Name: Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד RNA ממוח עכבר באמצעות מיקרודיסקציה ללא לייזר. השיטה משלבת חיתוך קורונלי עם כלי קידוח רקמות להשגת RNA איכותי לניתוח תבניות ביטוי גנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לפרויקטים של מחקר מתקדם לביטחון (DARPA) ומשרד המחקר של הצבא (ARO), מספר מענק W911NF-10-1-006.

1. הגדרה והכנה של הדגימה
<ol>
	<li>הוסיפו לתמיסת המלחים המאוזנת של ארל (EBSS) נתרן ביקרבונט (0.44 g לכל 100 mL EBSS) וגלוקוז (0.884 g לכל 100 mL EBSS)9. טפלו ב-EBSS באמצעות DEPC (0.1 mL לכל 100 mL EBSS) למשך 12 שעות לפחות ב-37 °C בבקבוק או בכלי זכוכית בעל מכסה הברגה שניתן לעקר באוטוקלאב.</li>
	<li>הניחו פיפטות פסטור מזכוכית בגודל 5 ¾" בתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח 1000 mL, והניחו מכחולי אמנות, כאשר הסיבים פונים כלפי מעלה, בתוך משחור זכוכית בנפח 100 mL. הוסיפו תמיסת DEPC מספקת (0.1 mL לכל 100 mL ddH2O) כדי לכסות את הפיפטות והמכחולים, בהתאמה. כסו את כלי הזכוכית ואת המשחור בנייר אלומיניום, והדגירו למשך 12 שעות לפחות ב-37 °C.</li>
	<li>לאחר הדגרה של 12 שעות עם DEPC, חממו את כל החומרים שעובדו ב-DEPC לטמפרטורה של &gt;100 °C למשך 15 דקות לפחות. הוציאו את ה-EBSS וקררו לטמפרטורת החדר לפני אחסון ב-4 °C. שפכו את ה-ddH2O מהכלי ומהמשחור; המשיכו להדגיר ב-&gt;100 °C עד שהחומרים יתייבשו. הוציאו, קררו לטמפרטורת החדר ושמרו לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>ביום הניסוי, טפלו בכל משטחי העבודה באמצעות RNaseZap.</li>
	<li>הניחו ושמרו את ה-EBSS באמבט מים המכוון ל-40 °C. כדי להבטיח באפרינג וחמצון של ה-EBSS, הזרים גז 95%/5% O2/CO2 על ידי הנחת צינור גז בתוך פיפטת פסטור נקייה מ-RNase והחדרת הפיפטה לתוך ה-EBSS. כסו את פתח המיכל של ה-EBSS.</li>
	<li>הכינו סכיבת רקמות (tissue slicer) מסוג Stoelting לשימוש בחיתוך סדרתי של רקמת המוח. טפלו במשטחים העליון והתחתון של סכיבת הרקמות ב-RNaseZap. הצמידו פיסת מלבנית של נייר סינון Whatman #4 למשטח הפלקסיגלאס של סכיבת הרקמות. הצמידו להב תער דו-צדדי לזרוע הסכיבה. אפסו את המיקרומטר, וכווןו את הגובה המינימלי של זרוע הסכיבה כך שלהב התער יחתוך את נייר הסינון, אך לא את לוח הפלקסיגלאס.</li>
	<li>אספו את כל החומרים הנוספים הדרושים למיקרו-דיסקציה, כולל צלחות תרבית תאים בנפח 60x15 mm נקיות מ-RNase, מחללי רקמות (tissue corers) מסוג Harris Uni-Core, טיפים של מיקרופיפטה בנפח 200 μL נקיים מ-RNase להצמדה לצינור הגז לצורך חמצון של חתכים קורונליים של המוח במהלך דגימת המיקרו-סמפלים, מספריים קמורים, קרח יבש ומבחנות לאיסוף רקמות. הניחו את המבחנות על קרח יבש.</li>
</ol>
2. הוצאת המוח וחיתוך קורונלי
<ol>
	<li>הנח את העכבר לתוך DecapiCone ובצע עקירה (decapitation) באמצעות גילוטית למכרסמים. הוצא את הראש מה-DecapiCone והנח אותו על משטח שטוח. בעזרת סקלפל, חתוך את העור לאורך קו האמצע של הגולגולת, החל מכ-3 mm קודאלית לנחיר. קלף את פתחי העור לצדדים כדי לחשוף את הגולגולת ואת מכתשי העין.</li>
	<li>בעזרת מספריים מעוקלים, חתוך את שני העצבים האופטיים, ובכך נתק את חיבורם לעין. פתח את חלל הגולגולת על ידי שבירה זהירה של העצמות העורפיות (occipital) והבינ-קודקודיות (interparietal) והסרה של העצמות הקודקודיות (parietal) והמצחיות (frontal) הדורסליות. בעזרת קרונז'ור לעצם (bone rongeur), שבור את העצמות הנחריות והדמעיות כדי לחשוף את הפחיתים הריחניים (olfactory bulbs). השתמש במספריים מעוקלים כדי לחתוך את הפחיתים הריחניים מהמוח הרוסטרלי. הוצא את המוח כולו כאשר המוח האחורי נשאר שלם. הנח את המוח בחלקו העליון של צלחית תרבית תאים מסוג Cellstar, נקייה מ-RNase, בגודל 60 x 15 mm. העבר את הדגימה למשטח העבודה לדגימת רקמות.</li>
