תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

קח פרוסת רשתית של עכבר מותאמת כהה בתוך תא הקלטה בחדר חשוך. הרשתית יושבת על בסיס מלאכותי תומך המונח מעל תלוש כיסוי. יש לערבב את הפרוסה ב- aCSF.

הרשת העצבית ברשתית כוללת קולטני אור המקושרים באופן סינפטי לתאים דו קוטביים המסונפסים עם תאי גנגליון.

מקם פיפטת הקלטה ליד הרשתית.

תחת מיקרוסקופ, הפעל לחץ חיובי תוך כדי התקרבות לתא גנגליון מטרה.

עבור ללחץ שלילי כדי למשוך טלאי ממברנה, ואז קרע אותו כדי ליצור המשכיות עם הציטופלזמה.

בחושך, קרום קולטני האור נשאר דה-פולריזציה, מה שמוביל לשחרור נוירוטרנסמיטרים.

נוירוטרנסמיטורים הנקשרים לקולטני תאים דו קוטביים מפעילים סגירת ערוץ קטיון, ומעכבים את העברת האותות.

החל דופק אור כדי להקפיא את קולטני האור. שחרור המוליך העצבי המופחת מפעיל פתיחת תעלות קטיון בתאים דו קוטביים.

זרם קטיון גורם לשחרור נוירוטרנסמיטר שנקשר לקולטני תאי גנגליון, ויוצר פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר שנרשם על ידי הפיפטה.

להקלטות מהדק טלאי, העמיסו את צינורות הזילוף במדיום של איימס ואפשרו לכל הבועות לעבור מהצינור. לאחר הכנת פיפטות הקלטה עם מושך זכוכית, מלאו מחדש את הקצה בתמיסת פיפטה. לאחר מכן, השתמש במילוי מיקרופיפטה כדי למלא כשליש מהפיפטה. לאחר המילוי, אחסן כל פיפטה בקופסת פיפטה לחה.

לאחר מכן, הפעל את הציוד להקלטות מהדק תיקון, כולל המחשב, המגבר, מצלמת CCD והמיקרוסקופ. בעבודה בתנאי חושך הנח תכשיר פרוסת רשתית על במת המיקרוסקופ בעזרת צופה אינפרא אדום. לאחר שהוא משותק, התחל זלוף רציף.

הגדר את טמפרטורת הזלוף ל-33 עד 37 מעלות צלזיוס. הצג את משטח הפרוסה באמצעות מצלמת CCD. התמקד במיקום היעד שבו שוכנים סוגי תאי המטרה. בחר תא בעל מראה בריא להקלטת מהדק טלאי. לאחר זיהוי תא בריא, הניחו פיפטה מקליטה במחזיק פיפטה, והעבירו את הפיפטה להכנת הפרוסה.

כשהוא קרוב להכנת הפרוסה, מצא את קצה הפיפטה במיקרוסקופ. ברגע שקצה הפיפטה נראה מתחת למיקרוסקופ, הזיזו את הקצה כלפי מטה לכיוון תא המטרה. לאחר מכן, הגדר את המגבר, והתאם את הפיפטה לפיקואמפר 5 וולט לננו-אמפר. התחל שני פולסים חשמליים רציפים של כ-5 מילי-וולט וכ-10 הרץ ובדוק את התנגדות הפיפטה.

התנגדות אידיאלית היא בין 5 ל-12 מגה-אוהם עבור רוב נוירוני הרשתית. כשהוא מוכן, השתמש בפיה או במזרק כדי לפוצץ את התמיסה הפנימית, עד שקצה הפיפטה נמצא על פני תא המטרה. כאשר הלחץ החיובי יוצר גומה קטנה על פני התא, קדם מעט את הקצה והפסק לנשוף החוצה.

אם התנגדות הפיפטה עולה ברציפות, השאירו אותה ועקבו אחר ההתנגדות עד שהיא מגיעה ליותר מ-1 ג'יגה-אוהם. אם ההתנגדות לא עולה באופן ספונטני, הפעל בעדינות לחץ שלילי עד שהיא הופכת לג'יגה-סיל. לאחר השגת הג'יגה-סיל, שנה את פוטנציאל ההחזקה ל-70 מילי-וולט שלילי.

לאחר מכן, הפעל לסירוגין לחץ שלילי כדי לקרוע את הממברנה בתוך קצה הפיפטה. כאשר נוצרת תצורת התא השלם, התנגדות הפיפטה יכולה להיות בין 500 מגה-אוהם לג'יגה-אוהם אחד, והזרם הקיבולי ניתן לצפייה. רשום את יחס ה- IV משלילי 80 עד 40 מילי-וולט. סוגים שונים של תעלות מגודרות מתח יופעלו בהתאם לסוג התא. לבסוף, הקלט זרמים או מתחים סינפטיים מעוררי אור.