הערכת צומת עצבית-שרירית תפקודית באמצעות גירוי אופטי סימולטני והקלטת וידאו

התחל עם ביו-ריאקטור עם תא שרירים המכיל רקמת שריר משובצת קולגן הנתמכת מעל עמודי החדר.

ערוץ הנוירוספירה מכיל נוירוספירה במטריצת קולגן. הנוירונים המוטוריים של הנוירוספירה מבטאים ערוצים רגישים לאור.

הוסף מדיום התמיינות המכיל גורמי גדילה עצביים המגרים את הנוירונים להרחיב את הקרנותיהם.

החלף באופן קבוע את המדיום כדי להבטיח הארכה רציפה של נוירונים לכיוון רקמת השריר, ויוצר צמתים עצביים-שריריים.

התבונן בביו-ריאקטור תחת מיקרוסקופ המצויד במצלמה ומקור אור כחול.

החל פולסי אור כחול כדי לפתוח את התעלות הרגישות לאור בתאי העצב, מה שמאפשר ליונים מהמדיום לזרום ולעורר את הנוירונים לייצר אותות חשמליים.

אותות אלה עוברים דרך ההקרנות העצביות לצמתים העצביים-שריריים, ומעבירים את האות החשמלי לרקמת השריר.

הקלט סרטון בו זמנית. התכווצות הדרגתית של סיבי השריר מאשרת התפתחות של צומת עצבי-שרירי תפקודי.

הכינו תערובת של 4 ל -1 של 3 מיליגרם למיליליטר קולגן I ומטריצת קרום בסיס מסיסה. לאחר מכן, השעו מחדש את המיובלסטים בתערובת הקולגן הטרייה הזו.

לאחר מכן, הוסיפו 15 מיקרוליטר של תרחיף קולגן תאי זה לכל תא שרירים של הביוריאקטור, והקפידו לפזר את התרחיף על פני שני העמודים באמצעות קצה הפיפטה. הניחו לתערובת ג'ל התאים להתפלמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, מלאו היטב כל ביו-ריאקטור ב-450 מיקרוליטר של מצע גידול מיוטוני.

ביום ה-11 של התמיינות נוירונים מוטוריים, העבירו את התאים והמדיה לצינור של 50 מיליליטר, ואפשרו לנוירוספרות להתיישב לתחתית למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-15 מיליליטר של תרבית תרחיף נוירונים מוטוריים בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה.

ביום ה-14 של פרוטוקולי ההתמיינות, זרעו את הנוירונים המוטוריים לתוך הפלטפורמה. הכינו תערובת ג'ל של 4 ל -1 של 2 מיליגרם למיליליטר קולגן I ומטריצת קרום בסיס מסיסה. השתמש במסננת תאים של 400 ננומטר כדי לבחור נוירוספרות גדולות, והשהה אותן מחדש בתערובת הג'ל המוכנה.

בזהירות, שאפו מדיה מהמאגר ומהנוירוספירה היטב. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר מתערובת הג'ל לתעלת הנוירוספירה. טען פיפטה של 10 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטר ג'ל, ובחר נוירוספירה אחת. הפקידו את הנוירוספירה בתעלת הנוירוספרה, וודאו שהיא נמצאת בתא. לאחר מכן, הרם לאט את הפיפטה תוך שחרור הג'ל שנותר לאחר הפקדת הנוירוספרה.

הניחו לג'ל להתפלמר במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו למאגרים 450 מיקרוליטר של NbActiv4 בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה.

להדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלורסנט הפוך עם תוכנת מצלמת מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימה מדעית. הגדר את ה-binning ל-2 על 2, חשיפה ל-20 אלפיות השנייה, תריס מתגלגל מופעל, קצב קריאה ל-540 מגה-הרץ, טווח דינמי ל-12 סיביות והגבר 1 ומצב חיישן לחפיפה. השתמש במטרה פי 2 במיקרוסקופ כדי לדמות את המיקרו-רקמות, והצמד תא תא חי לשלב המיקרוסקופ.

בחר את אזור העניין הכולל את רקמות השלד העצבניות כדי למזער את גודל הקובץ ואת זמן העיבוד. לאחר מכן, הנח מסנן פליטה ארוך של 594 ננומטר בין הדגימה למטרת ההדמיה כדי לסנן פולסי אור כחול מהמצלמה. לאחר מכן, הנח צלחת מלבנית עם ארבע בארות המכילה ארבעה ביו-ריאקטורים לתוך תא התאים החיים. לאחר מכן, לחץ על Live View, ומרכז, ומקד את התמונה עם ההחזר על ההשקעה הרצוי.

הורד את קוד המאקרו-מותאם-במיוחד מתיקיית GitHub כדי לשלוט במיקום הבמה, לוח Arduino ורכישת וידאו. לאחר מכן, הגדר את סרט הפלט day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. הפעל את קוד המאקרו עם קואורדינטות ה-x וה-y הרצויות המוגדרות על הבמה, ורכוש קיטועי זמן מהירים עם 1,700 פריימים ב-50 פריימים לשנייה.

לאחר ההדמיה יש להחליף את המדיה ולהחזיר את הדגימות לחממה. אפשר לפחות 24 שעות בין הפעלות רכישת תמונה כדי למנוע עייפות רקמות.