Name: Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: למדו שיטת Allelotyping PCR לזיהוי מהיר של Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ו-Typhimurium. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של גנים ייחודיים לכל serovar ומשפרת את יכולות האבחון במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החקלאות מענקים 1999-35212-8680, 2005-01378, ו 2010-04288-01, USDA קרנות פורמולה ומדינת גרנט לרפואה וטרינרית של גאורגיה המחקר החקלאי. פרוטוקול המתוארים בפרסום זה פותחה לשימוש על ידי סטודנטים במסגרת קורסי מחקר מכוון: MIBO 4900L, ג&#39;ין 4960H, BCMB 4960L ו 4960H Biol באוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה בשימוש על ידי התלמידים על מספר פרויקטים של מחקר באפידמיולוגיה מולקולרית של מאורר מעבדה. אנו רוצים להודות סטודנטים רבים אשר ביצעו מחקר מאורר ולי מעבדות, ויו&quot;ר המחלקה שלנו, ג&#39;ון Glisson לתמיכה מאמצינו לשלב הוראה לתואר ראשון עם המחקר.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

רוב זמינים מסחרית בדיקות PCR לזיהוי מטרות גנים סלמונלה ייחודית הסוג (דוגמה invA). עם זאת, לא סלמונלה כולם שווים ביכולתם לגרום למחלה בבני אדם או שכיחות בקרב אוכלוסיות בעלי חיים. זיהוי מוקדם של הבדלים antigenic ב סלמונלה LPS-אנטיגן O ו flagellinH1 ו אנטיגנים H2 יש להוביל הבידול של סלמונלה אל מעל 2500 serovars מבוסס על ההבדלים הללו antigenic. ישנם 46 אנטיגנים O נבדל ברורה flagellin 86 (H) אנטיגנים מזוהה סלמונלה הסוג. סלמונלה יכול להחזיק אחד (H1) או שניים שונים (H1 &amp; H2) flagellins. שילוב שונה של O, H1, H2 ו אנטיגנים להסביר את serovars סלמונלה 2500 מוכרת היום. Serovar מוקצה מבוסס על הנוסחה antigenic נגזר זיהוי של O הפרט אנטיגנים H. הנוסחה antigenic כתוב כמו O: H1: H2, והיכן &quot;-&quot;, מתייחס בהעדר H1 או H2 flagellin ו &quot;NT&quot; (לא typeable) עבור סלמונלה שלילי אנטיגן-O. לדוגמה, Typhimurium serovar מוקצה ס enterica לבודד עם הנוסחה antigenic ב: אני: 1,2 בעוד enteritidis ניתן לבודד עם D1 הנוסחה: g, מ &#39;: -. זו וריאציה antigenic באוכלוסייה סלמונלה היא הביטוי החיצוני של הבדלים ברמת נוקלאוטיד כי ולכן ניתן לנצל בקלות על ידי PCR. זיהינו את ההבדלים הגנטיים הקשורים O ספציפיים אללים H לפתח allelotyping PCR לזיהוי ס enterica serovars: enteritidis, הדר, היידלברג, Typhimurium ו (3). המשימה דיווח נכון של סלמונלה serovar דורש בדיקה של כל אללים הקשורים O: H1: נוסחאות H2 antigenic עבור enteritidis (D1: g, מ &#39;: -), הדר (C2: Z10: e, n, x), היידלברג (B : r: 1,2), ו Typhimurium (B: i: 1,2). ללא ידע של האלל O או אנטיגן, הממצא של גרם H1, אלל מ &#39;לבד לא בהכרח לזהות סלמונלה לבודד כמו enteritidis כמו סלמונלה serovars אחרים: Agona, קליפורניה, מונטווידאו, גם להחזיק את זה אלל זהה. בעוד ה-PCR allelotyping תוכנן במקור כדי לזהות ביטוי שהוזכר serovars סלמונלה, בדיקה זו ניתן לזהות נוסף 19 serovars (לוח 3). PCR allelotyping שלנו תוכנן במקור כדי לזהות אללים O ו-H. בפועל, זה הפך להיות מעשי יותר וחסכונית לנו לזהות את O-אנטיגן על ידי מבחן התלכדות שקופיות, באמצעות O-antisera ספציפיים, ולא לבצע את allelotyping O PCR כאשר עובדים עם תרבויות סלמונלה מבודדים. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש allelotyping O PCR אם המעבדה שלך משתמשת PCR כמסך (2) או להקליד סלמונלה מבודד שהוגשו על FTA כרטיסים (6), וכוללים סלמונלה ספציפי PCR עם מסך הראשון של דגימות (4 ). הגבל את PCRs allelotyping רק דגימות אלה המזוהות סלמונלה על ידי PCR או בדיקות ביוכימיות / antigenic. הפרוטוקול המתואר במאמר זה כבר מותאם לשימוש עם טכנולוגיה איידהו Rapidcycler, thermocycler אוויר חם אשר מאפשר להקטין כרכים התגובה ורץ התנאים התגובה בפחות זמן מאשר thermocyclers לחסום רבים חימום. כדי להתאים את פרוטוקול לשימוש עם thermocycler בלוק חימום עשויים לדרוש אופטימיזציה התנאים התגובה אמפירית על ידי הפחתת / העלאת הטמפרטורה חישול, התאמת ריכוזי פריימר, או התאמת MgCl 2 בריכוז. לדוגמה, אנו צריכים להתאים את פרוטוקול המחקר MJ-200 PTC thermocycler כדלקמן. עבודה עם הכרכים אותה התגובה המתוארת בטבלה 1, מניות הפועלים concentrationof קבוצת פריימר הייתי מדולל ל -2.5 מיקרומטר, הטמפרטורה חישול ירדה מ 55 ° C עד 45 ° C, ופעמים הדגירה על denaturation, חישול הרחבה צעדים הוארך עד s 20 עבור i / g, מ allelotyping PCR. לאחר שולט חיוביות ושליליות המתאים חיוניים עד תחילת אופטימיזציה ראשונית לכל PCR, לרבות הפרוטוקולים שפורסמו. אנו ממליצים על רכישת serovars סלמונלה ידוע, במיוחד Anatum (E1: e, h: 1,6), enteritidis (D1: ז, מ &#39;: -), הדר (C2: Z10: e, n, x), היידלברג (B: r : 1,2), מונטווידאו (C1: g, m, s: 1,2,7) ו Typhimurium (B: i: 1,2); ו Escherichia coli K12 מעבדה זן (DH5α, LE393, JM109 וכו &#39; ) כפקדי חיובי ושלילי בהתאמה עבור בדיקות PCR allelotyping המתואר במאמר זה. כמה אלה serovars סלמונלה ישמש שולטת חיובי או שלילי, בהתאם אלל נבדק. אמצעי זהירות מסוימים והנחיות צריך להיות מלווה בעת ביצוע זה אחרת אבחון PCR. ראשית, ההפרדה הפיזיתהכנת תבנית, PCR הגדרת, ועל ג&#39;ל אלקטרופורזה היא קריטית במניעת PCR ניתן לשאת על זיהום דיווח מוטעה של תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, הכללת הבקרות המתאימות יש צורך בכל PCR שגרתיות כמו פקדים אלה לזהות בעיות כשהן מתעוררות לסייע בפרשנות של התוצאות (5). והכי חשוב, עקביות היא חיונית, במיוחד בכל הקשור לתנאים electrophoretic עבור andestimation (PCR מוצר) זיהוי amplicon גודל amplicon. כדי להמחיש את הנקודה הזו, אנחנו בכוונה מושעה אלקטרופורזה מוקדם יותר נועד באיור 1 א. סטנדרטים משקל מולקולרי (נתיבים 1 ו 13) ושליטה חיובית (מסלול 2) לא מופרדים מספיק כדי להעריך במדויק בגדלים או לצפות הפרדה של שברי DNA שבו יש הבדלים קטנים (~ 50 נ&quot;ב) בגדלים. הפרדה נאותה של קטעי DNA, בעיקר סטנדרטים משקל מולקולרי, חיונית כמו דיווח חיוביות תלויה אמידה מדויקת של גודל amplicon ו הבחנה &quot;חיובי אמיתי&quot; מתוך הלא ספציפית amplicons כי הם נצפו לעתים בניהול היומיומי של כל ה-PCR (5 ). לדוגמה, יש amplicon שאינם ספציפיים 1B איור, מסלול 7 (~ 700 נ&quot;ב בגודל). אילו אלקטרופורזה הופסק מוקדם מדי, כאשר מול לצבוע רק בשלב חצי הדרך הג&#39;ל agarose, לא תהיה הבחנה