	<li>השתמש בפיפטה נקייה מ-RNase כדי להרטיב באופן שמרני את נייר המסנן המחובר לקוצץ הרקמות (tissue chopper) בעזרת EBSS. הרטב את רקמת המוח ב-EBSS.</li>
	<li>העבר את המוח לקוצץ הרקמות והגדר אוריינטציה מתאימה. הערה: המוח צריך להיות ממוקם כך שהמשטח הוונטרלי ינוח על נייר המסנן. קו האמצע (החריץ הבין-המ hemispheric) צריך להיות מאונך ללהב הקוצץ, והקצה הרוסטרלי של המוח צריך להיות צמוד ללהב.</li>
	<li>השתמש במברשת אמנותית שעברה טיפול ב-DEPC כדי להחזיק את המוח במקומו על ידי הפעלת לחץ עדין על המשטח הדורסלי של המוח. תוך כדי החזקת המוח במקומו, הרם את מנוף מחזיק הלהב לגובה של כ-4-5 cm מעל משטח הרקמה הדורסלי והחזק אותו במצב זה. הסר את המברשת ממשטח המוח, וכייל 750 μm באמצעות המיקרומטר. שחרר את המנוף שייפול, ובכך יקצוץ את הרקמה ויצור חיתוך קורונלי בעובי 750 μm.</li>
	<li>בעוד להב הקוצץ נשאר סטטי, השתמש בתנועה גולגלית עם מברשת האמנות כדי להזיז בעדינות את חיתוך הרקמה הרחק ממשטח הלהב. העבר מיד את חיתוך הרקמה ל-EBSS מחומצן שבצלחית הפטרי. חוקר שני יכול להתחיל בשלב 3.1.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.5 ו-2.6 עד לקבלת חיתוך סדרתי של המוח לכל אורך המישור הרוסטרו-קודאלי.</li>
</ol>
3. מיקרו-דיסקציה של אזורי מוח
<ol>
	<li>כווננו את התאורה כדי להבטיח שהארת הדגימה לא תיחסם במהלך המיקרו-דיסקציה של הרקמה. כווננו את המיקום ואת הזרימה של תערובת 95%/5% של O2/CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצנת ומבופרת עבור הרקמה במהלך המיקרו-דיסקציה.</li>
	<li>זהו את חתך המוח הקורונלי הכולל את אזור העניין. יישרו את חתך המוח על תחתית צלחת הפטרי באמצעות מכחול אמנות. בחרו את דוקר הרקמה (tissue corer) בעל הקוטר המתאים בהתבסס על Table 1 או מקורות אחרים. תוך כדי החזקת חתך הרקמה הקורונלי במקומו עם מכחול האמנות, הורידו את קצה החיתוך של דוקר הרקמה אל מעל פני חתך הרקמה.</li>
	<li>תוך הפעלת לחץ, לחצו את קצה דוקר הרקמה דרך חתך הרקמה ומטה בחוזקה אל תחתית צלחת הפטרי. השתמשו בתנועה סיבובית כדי להבטיח שאזור העניין הופרד מהרקמה שמסביבו. הרימו בזהירות את דוקר הרקמה מחתך הרקמה ושחררו את המיקרו-פאנץ' (micropunch), כך שיצוף ב-EBSS.</li>
	<li>בעזרת מכחול אמנות, העבירו מיד את מיקרו-פאנץ' הרקמה למבחנה לאחסון היציבה ב-80 °C הנשמרת על קרח יבש. הרקמה אמורה להיצמד בקלות לדופן המבחנה. החזירו את המבחנה המכילה את המיקרו-דגימה לקרח היבש.</li>
	<li>חזרו על שלבים 3.2 - 3.4 עבור כל אזור מוח רלוונטי.</li>
</ol>
4. ארכיבון רקמות
<ol>
	<li>לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה, השתמשו במערכת הסריקה VisionMate כדי להקליט את הברקודים המתאימים לכל מבחנה מסוג TrakMates המכילה דגימה. ברגע שמעמד המבחנות של TrakMates בעל 96 התאים התמלא, סרקו במהירות את המעמד והעבירו מיד את דגימות הרקמה למקפיא בטמפרטורה של -80 °C עד לביצוע הפקת ה-RNA.</li>
</ol>
5. מיצוי RNA כולל
<ol>
	<li>הכינו סבירת עבודה נקייה מ-RNase באמצעות RNaseZap. הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזי מגנט (Bead Mix) ותמיסת ליזיס/קישור (Lysis/Binding Solution) כפי שמתואר בפרוטוקול MagMAX-96 Total RNA Isolation10.</li>
