זיהוי תגובות פיזיולוגיות מתאי עצב חושיים בדרוזופילה

חבר על צדו Drosophila melanogaster מהונדס גנטית מורדם לכיסוי.

הארך את רגליו הקדמיות ואבטח אותן כדי לחשוף את מקטעי הטרסל.

למקטעים אלה יש נוירונים טעמיים המבטאים קומפלקסים של אינדיקטורים לסידן שזוהרים בצורה הקשורה לסידן.

צייר מחסום הידרופובי סביב הזבוב כדי לשמור על התמיסה.

אפשר לזבוב להתאושש ולכסות תמיסת מלח חוצצת על מקטעי הטרסל החשופים כדי להרטיב אותם.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, התבונן במקטעי טרסל ודמיין את נוירוני הטעם בעומקים שונים כדי לקבל פלואורסצנטיות לפני גירוי.

הוסף תמיסת גירוי המכילה ליגנדים ליפופיליים על הקטע.

ליגנדים אלה נקשרים לקולטני נוירוני הגעש, יוזמים מסלולי איתות ומפעילים פתיחת תעלות סידן.

זה מאפשר ליוני סידן מהנוזל החוץ-תאי להיכנס לציטופלזמה ולהיקשר למתחמי אינדיקטור הסידן, וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטיות.

כאשר נצפה שוב, עלייה בפלואורסצנציה העצבית מאשרת את התגובה הפיזיולוגית העצבית לליגנד.

לאחר הרדמת הזבוב, חבר אותו לכיסוי של 0.17 מילימטר, בעזרת טיפה קטנה מאוד של לק שקוף. חבר את צד הזבוב למגלשה באמצעות הטיפה כולה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במכחול רטוב כדי להאריך את הרגל הקדמית של הזבוב. לאחר מכן, בעזרת שתי רצועות סרט דקות מאוד, אבטח את מקטעי הטרסל הראשון והחמישי לכיסוי.

אם רוצים לדמות נוירונים בחוטם, הנח רצועה דקה נוספת של סרט על דוכן הפרובוסקיס כדי לחשוף את התווית. כעת, צור קיר קצר סביב הזבוב באמצעות עט PAP. הניחו להרדמה להתפוגג למשך חצי שעה לפני ביצוע המדידות. עבור פרוטוקול זה, הכינו את הדילולים הדרושים של תמיסת ליגנד מלאי של 1 מיליגרם למיליליטר באמצעות PBST.

כדי להתחיל בהליך, שכבו 10 מיקרוליטר PBST על מקטעי הטרסל המאובטחים והחשופים. זה מרטיב את הרגל ומונע ממנה לצאת מהמיקוד. לאחר מכן, התמקד בקטעים באמצעות מערכת אופטית שיכולה להשיג אות פלואורסצנטי טוב עם רזולוציית זמן מהירה, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב עם מצלמת sCMOS. אסוף שלוש ערימות Z לפני גירוי של הנוירונים המעניינים במקטע הטרסל.

בדוגמה זו, התמונות מצולמות בחשיפות של 200 אלפיות השנייה ושילוב של 2 על 2 על פני קטע של 6 מיקרון על 1/2 מיקרון כל שתי שניות. הקפד לייעל את עוצמת הלייזר כדי למזער את ההלבנה, תוך מתן יחס אות לרעש גבוה. כאן, לייזר של 491 ננומטר, 100 מילי-וואט מופעל בשידור של 30%.

האות חייב להיות ניתן לזיהוי לפני הגירוי, אך לא להתקרב לרוויה. כעת, פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת גירוי על הקטע הטרסל המעניין. בזמן הפיפטינג, היזהר מאוד להימנע מלגעת ברגל, או בכל אחד מגופו של הזבוב, אחרת הטרסי יזוז ממקומו. לאחר מכן, רכשו מיד את התמונות הראשונות לאחר הגירוי, והמשיכו לאסוף מספיק תמונות כדי לתעד את השינוי המקסימלי בקרינה.