Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי
13 בנובמבר 2011
פרופיל ביטוי RNA של אזורי מוח עכברים נפרדים דורש אסטרטגיית איסוף רקמות מדויקת וניתנת לחזרה. פרוטוקול המשתמש הן בחתך מוח קורונלי והן במיקרו-דיסקציה בעזרת רקמות מתואר כאן. התשואה והאיכות של סך ה-RNA המתקבלים מהדגימות המתקבלות מאשרים את התועלת של השיטה המתוארת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף את סך ה-RNA מגרעיני מוח דיסקרטיים באופן חוזר, עקבי, חסכוני ונטול RNA. זה מושג על ידי הכנת סביבת עבודה נטולת RN והוצאת כל המוח מעכבר ערוף ראש. לאחר מכן, מסוק רקמות המופעל במיקרומטר משמש לחיתוך קטעי רקמה סדרתיים בגודל אחיד.
לאחר מכן אזורי העניין במוח מנותחים במיקרו באמצעות ליבת רקמה בקוטר מוגדר תוך שמירה על רקמה בסביבת מדיום נטולת RNA. לבסוף, ה-RNA הכולל מבודד מגרעיני המוח שנכרתו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תפוקת RNA כוללת מספקת ואיכות להכנת ספריית CDNA במורד הזרם ופרופיל טרנסקריפטום באמצעות מבחני ספקטרום פוטומטריים או פלואורומטריים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כריתת אזור מוח בסיוע מיקרוסקופיה אנטומית גסה או לכידת לייזר, הוא שניתן לאסוף מספר אזורי מוח נפרדים ממוח עכבר בודד באופן חוזר ועלותו מספקת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האם פרופילי ביטוי תעתיק מובהקים בתוך אזורי מוח הקשורים ללא מעגלים עצביים עשויים להיות בקורלציה עם תכונות התנהגות מסוימות, תגובות סביבתיות ו/או מצב מחלה. כדי להתכונן למיקרו-דיסקציה, הוסיפו 100 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של ארל או EBSS עם 0.44 גרם נתרן ביקרבונט ו-0.884 גרם גלוקוז.
טפל ב-EBSS עם 0.1 מיליליטר DEPC בבקבוק או בקבוק הניתן לחיטוי עם ראש בורג למשך 12 שעות לפחות. ב-37 מעלות צלזיוס. הניחו פיפטות זכוכית של חמישה ושלושת רבעי סנטימטרים בכוס זכוכית של ליטר אחד והניחו מברשות אמנים עם זיפים הפונים כלפי מעלה לתוך גליל מדורג זכוכית של 100 מיליליטר.
הוסף מספיק תמיסת מים שטופלה ב-DEPC כדי לכסות את הפיפטות והמברשות. מכסים את הכוס ואת הגליל המדורג בנייר אלומיניום ודוגרים לפחות 12 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה של 12 שעות עם DEPC, מחממים, כל החומרים שטופלו ב-DEPC לטמפרטורה העולה על 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. קריר. ה-EBSS בטמפרטורת החדר לפני האחסון בארבע מעלות צלזיוס.
יוצקים את ה-DD H2O מהכוס ומהגליל המדורג וממשיכים לדגור אותם בטמפרטורה של יותר מ-100 מעלות צלזיוס עד שהחומרים יבשים. מוציאים אותם מהחממה, מצננים בטמפרטורת החדר ושומרים לשימוש מאוחר יותר. ביום הניסוי, טפל בכל משטחי העבודה כדי להסיר את זיהום ה-RNA, למקם ולשמור על ה-EBSS באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לחצץ ולחמצן.
ה-EBSS חודר אליו עם 5% CO2 ו-95% חמצן על ידי הכנסת צינורות גז לתוך פיפטת מרעה נטולת RNA. והכנסת הפיפטה לתוך ה-EBSS מכסה את פתח מיכל ה-EBSS. הגדר פורס רקמות לחיתוך סדרתי של רקמת המוח.
טפל במשטחים העליונים והתחתונים של פורס הרקמות. כדי להסיר זיהום RNA, חבר חתיכה מלבנית של וואטמן מספר ארבע, נייר סינון למשטח הפרספקס של קוצץ הרקמות. חבר סכין גילוח פיפיות לזרוע המסוק.
הגדר את המיקרומטר לאפס והתאם את הגובה המינימלי של זרוע המסוק כדי לאפשר לסכין הגילוח לחתוך את נייר המסנן, אך לא את לוחית הפרספקס. אסוף את כל החומרים הנוספים הדרושים לדיסקציה המיקרו, כולל כלי תרבית תאים נטולי RNA בגודל 60 על 15 מילימטר, קצות מיקרו פיפטה ללא רקמות 200 מיקרוליטר RNA, מספריים מעוקלים, קרח יבש וצינורות לאיסוף רקמות. הניחו את הצינורות על קרח יבש לאחר עריפת ראשו של עכבר באמצעות גיליוטינה של מכרסמים והוצאת כל המוח כשהמוח האחורי ועצבי הראייה שלמים.