	<li>הוציאו את דגימות הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של -80 °C והניחו את המבחנות ישירות על קרח יבש.</li>
	<li>הוסיפו 100 μL של תמיסת ליזיס/קישור למבחנת TrakMates המכילה דגימה. חברו פסטל בגודל של מבחנה של 0.5 ml, הנקי מנוקלאס, למערבל הפלטיות (pellet mixer) והומוגניזו את הרקמה. באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס, העבירו את הדגימה ההומוגנית לבאר בלוח תרבית רקמה של 96 באערים בעלי תחתית עגולה. הוסיפו מיד 60 μL של 100% isopropanol לדגימה באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס, וערבבו על ידי שאיבה ופליטה (pipeting up and down) 3-4 פעמים.</li>
	<li>הוסיפו 20 μL של תערובת החרוזים (Bead Mix) לדגימה באמצעות טיפ פפטה בעל ספיגה נמוכה ונקי מנוקלאס. ערבבו על ידי שאיבה ופליטה 3-4 פעמים.</li>
	<li>חזרו על שלבים 5.3-5.4 עבור כל דגימות הרקמה.</li>
	<li>פעלו לפי שלבי פרוטוקול MagMAX-96 Total RNA Isolation החל משלב III.A.2 להשלמת מיצוי ה-total RNA. הערה: קיימים ערכות מסחריות אחרות לבידוד total RNA המבוססות על חרוזי מגנט; עם זאת, הן לא נבחנו במחקר זה. אנא עיינו במדריכי היצרן של הערכות לפרטי בידוד ה-total RNA באמצעות המוצרים הרלוונטיים.</li>
	<li>מדדו את הטוהר והריכוז של ה-total RNA שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 3300 או טכנולוגיות ספקטרופוטומטריה/פלואורומטריה אחרות לנפחים קטנים.</li>
</ol>
6. תוצאות מייצגות:
<table border="1">
	<tbody >
		<tr>
			<td>אזור במוח/גרעין</td>
			<td>קוטר דוגם הרקמה (mm)</td>
			<td>סך ה-RNA (ng/μL)</td>
			<td>יחס 260/280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קורטקס פרונטלי</td>
			<td>2.0</td>
			<td>27.03</td>
			<td>1.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus Accumbens</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.26</td>
			<td>2.77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>סטריאטום</td>
			<td>1.5</td>
			<td>27.94</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>קורטקס צינגולרי</td>
			<td>1.5</td>
			<td>29.05</td>
			<td>2.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>היפותלמוס - גרעין פראוונטריקולרי / גרעין סופראכיאסמטי (PVN/SCN)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>40.34</td>
			<td>2.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תלמוס</td>
			<td>2.0</td>
			<td>34.40</td>
			<td>2.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>היפותלמוס - גרעין דורסומדיאלי / גרעין ונטרומדיאלי (DMH/VMH)</td>
			<td>2.0</td>
			<td>44.83</td>
			<td>2.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אמיגדלה</td>
			<td>1.0</td>
			<td>10.06</td>
			<td>1.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>היפוקמפוס - Ca 2/3</td>
			<td>1.5</td>
			<td>7.31</td>
			<td>2.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>היפוקמפוס - Ca1/Dentate Gyrus</td>
			<td>1.5</td>
			<td>5.20</td>
			<td>2.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>אזור אפור פרי-אקוודוקטלי</td>
			<td>1.0</td>
			<td>48.21</td>
			<td>2.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>גרעין דורסל רפה</td>
			<td>1.0</td>
			<td>6.56</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תצורה רטיקולרית</td>
