מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחור טפילים מסוג plasmodium, fpar וטפילים אחרים הקושרים לתאי אנדותל של המוח האנושי. דבר זה מושג תחילה על ידי דגירה של תרבית של plasmodium, fpar וטפילים, המכילה תערובת של תאי דם אדומים נגועים ולא נגועים, עם שכבה של תאי אנדותל של המוח האנושי. השלב הבא הוא שטיפת תאי דם אדומים לא נגועים ולא קשורים על ידי שטיפה מספר פעמים עם מדיום תרבית. לאחר מכן מתווספים תאי דם אדומים טריים כדי לאפשר צמיחה נוספת של אוכלוסיית הטפילים.

השלב הסופי, מספר שבועות לאחר מכן, הוא לחזור על תהליך הברירה הכולל ברגע שמושג מספר מספיק של טפילים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה כדי להראות כמות גבוהה של טפילים הקשורים ל-HBE five i. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המלריה המוחית, כגון זיהוי ליגנדים של טפילים או מולקולות קולטן של המאכסן המעורבות בתהליך ה-cyto endurance.

הכינו תאי דם אדומים אנושיים מדם שלם מסוג O חיובי, על ידי הפרדת תאי הדם האדומים מתאי הדם הלבנים באמצעות העברה דרך מסנן להסרת לוקוציטים. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1000 G למשך 10 דקות ושטפו את המשקע עם מצע PMI Incomplete.

חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת נוספת, ולאחר מכן השב את המשקע לסuspended. בתווך PMI incomplete בריכוז של 50% hematocrit, תאי דם אדומים מאוחסנים בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך שבוע. תרבוב תאי דם אדומים נגועים ב-Odium Valspar.

עם מצע RPMI מלא בריכוז 2% hematocrit והדגירה תתבצע מדי יום בטמפרטורה של 37 °C עם 3% carbon dioxide, 1% oxygen ו-96% nitrogen. הכינו משטח גימסה (giemsa smear) כדי להעריך את שלב ההתפתחות של הטפילים. החליפו את המצע מדי יום על ידי סבוב של התרבית ב-500 G למשך חמש דקות.

שאיבת הנוזל העליון והוספת מצע RPMI מלא טרי בערך פעם בשבוע. סנכרון הפלסומים על ידי טיפול ב-sorbitol מימי בריכוז 5%. ניתן לבצע את בדיקת הבחירה ביום שאחרי שמתבחנת תרבית בשלב הטבעת (ring stage) עם רמה מינימלית של 5% עד 10% Parasitemia.

בנוסף, נדרשת כמות מספקת של תרבית טפילים ליצירת נפח של 30 µL של תאי P עבור כל צלחת של 60 mm של תאי hbe five eye. הכינו צלחת לתרבית רקמות של 60 mm לקליטת שורת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של המוח האנושי, או H back fivei, על ידי הוספת 2 µg/cm² של פיברונקטין ותמיסת סלין סטרילית לצלחת.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך 5 עד 20 דקות, ולאחר מכן שאבו את תמיסת הפיברונקטין. לאחר מכן, קצרו את תאי HBE five I מבקבוק רקמה של 25 סמ"ר באמצעות יוניזציה וסנטריפוגציה, השעו את משקע התאים ב-10 ml של DMEM, מצע גידול מלא. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 ml מתליה תליה זו לצלוחית תרבית הרקמה שעברה טיפול בפיברונקטין ודגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך יומיים עד שלושה ימים, עד שהתרבית תגיע ל-50% עד 100% התמלאות (confluency) ותרביות הפarasite יהיו מוכנות ל-cyto aian ביום הבדיקה.

תרבית ה-HBE five I צריכה להיות ברמת התלכדות (confluency) של 50% עד 100%. תרבית הטפילים צריכה להיות בשלב הטרופוזואיטים הפיגמנטריים עם לפחות 5% עד 10% טפילים ו-2% המטוקריט. ראשית, העבירו בעזרת פיפט 1.5 milliliters של תרבית טפילים מבקבוק התרבית לשפופרת צנטריפוגה של 15 milliliters.

סובב את התרבית בצנטריפוגה ב-500 G למשך חמש דקות וסנן מחדש ב-10 milliliters של מצע DMEM חסר, חם וטרי. חזור על שלב שטיפה זה פעם שנייה לאחר סיום הסבב האחרון בצנטריפוגה.

שאיפה של ה-DMEM incomplete medium, וריספנד של המשקע בנפח 30 µL ב-1.5 mL של DMEM incomplete medium, המועשר ב-1% BSA. לאחר מכן, הוצא את צלחת ה-60 mm של hvac.Five.