קטנה בין 500 לבין 700 נ&quot;ב נ&quot;ב שברי DNA. לכן, מדגם בנתיב 7 היה דווח בטעות חיובי הן עבור i ו-g, אללים מ. לבסוף, צריך להכיר את מגבלות הקשורות מבחן כלשהו. כמה allelotyping H1/H2 PCR אין לי כוח מפלה להבחין הבדלים גנטיים קלים אללים השייכים H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 מורכב אנטיגן, דואר, n, x / e , n, z15 מורכב אנטיגן ואת מורכבות G H1 אנטיגן, הכוללת את, גרם אלל מ. אחד או שניים שינויים חומצת אמינו להסביר את epitopes שונה נוכח אלה אנטיגנים flagellar. זה היה קשה עבורנו ולכן לעיצוב primers שעלול לנצל זוג אלה בודד לפעמים בסיס הבדלים ברצף הגן flagellin (3). לדוגמה, סלמונלה serovars דבלין (D1: g, p: -) וברטה (D1: F, G, t: -) גם PCR חיובי עם g שלנו, mallelotyping primers. Allelotyping primers H2 אינה יכולה להבחין Typhimurium (B: i: 1,2) מ לאגוס (B: i: 1,5), היידלברג (B: r: 1,2) מ ברדפורד (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), או רמו (B: r: 1,7), או הדר (C2: Z10: e, n, x) מ Glostrup (C2: Z10: e, n, z15). בעוד הסבירות להיתקל בכמה serovars אלה: לאגוס, ברדפורד, Winneba, רמו או Glustrup הוא מרוחק, היא האפשרות דורש גם מתן הצהרה על הגבלה של בדיקות או בדיקה נוספת מאשרות. לסיכום, זה serotyping PCR מבוססי במהירות מזהה ס enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג Typhimurium, ו-O, H1, H2 ו אללים הקשורים serovars 19 נוספים. Assay זהו מהירה, חסכונית מיקרוביולוגית חלופית לגישה המסורתית סלמונלה serotyping.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומר שם </th><th> סוג </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערה </th></tr><tr><td> לוריא Bertani </td><td></td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> Microfuge צינורות </td><td> 1.5 מ&quot;ל כושר </td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> 200 הוכחה </td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> ביולוגיה מולקולרית כיתה </td><td> סיגמא </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה: PCR בלבד) </td></tr><tr><td> 10 x-PCR חוצץ: </td><td> 20 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td> (חיץ מגיע עם ארגון ה-BSA, Ficoll ו Tartrazine) </td></tr><tr><td></td><td> 30 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 מ&quot;מ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> רוש </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> תקי פולימראז ה-DNA </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> נימי pipettes </td><td> 10 μl נפח </td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ראפיד Cycler </td><td></td><td> איידהו טכנולוגיה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EEO נמוכה; כיתה לביולוגיה מולקולרית </td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> 50 X או טה הצפת מאגר TBE 5X </td><td></td><td> דיג </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אופקי, הצוללת קאמרית ג&#39;ל אלקטרופורזה בג&#39;ל עם עובש </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> אספקת חשמל </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr><tr><td> מולקולרית Imager ג&#39;ל דוק מערכת </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (או כל מקור להשוואה) </td></tr></tbody></table> טבלה 4. חומרים