			<td>2.0</td>
			<td>35.35</td>
			<td>2.27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1. פירוט של אזורי מוח של עכברים שבוצע להם מיקרו-דיסקציה, עם קטרי מחללי רקמה אופטימליים, תנובת RNA כוללת מייצגת ודרגת טוהר. 13 אזורי המוח שעברו מיקרו-דיסקציה, הרשומים בסדר rostro-caudal, נבדלים בגודלם ובכוונם. דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-PVN/SCN כוללת את הגרעין הפרה-ונטריקולרי האנטרו-מדיאלי, חלקים מהגרעין הפרי-ונטריקולרי, את האזור הסוב-פרה-ונטריקולרי ונוירונים פרבו-צלולים אחרים. דגימת המיקרו-פאנץ' של התלמוס כוללת גרעיני תלמוס קדמיים הממוקמים באותו מישור קורונלי כמו אזור דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-PVN/SCN. דגימת המיקרו-פאנץ' של ה-DMH/VMH כוללת גרעינים מגנו-צלולים נלווים ונוירונים פרבו-צלולים אחרים הממוקמים בין הגרעין הדורסו-מדיאלי לגרעין הוונטרו-מדיאלי. דגימת האמיגדלה כוללת הן את התת-אזורים המרכזיים והן את הבזולטראליים. תנובת ה-RNA ויחסי 260/280 הם ערכים בודדים שהושגו מדגימות מיקרו-דיסקציה בהתאמה, כדי להדגים את הקריאות שהושגו מכל אזור במוח.

<ol><li>Pickrell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanisms+underlying+human+gene+expression+variation+with+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing.</a> Nature. 464, 768-772 (2010).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).</li>
<li>Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+big+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with big effects.</a> Transplantation. 90, 105-112 (2010).</li>
<li>Forrest, A. R., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole genome transcriptome analysis.</a> RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).</li>
<li>Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+sequencing+reveals+gene+expression+and+splicing+differences+in+brain+regions+affected+by+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).</li>
<li>Paulsen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+individual+hypothalamic+nuclei+from+single+animals+using+laser+capture+microdissection+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays.</a> J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).</li>
<li>Winrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+integration+of+glutamatergic+signals+by+little+SAAS+in+novel+suprachiasmatic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits.</a> PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22MagMAX-96+Total+RNA+Isolation+Kit+Instruction+Manual%22">MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual</a>. , Forthcoming.</li>
</ol>

לא הוצהרו ניגודי עניינים.

בפרוטוקול זה קיימים מספר שלבים קריטיים הדורשים תשומת לב ומחשבה מעמיקה. יש לקבוע את קוטר מחלץ הרקמה (tissue corer) המתאים להסרה של כל אזור עניין רלוונטי. בעוד שקוטרי מחלץ הרקמה המוצגים ב-Table 1 מתאימים לאיסוף של אזורי המוח המפורטים, על כל חוקר לקבוע את גודל מחלץ הרקמה המתאים לאיסוף אופטימלי של רקמת העניין הרלוונטית עבורו. שנית, עובי החיתוך הקורונלי המדווח בשיטה זו (750 μm) נקבע באופן ניסיוני כעובי האופטימלי לזיהוי אזורי המוח המבוקשים (Table 1) בעכברים בוגרים בעלי רקעים גנטיים שונים. נקודות ציון נוירו-אנט...

