצטה לחרקים. יש לזהות זחלים בעלי נוירונים חיוביים ל-GFP בדופן הגוף ולהעבירם לזכוכית כיסויה עם שקע (depression slide) המכילה טיפה של 80% glycerol.
הנח זכוכית כיסוי על הפסית כדי לקבע את ה larva. ודא שלא נותר אוויר בין ה larva לבין זכוכית הכיסוי. השתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית כדי לדמות את הנוירונים הרלוונטיים דרך הקוטיקולה של ה larva.
כדי לשנות את מיקום הלבה לזווית צפייה משופרת, לחצו בעדינות על כיסוי הזכוכית (cover slip) כדי לגלגל את הלבה. התחילו פרוטוקול זה על ידי העברת לבה ללוח ההגנה של ה-SIL באמצעות פינצטה לחרקים. לאחר מכן, הצמידו אותה באמצעות סיכות בקצוות הקדמי והאחורי.
לאחר מכן, הוסיפו באפר HL 3.1 נטול סידן. כעת, בצעו חיתוך עד למחצית בשני קצות הלבה, בניצב לציר הקדמי-אחורי. לאחר מכן, חתכו לאורך קו האמצע שבין שתי הקנה.
חתכו בזהירות כל חיבור טרכיאלי בודד לדופן הגוף לפני הסרה עדינה של מערכת העיכול. פעולה זו שומרת על שלמותם של העצבים הסגמנטליים העוברים בין ה-PNS ל-CNS. כאשר הזחל עדיין מהוהן לפלטת מגן התא, קבעו אותו ב-4%Para formaldehyde ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסתובב בעדינות; בצעו כל דיסקציה בתוך פחות מחמש דקות.
אחרת, הניטריטים של נוירוני ההרשאה הדנדריטיים יתחילו להתפרק. לאחר הקיבוע, הסר רקמות זחלים עודפות. לאחר מכן, שטוף את הפילטים שלוש פעמים עם PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה.
לאחר השטיפות, הדגרי את הזחלים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בתמיסת חסימה (blocking solution) תחת ניעור עדין. עם השלמת החסימה, החליפי את תמיסת החסימה בתמיסת הנוגדן הראשוני. הניחי את הדגימה במכל פלסטיק קטן המוקף ברקמות לחות והדגירי אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, המשיכי את ההדגרה למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן יש לשטוף את נתח הלבה שש פעמים ב-PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה. כעת יש להוסיף את הנוגדן המשני ולהניח את הנתחים במיכל חשוך כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית) של הפלואורופור. יש להדגיר את הנתחים למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C, ולאחר מכן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לבסוף, שטפו את הפרוסות שש פעמים ב-PBST למשך 10 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן הרקמות מוכנות להרכבה. כדי להדמיץ את קצות האקסונים, פשוט הרכיבו את פרוסת הזחל כאשר צד הקוטיקולה פונה כלפי מטה ב-80% glycerol בתוך תג העמקה.
כדי להפיק תמונות ברורות יותר של דנדריטים, הכינו דגימה קבועה באמצעות לביבות כיסוי מצופות ב-PLL. כדי לסמן את לביבות הכיסוי, הכינו מנה של PLL. השלימו לנפח של 10 milliliters של מים מזוקקים פעמיים והוסיפו 20 microliters של Kodak photo flow.
הטבילו את לבישות הכיסוי למשך 30 דקות בתמיסת ה-PLL והניחו להן להתייבש באוויר לאחר ההוצאה. לאחר מכן, שטפו אותן קצרות במים ובאוויר. ייבשו אותן שוב.
חזור על תהליך זה פעמיים. החל מהטבילה ב-PLL, לזכוכיות הכיסוי המטופלות יהיה תוקף של כחודש. כעת, העבר פיליה של זחל מנותח כאשר צד השריר פונה כלפי מטה אל תוך טיפה של PBS על זכוכית כיסוי מצופה ב-PLL.
