Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי
13 בנובמבר 2011
פרופיל ביטוי RNA של אזורי מוח עכברים נפרדים דורש אסטרטגיית איסוף רקמות מדויקת וניתנת לחזרה. פרוטוקול המשתמש הן בחתך מוח קורונלי והן במיקרו-דיסקציה בעזרת רקמות מתואר כאן. התשואה והאיכות של סך ה-RNA המתקבלים מהדגימות המתקבלות מאשרים את התועלת של השיטה המתוארת.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף את סך ה-RNA מגרעיני מוח דיסקרטיים באופן חוזר, עקבי, חסכוני ונטול RNA. זה מושג על ידי הכנת סביבת עבודה נטולת RN והוצאת כל המוח מעכבר ערוף ראש. לאחר מכן, מסוק רקמות המופעל במיקרומטר משמש לחיתוך קטעי רקמה סדרתיים בגודל אחיד.
לאחר מכן אזורי העניין במוח מנותחים במיקרו באמצעות ליבת רקמה בקוטר מוגדר תוך שמירה על רקמה בסביבת מדיום נטולת RNA. לבסוף, ה-RNA הכולל מבודד מגרעיני המוח שנכרתו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תפוקת RNA כוללת מספקת ואיכות להכנת ספריית CDNA במורד הזרם ופרופיל טרנסקריפטום באמצעות מבחני ספקטרום פוטומטריים או פלואורומטריים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כריתת אזור מוח בסיוע מיקרוסקופיה אנטומית גסה או לכידת לייזר, הוא שניתן לאסוף מספר אזורי מוח נפרדים ממוח עכבר בודד באופן חוזר ועלותו מספקת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האם פרופילי ביטוי תעתיק מובהקים בתוך אזורי מוח הקשורים ללא מעגלים עצביים עשויים להיות בקורלציה עם תכונות התנהגות מסוימות, תגובות סביבתיות ו/או מצב מחלה. כדי להתכונן למיקרו-דיסקציה, הוסיפו 100 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של ארל או EBSS עם 0.44 גרם נתרן ביקרבונט ו-0.884 גרם גלוקוז.
טפל ב-EBSS עם 0.1 מיליליטר DEPC בבקבוק או בקבוק הניתן לחיטוי עם ראש בורג למשך 12 שעות לפחות. ב-37 מעלות צלזיוס. הניחו פיפטות זכוכית של חמישה ושלושת רבעי סנטימטרים בכוס זכוכית של ליטר אחד והניחו מברשות אמנים עם זיפים הפונים כלפי מעלה לתוך גליל מדורג זכוכית של 100 מיליליטר.
הוסף מספיק תמיסת מים שטופלה ב-DEPC כדי לכסות את הפיפטות והמברשות. מכסים את הכוס ואת הגליל המדורג בנייר אלומיניום ודוגרים לפחות 12 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה של 12 שעות עם DEPC, מחממים, כל החומרים שטופלו ב-DEPC לטמפרטורה העולה על 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. קריר. ה-EBSS בטמפרטורת החדר לפני האחסון בארבע מעלות צלזיוס.
יוצקים את ה-DD H2O מהכוס ומהגליל המדורג וממשיכים לדגור אותם בטמפרטורה של יותר מ-100 מעלות צלזיוס עד שהחומרים יבשים. מוציאים אותם מהחממה, מצננים בטמפרטורת החדר ושומרים לשימוש מאוחר יותר. ביום הניסוי, טפל בכל משטחי העבודה כדי להסיר את זיהום ה-RNA, למקם ולשמור על ה-EBSS באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לחצץ ולחמצן.
ה-EBSS חודר אליו עם 5% CO2 ו-95% חמצן על ידי הכנסת צינורות גז לתוך פיפטת מרעה נטולת RNA. והכנסת הפיפטה לתוך ה-EBSS מכסה את פתח מיכל ה-EBSS. הגדר פורס רקמות לחיתוך סדרתי של רקמת המוח.
טפל במשטחים העליונים והתחתונים של פורס הרקמות. כדי להסיר זיהום RNA, חבר חתיכה מלבנית של וואטמן מספר ארבע, נייר סינון למשטח הפרספקס של קוצץ הרקמות. חבר סכין גילוח פיפיות לזרוע המסוק.