<table><tbody><tr><td>מקלחת מים Isotemp 102</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-3Q</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>רוטטור למעבדה (מנער אורביטלי)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314 &amp;#8211;- 1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>מערבל כדורים (Pellet mixer)</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>pestle בנפח 0.5 מ"ל, נקי מ-RNase</td><td>VWR international</td><td>KT749521-0590</td><td>נטול נוקלאזים</td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>להבי תער בעלי שני קצוות חיתוך</td><td>Stoelting Co.</td><td>51427</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;סורק רקמות קפוא עם מיקרומטר ידני</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>מכחול עגול דק (2/0) לאמנות&amp;rsquo;מברשת s</td><td>מכחול Princeton Art</td><td>4350R</td><td></td></tr><tr><td>דוגם רקמה Harris Uni-Core (0.75 מ"מ)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>דוקר רקמות Harris Uni-Core (1.0 מ"מ)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15099</td><td></td></tr><tr><td>דוגם רקמות Harris Uni-Core (1.5 מ"מ)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>דוקר רקמות Harris Uni-Core (2.0 מ"מ)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>גיליוטינה</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>RG-100</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCones</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Earle&amp;rsquo;תמיסת מלחים מאוזנת (EBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות של 25 מ"ל</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>נטול נוקלאזים</td></tr><tr><td>טיפי פפיט epT.I.P.S. LoRetention עם מסנן כפול, 20 &amp;mdash; 300 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>0030 077.636</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות עם מכסה הברגה TrakMates</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3741</td><td></td></tr><tr><td>קורא ברקודים דו-ממדי אלחוטי VisionMate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3122MTX</td><td></td></tr><tr><td>קורא ברקודים דו-ממדי למסגרת אחת VisionMate SR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3115</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;קצות פיפטה בעלי התאמה אוניברסלית L</td><td>Corning</td><td>4864</td><td>נטול נוקלאזים</td></tr><tr><td>צלוחי תרבית תאים Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>נקי מנוקלאזים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה Cellstar מפוליסטירן עם 96 בארות וקרקע בצורת U, מבית Greiner Bio-One</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>5665-0180</td><td>נקי מנוקלאז</td></tr><tr><td>#4 נייר סינון</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 150</td><td></td></tr><tr><td>מילוי פפיטות בטיחות מסוג נורית סיליקון</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-102A</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד rna סך סידור downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

כפלטפורמות טכנולוגיות, גישות כגון ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing), מערכי מיקרו (microarray) ו-qRT-PCR מבטיחות פוטנציאל רב להרחבת הבנתנו לגבי היקף הבקרה המולקולרית. גישות חדשות יותר, כגון ריצוף RNA ברזולוציה גבוהה (RNA-Seq)1, מספקות מידע חדש ונרחב על ביטוי ספציפי לרקמה או למצב, כגון רמות תמלילים יחסיות, שחבור חלופי ומיקרו-RNA2-4. הסיכויים לשימוש בשיטת ה-RNA-Seq לאפיון השוואתי של התמלול השלם (whole transcriptome profiling)5 בתוך רקמות נפרדות או בין קבוצות של פרטים המובחנים פנוטיפית, פותחים נתיבים חדשים להבהרה של מנגנונים מולקולריים המעורבים הן במצבים פיזיולוגיים תקינים והן בבלתי תקינים. לאחרונה, בוצע אפיון של התמלול השלם ברקמת מוח אנושית, אשר זיהה הבדלים בביטוי גנים הקשורים להתקדמות מחלה6. עם זאת, השימוש בריצוף מהדור הבא טרם שולב באופן נרחב יותר במחקרי יונקים.