הפרוסה תידבק במהירות לזכוכית המכסה באמצעות פיסת נייר סופג. הסר כמה שיותר נוזלים, אך אל תאפשר לדגימה להתייבש לחלוטין. לאחר מכן, בצע דהידרטציה לפרוסות הזחלים באמצעות סדרה של רחצונות באתנול למשך 10 דקות כל אחד, החל מ-35% ethanol, ולאחר מכן 50%, ואז 70%, ואז 95%, ואז 100%, ולבסוף רחצון שני ב-100% ethanol.
לאחר רחצונות האתנול, בצעו שני או שלושה רחצונות של 10 דקות ב-xylene. לאחר מכן, הניחו טיפה של DPX על סלייד נקי והניחו בזהירות את זכוכית הכיסוי על ה-DPX, כאשר הצד הפונה למטה ממלא את השטח. שמרו את הסלייד בחושך והמתינו יום אחד עד להתייבסות ה-DPX.
לפני הדמיית הרקמה באמצעות מיקרוסקופיה מוקדית ובתוך הגוף (in vivo), ניתן ללכוד תמונות כדוגמה זו. העץ הדנדריטי השלם של נוירון עם עץ דנדריטי מסוג Class four. זוהי תמונה תקריבה של עץ דנדריטי מנוירון מסוג class three שסומן ב-IHC וקובע כראוי כדי לשמר את המורפולוגיה.
התמונה המוכנסת מראה את הפירוק שעלול להתרחש לאחר נתיחה וקיבוע לא מוצלחים. שכבה זו מראה סיומת אקסון בודדת מסוג class four ב-CNS. האקסון מסומן עם anti GFP בירוק וכל סיומות האקסונים מסוג class four צבועות יחד עם anti CD two במגנטה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע דיסקציה וקיבוע של הדגימות במהירות על ידי מעקב אחר האקסונים מהפריפריה אל ה-CNS. כדאי לזכור כי נוירונים של ה-PNS בכל גוף יבצעו הקרנה סגמנטלית לסגמנט הקוגניטיבי של קוד העצב הוונטרלי. כמו כן, אם ברצונכם להדמיאן רק דנדריטים, הסירו את ה-CNAs במהלך הדיסקציה, וניתן לבצע את הצביעה בתוך מבחנות במקום על פלטות.
בעת קיבוע פילטים אלו לצילום דנדריטים, חתכו תחילה את הראש באמצעות ווים פה (mouth hooks) ואת החלק האחורי באמצעות מספריים דקים (sparkles), לצורך הכנה מיטבית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להדמיה של מורפולוגיית הסתעפויות דנדריטיות בנורונים של זחלי Drosophila. השיטה כוללת יצירת שיבוטים גנטיים המסומנים ב-GFP וניתוח המבנים הדנדריטיים שלהם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של אימונופלואורסצנציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- התפתחות נוירולוגית
- ניתוח גנטי
רקע
- נוירונים בעלי הסתעפות דנדריטית משמשים כמודלים לחקר התמיינות של נוירונים.
- הבנת התוכניות הגנטיות השולטות בזהות עצבית היא חיונית.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה מפורטת של מבנים נוירונליים.
- פסיפסים גנטיים יכולים לסייע בהבהרת מנגנונים הספציפיים לסוגי נוירונים.
מטרת המחקר
- להדמיה של המורפולוגיה של נוירוני ההסתעפות הדנדריטית בזחלים של Drosophila.
- לניתוח הגורמים הגנטיים המשפיעים על צורת הדנדריטים והחיווט שלהם.
- לספק מדריך מעשי עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף והזקנה של עוברים של Drosophila.
- יצירת שיבוטים גנטיים המסומנים ב-GFP באמצעות הלם תרמי.
- דימוג של שיבוטי נוירונים פלואורסצנטיים להערכת מבנים דנדריטיים.
- דיסקציה (ניתוח), קיבוע וצביעה אימונוהיסטוכימית של זחלים לצורך מיקרוסקופיה.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מורפולוגיית נוירונים עם הסתעפות דנדריטית.
