בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

לנתח נגעים מוכתמים של דמיאלין מהקורפוס קלוסום של מוח עכבר.

נגעים אלה מכילים מיקרוגליה השוכנת במוח המבטאת את האינטגרין CD11b על פני התא.

אוספים את הרקמה ומוסיפים תמיסה המכילה אנזים פרוטאוליטי ו- DNase.

האנזים משפיל את המטריצה החוץ-תאית, בעוד ש-DNase משפיל את ה-DNA החופשי.

הוסף חיץ קר וסנן את המתלה דרך מסננת כדי להסיר גושים תאיים.

צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים הגלולים בתווך שיפוע צפיפות.

כיסוי עם חיץ וצנטריפוגה לאיסוף הפסולת שנותרה בשכבות העליונות; תאים שלמים מתיישבים בתחתית.

הסר את הפסולת והשהה מחדש את התאים במאגר.

הוסף חרוזים מגנטיים נגד CD11b כדי לסמן את המיקרוגליה.

טען את התאים על עמודה המכילה כדורים פרומגנטיים הממוקמים בשדה המגנטי של המפריד המגנטי.

תחת השדה המגנטי החיצוני, המיקרוגליה הקשורה לחרוזים נשמרת בעמודה בעוד תאים לא קשורים זורמים דרכה.

הסר את העמוד מהשדה המגנטי. הוסף חוצץ כדי לסלק את המיקרוגליה.

התחל בניתוח מיקרו של הנגעים המסומנים בצבע ניטרלי סביב הקורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ. צנטריפוגה של הרקמה המנותחת ב-300 x גרם למשך 30 שניות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור. מחממים מראש תערובת אנזים 1 ותערובת אנזימים 2 עד 37 מעלות צלזיוס בחממה. לאחר מכן, הוסיפו 1,950 מיקרוליטר של תערובת אנזימים מחוממת מראש לדגימה אחת ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מוסיפים 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים שחוממה מראש 2, ומערבבים בעדינות.

לאחר העיכול, הוסיפו 4 מיליליטר PBS קר לצינור, ונערו בעדינות. צנטריפוגה את דגימות הרקמה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושואבות את הסופרנטנט לאט ומלא. השהה מחדש את כדור התא בעדינות עם 1,550 מיקרוליטר PBS קר. מוסיפים 450 מיקרוליטר מהתמיסה הקרה לפינוי פסולת, ומערבבים אותם היטב.

השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לכסות את התערובת לאט ובעדינות רבה, עם 2 מיליליטר PBS קר. צנטריפוגה, התערובת ואז חפש את 3 השכבות. השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לשאוב לחלוטין את 2 השכבות העליונות, ומלא את הצינור עד 5 מיליליטר במאגר טעינה קרה. הפוך בעדינות את הצינור 3 פעמים.

לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה ושאיפת הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא עם 90 מיקרוליטר של מאגר טעינה, והוסיפו 10 מיקרוליטר של חרוזי CD11b. מערבבים היטב ודוגרים במשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה מוסיפים 1 מיליליטר ממאגר הטעינה, ושוטפים את התאים על ידי פיפטה עדינה של הנוזל למעלה ולמטה עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר.

צנטריפוגה של התאים ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4:00 מעלות צלזיוס, ושואבים את הסופרנטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא קשורים. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר הטעינה, והניחו את עמודת ה-MS עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי. שטפו את העמוד עם 500 מיקרוליטר ממאגר הטעינה כדי להגן על התאים, ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי על פי פרוטוקול היצרן.

החל את תרחיף התאים על עמודת MS, והשליך את הזרימה המכילה את התאים הלא מסומנים. הוסף 500 מיקרוליטר ממאגר הטעינה כדי לשטוף את העמוד, והסר אותו מהמפריד. הנח את העמוד על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר והוסף 1 מיליליטר ממאגר הטעינה לעמודה. לבסוף, דחוף את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף החוצה את התאים המסומנים מגנטית.