מחקרים של ביטוי גנים במודלים של עכברים דיווחו על פרופילים מובחנים בגרעיני מוח שונים תוך שימוש במיקרוסקופיה של לכידה בלייזר (LCM) לחיתוך דגימות7,8. בעוד ש-LCM מאפשר איסוף דגימות ברמת דיוק של תא בודד ואזורי מוח מובחנים, תפוקת ה-RNA הכוללת הנמוכה יחסית בגישת ה-LCM עלולה להוות מכשול ל-RNA-Seq ולגישויות פרופיל אחרות ברקמות מוח של עכברים, ועשויה להצריך שלבי הגברה של הדגימות שאינם אופטימליים. כאן מוצג פרוטוקול למיקרודיסקציה והפקה של RNA כולל מאזורי מוח מובחנים של עכבר. דוקרנים לרקמה בעלי קוטר קבוע משמשים לבידוד 13 רקמות מחתכים קורונליים סדרתיים בעובי 750-μm של מוח עכבר בודד. דגימות מיקרו-פאנץ' של רקמה מוקפאות באופן מיידי ונשמרות בארכיון. RNA כולל מופק מהדגימות באמצעות טכנולוגיה לבידוד RNA כולל המבוססת על חרוזי מגנט. דגימות ה-RNA המתקבלות הן בעלות תפוקה ואיכות מספיקות לשימוש בבדיקות פרופיל ביטוי המשך. אסטרטגיית מיקרודיסקציה זו מספקת חלופה ישימה לאסטרטגיות איסוף דגימות קיימות להשגת RNA כולל מאזורי מוח מובחנים, ובכך פותחת אפשרויות לגילויים חדשים של ביטוי גנים.

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

כפלטפורמות טכנולוגיות, גישות כגון ריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing), מערכי מיקרו-סיבוב (microarray) ו-qRT-PCR מבטיחות פוטנציאל רב להרחבת הבנתנו לגבי...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף RNA כולל מגרעיני מוח נפרדים באופן הניתן לשחזור, עקבי, חסכוני ובסביבה נקייה מ-RNA. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת סביבת עבודה נקייה מ-RN והוצאת המוח השלם מעכבר שעבר דקפיטציה. לאחר מכן, נעשה שימוש בקוצץ רקמות המופעל באמצעות מיקרומטר כדי לחתוך חתכי רקמה סדרתיים בגודל אחיד.לאחר מכן, אזורי מוח רלוונטיים מבודדים במיקרו-דיסקציה באמצעות גליל רקמה בעל קוטר קבוע, תוך שמירה על הרקמה בסביבת מדיום נטולת RNA. לבסוף, RNA כולל מבודד מהגרעיני המוח שהוצאו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תנובת ואיכות מספקת של RNA כולל עבור הכנת ספריית cDNA המשך ובדיקת פרופיל של הטרנסקריפטום באמצעות בדיקות ספקטרופוטומטריות או פלואורומטריות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כריתה גסה של אזורי מוח באופן אנטומי או כריתה בסיוע מיקרוסקופיית לכידה בלייזר, הוא שניתן לאסוף מספר אזורי מוח נפרדים בעלי עניין ממוח של עכבר בודד באופן הניתן לשחזור ובעלות סבירה. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האם פרופילים מובחנים של ביטוי תסריפטים בתוך אזורי מוח שאינם קשורים למעגלים עצביים עשויים להיות במתאם עם תכונות התנהגותיות מסוימות, תגובות סביבתיות ו/או מצב מחלה. כדי להכין את התמיסות למיקרודיסקציה, הוסיפו ל-100 milliliters של Earl's balanced salt solution או EBSS כמות של 0.44 grams של sodium bicarbonate ו-0.884 grams של glucose.טפל את ה-EBSS עם 0.1 milliliters של DEPC בבקבוק או בכלי זכוכית הניתנים לסטריליזציה באוטוקלאב עם מכסה הברגה למשך 12 שעות לפחות, בטמפרטורה של 37 °C. הנח פיפטות זכוכית באורך five and three quarter inches לתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח של 1 liter, והנח מברשות צבע כאשר הסיבים פונים כלפי מעלה לתוך משורבב זכוכית בנפח של 100 milliliters.