הגדר את המיקרומטר לאפס והתאם את הגובה המינימלי של זרוע המסוק כדי לאפשר לסכין הגילוח לחתוך את נייר המסנן, אך לא את לוחית הפרספקס. אסוף את כל החומרים הנוספים הדרושים לדיסקציה המיקרו, כולל כלי תרבית תאים נטולי RNA בגודל 60 על 15 מילימטר, קצות מיקרו פיפטה ללא רקמות 200 מיקרוליטר RNA, מספריים מעוקלים, קרח יבש וצינורות לאיסוף רקמות. הניחו את הצינורות על קרח יבש לאחר עריפת ראשו של עכבר באמצעות גיליוטינה של מכרסמים והוצאת כל המוח כשהמוח האחורי ועצבי הראייה שלמים.
הנח את המוח בחלק העליון של צלחת תרבית תאים חופשית של RNA בגודל 60 על 15 מילימטר. לאחר מכן העבר אותו למשטח העבודה של דגימת הרקמות. השתמש בפיפטה נטולת RNA כדי להרטיב באופן שמרני את נייר הסינון המחובר לקוצץ הטישו עם EBSS.
הרטיבו את רקמת המוח עם EBSS. העבירו את המוח למסוק הרקמות ומקמו אותו כשמשטח הגחון מונח על נייר המסנן. קו האמצע בניצב ללהב המסוק והקצה הרוסטרלי של המוח הניגש ללהב.
השתמש במברשת אמן שטופלה ב-A-D-E-P-C כדי להחזיק את המוח נייח על ידי הפעלת לחץ עדין על פני השטח הגביים של המוח תוך החזקת המוח נייח. הרם את ידית מחזיק הלהב כארבעה עד חמישה סנטימטרים מעל פני רקמת הגב והחזק אותה במצב זה. הסר את המברשת משטח המוח וחייג 750 מיקרומטר.
באמצעות המיקרומטר. אפשר לידית ליפול, לקצוץ את הרקמה וליצור חתך עטרה של 750 מיקרומטר בזמן שלהב המסוק נשאר נייח. השתמש בתנועת גלגול עם מברשת האמן כדי להחליק בעדינות את חלק הרקמה הרחק משטח הלהב.
הנח מיד את קטע הרקמה לתוך ה-EBSS המחומצן בצלחת הפטרי. פרוסה זו מוכנה כעת לניתוח מיקרו. חזור על הליך החיתוך עד לקבלת קטעי מוח סדרתיים על פני כל מישור קודל רוסט כדי לבצע דיסקציה מיקרו
.ראשית, בדוק את התאורה כדי לוודא שתאורת הדגימה לא תיחסם. התאם את המיקום והזרימה של תערובת ה-O2 CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצנת עבור הרקמה. במהלך ההליך, זהה את החלק העטרתי במוח הכולל את אזור העניין ובעזרת מברשת אמן, כוון אותו שטוח בתחתית צלחת הפטרי.
בחר את ליבת הרקמה בקוטר המתאים. החזק את חלק רקמת העטרה במקומו עם מברשת האמן והורד את קצה החיתוך של ליבת הרקמה כלפי מטה על פני קטע הרקמה. תוך כדי הפעלת לחץ, לחץ על קצה ליבת הרקמה דרך קטע הרקמה ומטה בחוזקה על תחתית צלחת הפטרי.
השתמש בתנועה מעגלית מתגלגלת כדי להבטיח שאזור העניין נותק מהרקמה שמסביב. הרם בזהירות את ליבת הרקמה הרחק מחלק הרקמה ושחרר את המיקרו אגרוף המאפשר לו לצוף ב-EBSS באמצעות מברשת אמן. הפקידו מיד את מיקרו אגרוף הרקמות בצינור אחסון יציב של מינוס 80 מעלות צלזיוס הנשמר על קרח יבש.
הרקמה צריכה להיצמד בקלות לצד הצינור. החזר את דגימת המיקרוס המכילה את הצינור לקרח היבש. חזרו על המיקרו-דיסקציה הזו עבור כל אזור במוח שמעניין אותי.
לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה, רשום את התווית או הברקודים המתאימים עבור כל דגימה המכילה צינור. הכניסו את דגימות הרקמה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA כדי לחלץ RNA מדגימות הרקמה. ראשית, הכינו סביבת עבודה נטולת RNA.
הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזים מגנטית ותמיסת קשירת ליזה כמתואר במדריך ערכת בידוד ה-RNA הכוללת. הסר את דגימות הרקמה מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והנח את הצינורות ישירות על קרח יבש. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת קשירת הליזיס לצינור דגימה.
חבר עלי בגודל צינור 0.5 מיליליטר נטול נוקלאז למיקסר הגלולה והומוגניזציה של הרקמה באמצעות קצה פיפטה נטול נוקלאז בעל שמירה נמוכה. העבירו את הדגימה ההומוגנית לבאר על צלחת תרבית רקמות תחתונה עגולה של 96 באר תוך שימוש באותו סוג טיפ באופן מיידי. הוסף לדגימה 60 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול.
מוסיפים לדגימה 20 מיקרוליטר מתערובת החרוזים ומערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. בצע את פרוטוקול ערכת בידוד ה-RNA הכולל שלבים להשלמת מיצוי ה-RNA הכולל. לבסוף, מדוד את הטוהר והריכוז של סך ה-RNA שנוצר נתונים ממיקרו אגרופים של אזורי מוח שונים מוצגים בטבלה זו.
דגימות RNA הנרמזות עם 30 מיקרוליטר של אבולוציה Buffer סיפקו מספיק RNA כולל לשימוש עם מוצרי הכנת CD NA זמינים מסחרית ליישומי ריצוף RNA. בנוסף, תפוקת ה-RNA ושני יחסים של 60 עד 2 80 הם ערכים בודדים המתקבלים מדגימות מיקרו-דיסקציה מתאימות כדי להדגים קריאות המתקבלות מכל אזור במוח והם מאשרים טוהר דגימה גבוה לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שמונה עד 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למזער את הסיכון לזיהום RNA של משטחי עבודה או דגימות רקמה על ידי שימוש רק בחומרים נטולי RNA או מטופלים ב-DSY.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון ביטוי RNA באזורים מובחנים של מוח עכבר, תוך דגש על אסטרטגיית איסוף רקמה מדויקת וניתנת לשחזור. השיטה משלבת חיתוך קורונלי של המוח עם מיקרו-דיסקציה בעזרת דוגם רקמות (tissue corer) כדי להפיק RNA כולל באיכות גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- פרופיל RNA
רקע
- פרופיל ביטוי של RNA הוא חיוני להבנת תפקוד המוח.
- גרעיני מוח נפרדים דורשים דיסקציה קפדנית לצורך ניתוח מדויק.
- שמירה על סביבה נקייה מ-RNase חיונית לשמירה על שלמות ה-RNA.
- שיטות קודמות היו חסרות עקביות ויכולת שחזור.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן להפקת RNA מאזורי מוח של עכבר.
- הבטחת תנובה ואיכות גבוהות של RNA עבור יישומים המשכיים.
- סיוע באפיון של הטרנסקריפטום באמצעות שיפור שיטות איסוף הרקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת סביבת עבודה נקייה מ-RNase.
- ניתוק ראש והוצאת המוח השלם מהעכבר.
- חיתוך אחיד של רקמת המוח באמצעות קוצץ רקמות (tissue chopper) המופעל על ידי מיקרומטר.
- מיקרו-דיסקציה של אזורי מוח מטרים באמצעות ליבת רקמה בתווך נקי מ-RNA.
תוצאות עיקריות
- התקבל תפוקה גבוהה של RNA כולל מגרעיני המוח שהופרדו.
- איכות ה-RNA הוכרה כמתאימה להכנת ספריית cDNA.
- התוצאות תומכות בתועלת השיטה למיפוי של הטרנסקריפטום.
- הבדיקות הוכיחו איכות RNA מספקת ליישומים המשכיים.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מספק גישה מהימנה למיצוי RNA.
- הוא משפר את העקביות והאיכות של דגימות RNA מאזורי מוח של עכברים.