שאבו את מדיום התרבית מתאי העין ושטפו פעמיים עם 3 mL של DMEM. מדיום לא שלם. הוסיפו את תמיסת הטפילים לצלח של חמשה תאי HPE ודגרו באינקובטור לתרביות רקמה למשך 75 דקות בסך הכל.

פעמיים במהלך תקופת ההדגרה, השעה את הפרזיטים על ידי נעירה וסיבוב עדין של הצלחת לאחר ההדגרה. שטוף את הצלחת חמש פעמים באמצעות שאיבת המצע בעזרת פיפט פלסטיק (pasta pipette) ולהוספת 3 mL של מצע DMEM חסר (incomplete medium) חם, ולאחר השטיפה האחרונה, נער בעדינות את הצלחת ובדוק אותה תחת מיקרוסקופ הפוך. אם עדיין נראים תאי דם אדומים רבים שאינם מזוהמים, חזור על הליך השטיפה כפי שמתואר לעיל כדי להסירם.

לאחר שאיבת המצע מהצלחת, השעה 40 µL של נפח תאים דחוס (packed cell volume) של כדוריות דם אדומות טריות במצע RPMI complete המחומם, והוסף את תרחיף התאים לצלחת. הנח את הצלחת בתא דגירה אטום. לאחר מכן, הזרם לצלחת גזים המורכבים מ-3% carbon dioxide, 1% oxygen ו-96% nitrogen למשך שלוש דקות.

והנח את התא באינקובטור ב-37 °C למשך הלילה. במהלך דגירה זו, טפילים בשלב הסכיזונט מתבקעים והמרוזואיטים פולשים מחדש לתאי הדם האדומים. למחרת, אסוף את הטפילים בשלב הטבעת באמצעות שטיפה.

באמצעות מצע RPMI חסר באופן דומה לשלב הקודם, אך תוך ביצוע פיפטינג נמרץ יותר של המצע וניעור של הפלטה. שמור את כל המצע שנעשה בו שימוש, אשר יכיל תאי דם אדומים שהושעו, במבחנה קונית של 15 milliliter. בדוק את הפלטה תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שכל תאי הדם האדומים הוסרו מצנטריפוגת הצלחת.

יש להשליך את הנוזל העליון מהמבחנה המכילה את המצע מהצלחת השטופה על מנת לרכוש משקע של הטפילים, ולשחזר אותם ב-5 mL של מצע RPMI מלא. לאחר מכן, יש להעביר את התערובת לבקבוק תרבית (flask) של 25 cm² לצורך גידול. הטפילים גודלים במשך שבועיים עד ארבעה שבועות, עד לקבלת כמות חומר מספיקה המאפשרת ביצוע סבב בחירה חדש.

טפילים מסוג HB three שלא עברו סלקציה מראים רמה נמוכה של קישור לתאי hbe five eye. תמונה זו מציגה תאי hbe five eye שקובעו ב-2% glutaraldehyde ונצבעו ב-giemsa, כפי שנראים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 1000 פעמים; הצילומים נלקחו לאחר שכיבסו ושטפו תאי דם אדומים שאינם נגועים ותאי דם אדומים נגועים שלא נקשרו. לאחר כל סבב סלקציה, מספר גדל והגדל של טפילים נקשר לתאי האנדותל, ואת הסלקציות ניתן לחזור עליהן במרווחי זמן קצרים יותר לאחר חמישה סבבי סלקציה.

אוכלוסיות טפילים בעלות קישוריות גבוהה התקבלו כפי שמוצג כאן עם טפילי HB three HBE. טבלה זו מציגה סיכום של זני plasmodium alspar שנבחרו בהצלחה לקישור ל-HE five. אני מציין כי HB three נבחר גם על HE five I שהופעל על ידי TNF לאחר חמישה סבבי בחירה.

זן DD two לא הראה עלייה בקישור ל-HBE five I בהשוואה ל-DD two שאינו נבחר. תמונה זו, בהגדלה של 400 פעמים, מראה קישור של טפילי plasmodium alspar HB three לתאי אנדותל עוריים HD MEK לפני הברירה. כאן מוצג הקישור של טפילי plasmodium alspar HB three לאותו קו תאי אנדותל עוריים לאחר ארבעה סבבי ברירה.

איור זה מראה קישור של טפילים מסוג plasmodium spar HB three לתאי אנדותל ריאתיים מסוג HP ME לפני ברירה. כעת, הקישור של טפילים מסוג plasmodium spar HB three לתאי H HP ME מוגבר לאחר ארבעה סבבי ברירה. למרות שמצע התרבית עבור hd e, C ו-H HP EC שונה מעט, הפרוטוקול ששימש לברירה היה זהה לזה של hbe five I. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו R-T-P-C-R או מיקרו-אנליזה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אפיון השעתוק של אנטיגן פני השטח משתנה בטפילים שלא עברו ברירה ובטפילים שעברו ברירה.