- זיהוי תוכניות גנטיות מרכזיות המשפיעות על זהות עצבית.
- הדגמת יעילות הפרוטוקול בניתוח מורפולוגי.
- תובנות לגבי החיווט החיצוני של נוירונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר נוירונים של Drosophila.
- הממצאים תורמים להבנת תהליכי התפתחות נוירולוגית.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על מתודולוגיה זו כדי לבחון שאלות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח פסיפס גנטי של נוירונים תחושתיים בזחלי Drosophila מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של מנגנוני התמיינות וחיווט עצבי, ובכך תומך בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים במחקרים על התפתחות מערכת העצבים. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי בקישור הפרעות גנטיות לתוצאות נוירונליות מורפולוגיות ופונקציונליות, ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות סיכון במסלולי גילוי הממוקדים בביולוגיה של מערכת העצבים. יכולת זו רלוונטית ישירות לצוותי ביו-פארמה המחפשים מודלים כמותיים ורובסטיים להפחתת סיכונים ביעדים ובמסלולים מוקדמים של התפתחות מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תוכניות גנטיות השולטות בזהות הנוירונים ובמורפולוגיה הדנדריטית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות הבהרה של נתיבי התמיינות ספציפיים לסוג התא.
- מקל על ביצוע ניתוח השוואתי בין ארכיטקטורות דנדריטיות פשוטות למורכבות.
- מספק נתונים מורפומטריים כמותיים לתיקוף מטרות מונחה-השערה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים מודלים של נוירונים מהסוג שניתן לתמרור גנטי ובדיקה מאומתת, לצורך סריקות המשך.
- מספק פלטי דימות בעלי תוכן גבוה (high-content imaging) הניתנים לשחזור, לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) באמצעות תהליכי סימון גנטי ודימות חסונים.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות גנטיות או פרמקולוגיות על מורפולוגיה נוירונלית.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מקשר פנוטיפים מורפולוגיים עם פלטים תפקודיים הרלוונטיים לעיבוד חושי ולהתנהגות.
- מספק רציפות מגילוי גנטי ועד תיקוף של מודל פרה-קליני בהקשרי התפתחות נוירולוגית.
- תומך בזיהוי של ביומרקרים תרגומיים הקשורים למבנה ותפקוד נוירונליים.
- מפחית סיכונים בקידום מטרות התפתחותיות נוירולוגיות על ידי מתן קישור מכניסטי לתוצאות ברמת המעגל.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
סבב העבודה זה של פסיפס גנטי והדמיה משלב שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך זיהוי מועמדים מובילים (leads) ועד לפיתוח מודלים פרה-קליניים במסלולי מחקר המתמקדים בנוירוביולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי תפקוד גנים בדיפרנציאציה ובחיווט עצבי.
- סינון (Screening): מספק פלטי הדמיה כמותיים וסטנדרטיים לצורך ניתוח השוואתי של וריאנטים גנטיים.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח מורפומטרי וסטטיסטי של מאפיינים דנדריטיים ואקסונליים במختلف מחלקות של נוירונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים מורפולוגיים לבין מדדים תפקודיים והתנהגותיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר עבור בירור גנטי ופארמקולוגי של התפתחות נוירונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות נוירו-התפתחותיות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של דימוי ואנליזה סטנדרטיים, הניתנים לשחזור ובנייה מחדש (scalable).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי ניסויים של נוירוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ומסלולים נוירו-התפתחותיים מותאם סיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של Drosophila, דימות קונפוקלי וניתוח מורפומטרי.
- נדרשת גישה לתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וצביעה אימונוהיסטוכימית.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי הניתוח, הקיבוע והדימות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור כלים גנטיים ותנאי דימות.
- מהירות הכנת הדגימות היא קריטית לשימור המורפולוגיה העצבית ואיכות הנתונים.