- שיטה זו מועילה למחקרים עתידיים במדעי המוח הכוללים ניתוח RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה זו למיקרו-דיסקציה מאפשרת בידוד שחזורי ובנשוא גבוה של RNA כולל מאזורים מובחנים במוח של עכברים, ובכך נותנת מענה לבקבוק מרכזי באישוש מטרות במדעי העצבים, שבו תנובות RNA נמוכות במיקרוסקופיית לכידה בלייזר מעכבות את אפיון התרנסקריפטום. על ידי אספקת איכות RNA עקבית המתאימה לרצף דור הבא, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומשפרת את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי מוקדמים. היא מהווה חלופה ניתנת להרחבה וחסכונית למחקרי ביטוי גנים ספציפיים לאזורי מוח בהערכת מטרות פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד RNA מגרעינים ספציפיים במוח, כדי להקיש על קשר בין ביטוי תעתוקים לתפקוד מעגלים עצביים ופנוטיפים התנהגותיים.
- ערך תפעולי: מספק איסוף דגימות הדיר וחסכוני מעל מספר אזורים נפרדים בכל עכבר, מה שמפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ומגביר את הסביבתיות (throughput) לצורך הפחתת סיכונים במטרות הטיפול.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק RNA כולל בתפוקה ובטוהר המספיקים ל-RNA-Seq ו-qRT-PCR המשכיים, מה שמאפשר פיתוח מהימן של בדיקות לסריקת ביטוי גנים במודלים של רקמת מוח.
- ערך תפעולי: משתמש בבידוד RNA באמצעות חרוזי מגנט התואם לזרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה (high-throughput), ובכך תומך בסטנדרטיזציה לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר ביצוע פרופיל טרנסקריפטומי רלוונטי למחלה במודלים של עכברים, בתיאום עם מאמצים לגילוי ביומרקרים תרגומיים בהפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: מבטיח את שלמות ה-RNA באמצעות פרוטוקולים נטולי RNase, ובכך משפר את השחזוריות במחקרים פרה-קליניים ארוכי טווח ואת יכולת השוואת הנתונים בין מעבדות שונות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר פרופיל RNA מדויק של אזורי מוח מסייע בבחירה ותיעדוף של מטרות לפני תיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אפשרות להשוואה טרנסקריפטומית בין אזורי מוח נפרדים הקשורים למעגלים עצביים ספציפיים.
- סריקה: מייצרת תשומות RNA סטנדרטיות המתאימות לסריקת ביטוי גנים כמותית, ובכך משפרת את השחזוריות במבחני מעורבות מטרה (target engagement assays).
- אנליטיקה: מייצרת RNA באיכות גבוהה לכימות ספקטרופוטומטרי ופלואורומטרי, המאפשר נורמליזציה מדויקת של התשומות עבור יישומים מבוססי ריצוף ו-PCR.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פרופיל ביטוי משלב הגילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי אספקת נתונים טרנסקריפטומיים רלוונטיים למחלה מאזורי מוח מוגדרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית לאיסוף רקמות ובידוד RNA, הישימה במגוון פרויקטים של מדעי העצבים ובסוגי מטרות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות נתוני ביטוי מדויקים הספציפיים לאזורי מוח.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות זרימות עבודה נטולות RNase וזמן עבודה ידני מינימלי (8–10 דקות לדגימה).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשרות לדגימה מאזורים מרובים מבעל חיים בודד, ובכך מפחית עלויות הקשורות לשיטות בעלות תפוקה נמוכה הדורשות הגברה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי אספקת נתוני טרנסקריפטום מהימנים לצורך קבלת החלטות של go/no-go בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנוירו-אנטומיה ובטכניקות נטולות RNase כדי לשמור על שלמות הדגימות במהלך הניתוח וההפקת ה-RNA.
- תלוי בגישה לקוצץ רקמות המופעל על ידי מיקרומטר, לדוקר רקמות בעלי קוטר קבוע, ולערכות בידוד RNA מבוססות חרוזי מגנט.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לסביבה נטולת RNase בין הצוותים השונים כדי להבטיח עקביות באיכות ה-RNA בין מחקרים שונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או למינים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קוטר דוקר הרקמה ושל פרמטרי החיתוך.
- מגבלה מעשית: ניקוב רקמה ידני עשוי להגביל יישומים בעלי תפוקה גבוהה במיוחד (ultra-high-throughput) בהשוואה למערכות לכידה בלייזר אוטומטיות, אם כי הוא מציע תבליל RNA גבוה יותר.