הנח את המוח בחלק העליון של צלחת תרבית תאים חופשית של RNA בגודל 60 על 15 מילימטר. לאחר מכן העבר אותו למשטח העבודה של דגימת הרקמות. השתמש בפיפטה נטולת RNA כדי להרטיב באופן שמרני את נייר הסינון המחובר לקוצץ הטישו עם EBSS.
הרטיבו את רקמת המוח עם EBSS. העבירו את המוח למסוק הרקמות ומקמו אותו כשמשטח הגחון מונח על נייר המסנן. קו האמצע בניצב ללהב המסוק והקצה הרוסטרלי של המוח הניגש ללהב.
השתמש במברשת אמן שטופלה ב-A-D-E-P-C כדי להחזיק את המוח נייח על ידי הפעלת לחץ עדין על פני השטח הגביים של המוח תוך החזקת המוח נייח. הרם את ידית מחזיק הלהב כארבעה עד חמישה סנטימטרים מעל פני רקמת הגב והחזק אותה במצב זה. הסר את המברשת משטח המוח וחייג 750 מיקרומטר.
באמצעות המיקרומטר. אפשר לידית ליפול, לקצוץ את הרקמה וליצור חתך עטרה של 750 מיקרומטר בזמן שלהב המסוק נשאר נייח. השתמש בתנועת גלגול עם מברשת האמן כדי להחליק בעדינות את חלק הרקמה הרחק משטח הלהב.
הנח מיד את קטע הרקמה לתוך ה-EBSS המחומצן בצלחת הפטרי. פרוסה זו מוכנה כעת לניתוח מיקרו. חזור על הליך החיתוך עד לקבלת קטעי מוח סדרתיים על פני כל מישור קודל רוסט כדי לבצע דיסקציה מיקרו
.ראשית, בדוק את התאורה כדי לוודא שתאורת הדגימה לא תיחסם. התאם את המיקום והזרימה של תערובת ה-O2 CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצנת עבור הרקמה. במהלך ההליך, זהה את החלק העטרתי במוח הכולל את אזור העניין ובעזרת מברשת אמן, כוון אותו שטוח בתחתית צלחת הפטרי.
בחר את ליבת הרקמה בקוטר המתאים. החזק את חלק רקמת העטרה במקומו עם מברשת האמן והורד את קצה החיתוך של ליבת הרקמה כלפי מטה על פני קטע הרקמה. תוך כדי הפעלת לחץ, לחץ על קצה ליבת הרקמה דרך קטע הרקמה ומטה בחוזקה על תחתית צלחת הפטרי.
השתמש בתנועה מעגלית מתגלגלת כדי להבטיח שאזור העניין נותק מהרקמה שמסביב. הרם בזהירות את ליבת הרקמה הרחק מחלק הרקמה ושחרר את המיקרו אגרוף המאפשר לו לצוף ב-EBSS באמצעות מברשת אמן. הפקידו מיד את מיקרו אגרוף הרקמות בצינור אחסון יציב של מינוס 80 מעלות צלזיוס הנשמר על קרח יבש.
הרקמה צריכה להיצמד בקלות לצד הצינור. החזר את דגימת המיקרוס המכילה את הצינור לקרח היבש. חזרו על המיקרו-דיסקציה הזו עבור כל אזור במוח שמעניין אותי.
לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה, רשום את התווית או הברקודים המתאימים עבור כל דגימה המכילה צינור. הכניסו את דגימות הרקמה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA כדי לחלץ RNA מדגימות הרקמה. ראשית, הכינו סביבת עבודה נטולת RNA.
הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזים מגנטית ותמיסת קשירת ליזה כמתואר במדריך ערכת בידוד ה-RNA הכוללת. הסר את דגימות הרקמה מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והנח את הצינורות ישירות על קרח יבש. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת קשירת הליזיס לצינור דגימה.
חבר עלי בגודל צינור 0.5 מיליליטר נטול נוקלאז למיקסר הגלולה והומוגניזציה של הרקמה באמצעות קצה פיפטה נטול נוקלאז בעל שמירה נמוכה. העבירו את הדגימה ההומוגנית לבאר על צלחת תרבית רקמות תחתונה עגולה של 96 באר תוך שימוש באותו סוג טיפ באופן מיידי. הוסף לדגימה 60 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול.
מוסיפים לדגימה 20 מיקרוליטר מתערובת החרוזים ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. בצע את פרוטוקול ערכת בידוד ה-RNA הכולל שלבים להשלמת מיצוי ה-RNA הכולל. לבסוף, מדוד את הטוהר והריכוז של סך ה-RNA שנוצר נתונים ממיקרו אגרופים של אזורי מוח שונים מוצגים בטבלה זו.