הוסיפו תמיסת מים שעובדו ב-DEPC בכמות מספקת כדי לכסות את הפיפטות והמברשות. כסו את הביקר ואת המשורה בנייר אלומיניום והדגירו לפחות 12 שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה של 12 שעות עם DEPC, חממו את כל החומרים שעובדו ב-DEPC לטמפרטורה הגבוהה מ-100 °C למשך לפחות 15 דקות. צננו את ה-EBSS לטמפרטורת החדר לפני האחסון ב-4 °C.שפכו את ה-DD H2O מהכלי (beaker) ומהמשפך המדורג והמשיכו לדגור אותם בטמפרטורה הגבוהה מ-100 °C עד שהחומרים יתייבשו. הוציאו אותם מהמדגר, קררו אותם לטמפרטורת החדר ואחסנו לשימוש מאוחר יותר. ביום הניסוי, טפלו בכל משטחי העבודה כדי להסיר זיהומי RNA והניחו את ה-EBSS במקלח מים המכוון ל-40 °C לצורך בופור ואספקת חמצן.הגשרו את ה-EBSS ב-5% CO2 ו-95% חמצן על ידי הנחת צינור גז בתוך פיפטה של פסטור נקייה מ-RNA. לאחר הכנסת הפיפטה לתוך ה-EBSS, כסו את פתח המכל של ה-EBSS. הכינו סורח רקמות (tissue slicer) לחיתוך סדרתי של רקמת המוח.טפלו במשטחים העליון והתחתון של חותך הרקמות. כדי להסיר זיהומי RNA, הצמידו פיסה מלבנית של נייר סינון Watman מספר 4 למשטח הפלקסיגלאס של קוצץ הרקמות. הצמידו להב תער דו-צדדי לזרוע הקוצץ.כוון את המיקרומטר לאפס וכוון את הגובה המינימלי של זרוע הקוצץ (chopper) כך שלהב התער יחתוך את נייר המסנן, אך לא את לוח הפלקסיגלאס. אסוף את כל החומרים הנוספים הדרושים למיקרו-דיסקציה, כולל צלחות תרבית תאים במידה של 60 על 15 מילימטר נטולות RNA, טיפים למקרו-פיפטה בנפח של 200 µL נטולי RNA, מספריים מעוקלים, קרח יבש ומבחנות לאיסוף רקמות. הנח את המבחנות על קרח יבש לאחר ביצוע דקפיטציה לעכבר באמצעות גילוטית למכרסמים והוצאה של המוח השלם, כאשר גם המוח האחורי וגם העצבים האופטיים נשארים שלמים.הנח את המוח בחלק העליון של צלחת תרבית תאים נטולת RNase בגודל 60 על 15 מילימטרים. לאחר מכן, העבר אותו למשטח העבודה לדגימת רקמות. השתמש בפיפטה נטולת RNase כדי להרטיב בעדינות את נייר המסנן המחובר לקוצץ הרקמה באמצעות EBSS.הרטיבו את רקמת המוח באמצעות EBSS. העבירו את המוח לקוצץ הרקמות (tissue chopper) ומקמו אותו כך שהשטח הוונטרלי (ventral surface) ינוח על נייר המסנן. קו האמצע יהיה מאונך ללהב הקוצץ, והקצה הרוסטרלי (rostral edge) של המוח יהיה צמוד ללהב.השתמש במברשת ציירים שעברה טיפול ב-A-D-E-P-C כדי להחזיק את המוח ללא תזוזה על ידי הפעלת לחץ עדין על פני השטח הדורסליים של המוח. הרם את מנוף מחזיק הלהב כארבעה עד חמישה סנטימטרים מעל פני השטח של הרקמה הדורסלית והחזק אותו במצב זה. הסר את המברשת מפני השטח של המוח וכוון ל-750 micrometers.שימוש במיקרומטר. יש להניח למנוף לרדת כדי לחתוך את הרקמה וליצור נתח קורונלי בעובי 750 micrometer, בעוד להב החיתוך נותר נייח. השתמשו בתנועת גלגול עם מברשת ציירים כדי להזיז בעדינות את נתח הרקמה הרחק מפני השטח של הלהב.העבירו מיד את נתח הרקמה אל ה-EBSS המחומצן שבצלחת הפטרי. פרוסה זו מוכנה כעת למיקרו-דיסקציה. חזרו על הליך החיתוך עד לקבלת חיתוכים סדרתיים של המוח לאורך כל המישור הרוסטרו-קודאלי (rostro-caudal) לצורך ביצוע המיקרו-דיסקציה.ראשית, בדקו את התאורה כדי להבטיח שהארת הדגימה לא תיחסם. כווננו את המיקום ואת הזרימה של תערובת ה-O2 CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצננת ומבופרת עבור הרקמה. במהלך ההליך, זהו את חיתוך המוח הקורונלי הכולל את אזור העניין, ובעזרת מכחול, יישרו אותו באופן שטוח על תחתית פטרי dish.בחרו את המחלץ (tissue core) בעובי הקוטר המתאים. החזיקו את נתח הרקמה במישור המסתיר (coronal section) במקומו באמצעות מברשת ציירים והורידו את קצה החיתוך של המחלץ אל פני השטח של נתח הרקמה. תוך כדי הפעלת לחץ, דחפו את קצה המחלץ דרך נתח הרקמה עד לדחיסה חזקה לתחתית פטרי הדייש.