בידוד ותרבית של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים במוח התיכון

קח רקמת רצפת מוח אמצעית מבודדת מאזור הגחון של המוח התיכון של עוברי עכברים.

הרקמה עשירה בפיתוח נוירונים דופמין, המשחררים את המוליך העצבי דופמין.

הוסף תמיסת אנזים כדי לפרק את מטריצת הרקמות, ובכך לשחרר את התאים.

הוסף תמיסת סרום המכילה DNase I ונתקע מכנית את הרקמה המעוכלת כדי ליצור תרחיף תאים. חלבוני הסרום מעכבים את האנזימים, בעוד ש-DNase I מפרק DNA חוץ-תאי המשתחרר במהלך ליזיס התאים, ומונע היווצרות תאים.

תנו לפסולת הרקמות להתיישב והעבירו את התאים התלויים לצינור חדש.

צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט, ואז השהה מחדש את התאים בתווך נוירון דופמין, או DPM.

קח מיקרופלייט מצופה במצע תרבית תאים במרכז הבארות, ויוצר מיקרו-איים.

העבירו את התאים לאמצע המיקרו-איי כדי לתרבית אותם בצפיפות גבוהה.

דגירה, מה שמאפשר לתאים להיצמד למיקרו-איים.

מלאו את הבארות ב- DPM ודגרו, מה שמקל על צמיחת נוירוני הדופמין.

כדי להקים תרביות ראשוניות של המוח התיכון העוברי מעוברי עכברים ביום 13.5 של עכברים, אסוף את כל רצפות המוח התיכון שנקטפו לאותו צינור של 1.5 מיליליטר, ושטוף את הדגימות שלוש פעמים, עם 500 מיקרוליטר של סידן ו-HBSS ללא מגנזיום בכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את ה-HBSS ב-0.5% טריפסין לדגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטר של DNase I טרי בתמיסת FBS לרקמה המעוכלת חלקית והשתמש בפיפטת זכוכית סיליקון עם קצה מלוטש באש כדי לשבש את הרקמה. כאשר ניתן להבחין רק בחלקיקים זעירים שבקושי נראים לעין, אפשרו לשברי הרקמה הללו להתיישב בתחתית צינור המיקרו-צנטריפוגה, והעבירו את הסופרנטנט לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי ריק של 15 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של HBSS לצינור המכיל DNase I ב-FBS, וערבב מספר פעמים על ידי פיפטינג. העבירו מיליליטר אחד של תמיסה זו לחלקיקי הרקמה הנותרים, וטריטו שוב את הדגימות. לאחר מכן, אגד את תרחיף התאים המעוכל עם צינור הסופרנטנט מבלי להעביר שברי רקמה שנותרו. לאחר טריטורציה של דגימת הרקמה פעם נוספת עם ה-DNase I הנותר ב-FBS ב-HBS, משקעים את התאים שנאספו על ידי צנטריפוגה, ושואבים את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.

שטפו את התאים פעמיים בשני מיליליטר של מדיום נוירון דופמין מחומם בכל שטיפה, והשעו מחדש את התאים ב-3 x 10⁴ תאים לכל שישה מיקרוליטרים של ריכוז בינוני טרי וחם בצינור מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הסר את המדיום מכל מיקרו-אי שהוכן בעבר וערבב את התאים עם פיפטינג עדין לפני השימוש בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להוסיף שישה מיקרוליטר של תאים לכל מיקרו-אי.

לאחר הוספת כל התאים, מלאו את הבארות הריקות בשולי הצלחת ב-150 מיקרוליטר מים או PBS, והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שעה. בתום הדגירה מוסיפים 100 מיקרוליטר מדיום נוירונים דופמין טרי לכל באר, ומחזירים את הצלחת לחממה.