דגימות RNA הנרמזות עם 30 מיקרוליטר של אבולוציה Buffer סיפקו מספיק RNA כולל לשימוש עם מוצרי הכנת CD NA זמינים מסחרית ליישומי ריצוף RNA. בנוסף, תפוקת ה-RNA ושני יחסים של 60 עד 2 80 הם ערכים בודדים המתקבלים מדגימות מיקרו-דיסקציה מתאימות כדי להדגים קריאות המתקבלות מכל אזור במוח והם מאשרים טוהר דגימה גבוה לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שמונה עד 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את הסיכון לזיהום RNA של משטחי עבודה או דגימות רקמה על ידי שימוש רק בחומרים נטולי RNA או מטופלים ב-DSY.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול לפרופיל ביטוי RNA באזורי מוח עכבר שונים, תוך דגש על אסטרטגיית איסוף רקמות מדויקת וניתנת לחזרה. השיטה משלבת חיתוך מוח קורונלי עם מיקרו-ניתוח מסוייע באמצעות מוקצע רקמות כדי להשיג RNA כולל באיכות גבוהה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- פרופיל RNA
רקע
- פרופיל ביטוי RNA חיוני להבנת תפקוד המוח.
- גרעיני מוח נבדלים דורשים ניתוח זהיר לצורך ניתוח מדויק.
- שמירה על סביבה נקייה מ-RNase חיונית לשלמות ה-RNA.
- שיטות קודמות חסרו עקביות וחזרתיות.
מטרת המחקר
- לבסס פרוטוקול אמין לחילוץ RNA מאזורי מוח עכבר.
- לוודא תפוקה ואיכות גבוהות של RNA ליישומים נוספים.
- לאפשר פרופיל טרנסקריפטומים באמצעות שיטות משופרות של איסוף רקמות.
שיטות ששימשו
- הכנת סביבת עבודה נקייה מ-RNase.
- כריתת ראש והסרת המוח כולו מהעכבר.
- חיתוך אחיד של רקמת המוח באמצעות חותך רקמות המופעל על ידי מיקרומטר.
- מיקרו-ניתוח של אזורי מוח ממוקדים באמצעות מוקצע רקמות באמצעות RNA-free.
תוצאות עיקריות
- הושגה תפוקה גבוהה של RNA כולל מגרעיני המוח המנותחים.
- אושרה איכות ה-RNA כמתאימה להכנת ספריית cDNA.
- התוצאות תומכות בתועלת השיטה לפרופיל טרנסקריפטום.
- בדיקות הוכיחו איכות RNA מספקת ליישומים נוספים.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מספק גישה אמינה לחילוץ RNA.
- הוא משפר את העקביות והאיכות של דגימות RNA מאזורי מוח עכבר.
- שיטה זו מועילה למחקר עתידי בנוירו-מדעים הכולל ניתוח RNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microdissection approach enables reproducible, high-yield total RNA isolation from discrete mouse brain regions, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where low RNA yields from laser capture microscopy hinder transcriptome profiling. By providing consistent RNA quality suitable for next-generation sequencing, the method supports mechanistic de-risking of CNS targets and improves predictive confidence in early discovery workflows. It positions as a scalable, cost-efficient alternative for brain region-specific gene expression studies in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating RNA from specific brain nuclei to correlate transcript expression with neuronal circuit function and behavioral phenotypes.
- Operational Value: Provides repeatable, cost-efficient sample collection from multiple discrete regions per mouse, reducing animal use and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers total RNA with sufficient yield and purity for downstream RNA-Seq and qRT-PCR, enabling reliable assay development for gene expression screening in brain tissue models.
- Operational Value: Uses magnetic bead-enabled RNA isolation compatible with high-throughput workflows, supporting standardization across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant transcriptomic profiling in mouse models, aligning with translational biomarker discovery efforts in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Ensures RNA integrity through RNase-free protocols, improving reproducibility in longitudinal preclinical studies and cross-laboratory data comparability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, where precise brain region RNA profiling informs target selection and prioritization before preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling transcriptomic comparison across discrete brain regions linked to specific neural circuits.
- Screening: Produces standardized RNA inputs suitable for quantitative gene expression screening, enhancing reproducibility in target engagement assays.
- Analytics: Generates high-quality RNA for spectrophotometric and fluorometric quantification, enabling precise input normalization for sequencing and PCR-based applications.
- Translational Research: Connects discovery-phase expression profiling to preclinical continuity by providing disease-relevant transcriptomic data from defined brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue collection and RNA isolation platform applicable across multiple neuroscience projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise brain region-specific expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via RNase-free workflows and minimal hands-on time (8–10 minutes per sample).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multiple regional samples from a single animal, reducing costs associated with low-yield methods requiring amplification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering reliable transcriptome data for go/no-go decisions in CNS drug discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and RNase-free technique to maintain sample integrity during dissection and RNA extraction.
- Depends on access to a micrometer-operated tissue chopper, set-diameter tissue corers, and magnetic bead-based RNA isolation kits.
- Necessitates standardized RNase-free environment protocols across teams to ensure cross-study consistency in RNA quality.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of tissue core diameter and sectioning parameters.
- Practical limitation: Manual tissue punching may limit ultra-high-throughput applications compared to automated laser capture systems, though it offers superior RNA yield.