השתמשו בתנועה סיבובית גולגלת כדי להבטיח שהאזור המבוקש התנתק מהרקמה שמסביב. הרימו בזהירות את גליל הרקמה מהחתך הרקמתי ושחררו את המיקרו-פאנץ' כך שירחף ב-EBSS באמצעות מברשת צבעים. העבירו מיד את המיקרו-פאנץ' של הרקמה לשפופרת אחסון יציבה בטמפרטורה של 80- °C הנשמרת על קרח יבש.הרקמה צריכה להיצמד בקלות לדופן הפרונט. החזירו את הפרונט המכיל את דגימת המיקרודיסקציה לקרח היבש. חזרו על תהליך מיקרודיסקציה זה עבור כל אזור מוחי רלוונטי.עם השלמת המיקרו-דיסקציה, רשמו את התווית או את הברקודיים המתאימים לכל מבחנה המכילה דגימה. העבירו את דגימות הרקמה למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשלב מיצוי ה-RNA, לצורך מיצוי RNA מדגימות הרקמה. ראשית, הכינו סביבת עבודה נקייה מ-RNA.הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזיים מגנטיים ושל תמיסת ליזיס וקישור (lysis binding solution) כפי שמתואר במדריך של ערכת בידוד ה-RNA הכולל. הוציאו את דגימות הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והניחו את המבחנות ישירות על קרח יבש. הוסיפו 100 µL של תמיסת הליזיס והקישור למבחנה עם דגימה.חבר עומס (pestle) המתאים למבחנה של 0.5 מיליליטר, נקי מנוקלאז, למערבל המשקעים והומוגנז את הרקמה באמצעות טיפ של פפיטה נקי מנוקלאז בעל שימור נמוך (low retention). העבר מיד את הדגימה ההומוגנית לבאר בלוח תרבית רקמה של 96 בארות בעלות תחתית עגולה באמצעות טיפ מאותו סוג. הוסף לדגימה 60 microliters של 100% isopropanol.הוסיפו 20 µL מתערובת החרוזים לדגימה וערבבו על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים. פעלו לפי השלבים בפרוטוקול של ערכה לבידוד total RNA כדי להשלים את חילוץ ה-total RNA. לבסוף, מדדו את הטוהר והריכוז של ה-total RNA שהתקבל. נתוני total RNA מדגימות של מיקרו-פאנץ' (micro punches) מאזורי מוח שונים מוצגים בטבלה זו.דגימות RNA שהושרשו ב-30 µL של elution Buffer סיפקו כמות מספקת של RNA כולל לשימוש במוצרים מסחריים להכנת cDNA עבור יישומי ריצוף RNA. בנוסף, תובילי ה-RNA ויחסי 260/280 הם ערכים בודדים שהתקבלו מדגימות microdissection תואמות כדי להדגים קריאות שהתקבלו מכל אזור במוח, והם מאשרים טוהר דגימה גבוה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-8 עד 10 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את הסיכון לזיהום RNA של משטחי העבודה או של דגימות הרקמה על ידי שימוש בחומרים נקיים מ-RNA או כאלה שעברו טיפול ב-DEPC.

non-laser-capture-microscopy-approach-for-microdissection-discrete

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

RNA כולל באיכות גבוהה הוכן מגופי תאים של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר microdissection לאחר הכתמת מקטעי חוט השדרה עם תכלת B ב 70% אתנול. מספיק RNA (~ 40-60 ng) הוא התאושש מ 3,000-4,000 נוירונים מוטוריים כדי לאפשר ניתוח RNA במורד הזרם על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למדו פרוטוקול לבידוד RNA ממוח עכבר באמצעות מיקרודיסקציה ללא לייזר. השיטה משלבת חיתוך קורונלי עם כלי קידוח רקמות להשגת RNA איכותי לניתוח תבניות ביטוי גנטי.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי (וידאו) | JoVE Journal

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

גלה סרטונים נוספים