allelotyping pcr לזיהוי סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

בדיקות שוטפות PCRs מסחרי לזיהוי היעד סלמונלה גנים ייחודיים הסוג הזה. עם זאת, ישנם שני מינים, שישה מינים, ומעל 2,500 serovars סלמונלה שונים, לא כולם שווים משמעותם לבריאות הציבור. לדוגמה, מציאת ס enterica תתי IIIa אריזונה על חווה ביצה שולחן שכבה הוא חסר משמעות לעומת בידוד ש &#39; תת המין enterica אני serovar enteritidis, הגורם המוביל סלמונלה קשור לצריכה של ביצים השולחן. Serovars מזוהים על בסיס הבדלים antigenic ב lipopolysaccharide (LPS) (אנטיגן O) flagellin (H1 ו-H2 אנטיגנים). הבדלים אלו הם antigenic החיצונית של גיוון של גנים אללים גנים הקשורים פנוטיפ זה. פיתחנו allelotyping, זמנית PCR כי המפתחות על הבדלים גנטיים בין ארבע הגדולות ס enterica תתי serovars מצאתי עופות הקשורים במחלה האנושית משמעותית בארה&quot;ב. זוגות פריימר PCR היו ממוקדות גנים מפתח או רצפים ייחודיים serovar סלמונלה ספציפיים נועד לייצר amplicon עם גודל מסוים עבור הגן או האלל. סלמונלה serovar מוקצה לבודד מבוסס על שילוב של תוצאות ה-PCR מבחן ספציפי LPS ו flagellin אללים גנים. PCRs זמנית המתוארות במאמר זה הן ספציפיות לגילוי ש תת המין enterica אני serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. כאן אנו מדגימים כיצד להשתמש PCRs זמנית כדי לזהות serovar עבור סלמונלה לבודד.

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

בדיקות PCR מסחריות נוכחיות לזיהוי Salmonella מתמקדות בגנים הייחודיים לסוג זה. עם זאת, קיימים שני מינים, שישה תתי-מינים, ומעל...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות אללים ספציפיים של אנטיגן של salmonella. מטרה זו מושגת על ידי ביצוע PCR מכוון לזיהוי הבדלי רצף ספציפיים הקשורים לאללים אלו. תבנית דגימה מוספת לתערובת תגובת PCR המכילה פריימרים ספציפיים לאללים ולטיפוס האללים OH 1 ו-H 2.בדיקות ה-PCR מבוצעות בטרמוסייקלר (thermocycler). לאחר מכן, דגימות ה-PCR מופרדות לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל כדי לקבוע את גודל האמפליקון, במידה וקיים, עבור כל דגימה, או כדי לבודדו. גודל האמפליקון מותאם לאחר מכן לגודל הצפוי עבור כל אחת ממערכי הפריימרים שבהם נעשה שימוש ב-PCR; התוצאות המתקבלות מאפשרות זיהוי של אנטיגן ספציפי של salmonella.לאחר מכן נקבעת הגדרת ה-SEROVAR של האללים באמצעות PCR על בסיס תוצאות של בדיקות multiplex PCR עבור OH one ו-H two. היתרון המרכזי של הפרוטוקול המתואר בסרטון זה על פני SYP הוא שהוא מהיר, קל יותר לפירוש ופחות יקר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האפידמיולוגיה, כגון קביעת ההפצה וההישארות של וריאנטים של salmonella בתוך או בין חוות עופות או חוות הלובן.השלכותיה של טכניקה זו חולות על האבחנה המהירה של סלמונלוזיס המיוחסת ל-Salmonella, serovars, arius או urian. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית להבנת האופן שבו ניתן להשתמש בשיטת PCR זו כדי לסווג סלמונלה לרמת הסרוור (serovar). את ההליך ידגימו אדריאנה פדרוסו וין צ'אנג, חוקרים במעבדות לי מאואר באוניברסיטת ג'ורג'יה, להכנת תבנית DNA של תאים שלמים עבור תגובת ה-PCR העוקבת.ראשית, יש להוסיף לסביבת גידול LB broth בנפח של מיליליטר אחד זן של salmonella, שיבודד מקולוניה בודדת. יש להדגיר את התרבית בערבוב ב-200 עד 250 סיבובים לדקה ובטמפרטורת הדגרה של 37 °C.ביום למחרת, העבירו את התרבית בנפח של 1 mL למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 1.5 mL וסובבו את התרחיף במשך כשתי דקות ב-4,500 ×g כדי לשקיע את התאים; לאחר מכן שאבו את הנוזל העליון (supernatant), וסספנדו מחדש את משקע החיידקים ב-1 mL של 100% Ethanol. דגרו את התאים הסספנדים באתנול בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן. סספנדו את המשקע ב-1 mL של PBS. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון וסספנדו את המשקע ב-1 mL של מים מזוקקים סטריליים. לבסוף, דללו את תרחיף התאים.דולל ביחס של 1:20 עם מים מזוקקים ואחסן בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד עד לביצוע ה-PCR. הכנת תערובת התגובה של ה-PCR וחלוקתה חייבות להתבצע בחדר נפרד פיזית, ורצוי בתחנת עבודה ייעודית ל-PCR המצוידת במנורת UV. ראשית, חטא את משטח העבודה באמצעות קרינת UV וניגוב עם 10% bleach. לאחר מכן, השתמש בפיפטה המיועדת אך ורק לעבודות PCR ומצוידת בקצה פיפטה עם מחסום (barrier tip).הכינו תמיסת מקור (stock) של פריימרים על ידי דילול ראשוני של הפריימרים למשקע של 5*10⁻⁴ מולרי באמצעות מים מזוקקים. לאחר מכן, דללו את תמיסת המקור ביחס של 1:20 במים מזוקקים כדי להגיע לריכוז עבודה של 25 µM. הוציאו את ריאגנטי ה-PCR ואת התבנית של התאים השלמים מהמקפיא והמיסו אותם על קרח.השאירו את ה-tac DNA polymerase במקפיא עד למועד השימוש. ערבבו את ריאגנטים של ה-PCR בהתאם לטבלה 1 של הפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, פלטרו תשעה µL מתגובת ה-PCR.ערבבו בתוך הבארים של פלטת מיקרוטיטר פוליסטירן סטרילית בעלת 96 בארים עם תחתית עגולה. התחילו בראש העמודה הראשונה והתקדמו למטה לאורך העמודה, ולאחר מכן חזרו לראש העמודה הבאה; הוסיפו 1 µL של מים מזוקקים לבאר הראשונה כדי שתשמש כביקורת שלילית. לאחר מכן, העבירו 0.5 µL של תבניות ביקורת חיובית לתוך תערובת ה-PCR בבאר השנייה, ו-1 µL של e coli K 12 DH five alpha לבאר השלישית.נוסיף מיקרוליטר אחד של תבנית הדגימה השלישית לבארות שנותרו עבור ה-H one I ו-gyp PCR; Salmonella enteritidis, CVaR, TYM ו-Enteritidis ישמשו כביקרים חיוביים עבור אללים eye ו-GM בהתאמה. Salmonella CVaR, heidelberg ו-haar הם הביקרים החיוביים שישמשו ב-PCR השני לטיפוס אלל H one לצורך זיהוי האללים r ו-z 10 בהתאמה. לאחר מכן, נמקם קפילריות זכוכית בנפח 10 microliter במחזיקים הייעודיים עבור טכנולוגיית Idaho.לאחר שהמכשיר למחזורי תרמי מהירים (rapid cycler) מקובע למטה, טענו כל קפילרה מזכוכית בתערובת התגובה של ה-PCR על ידי הגעה עם הקפילרות לתחתית הבארים. הוטו את המחזיק כדי לאפשר לנוזל לרדת למטה במבנית ולהבטיח מרווח בין הקצוות לבין תערובת ה-PCR. לפני איטום צינורות הזכוכית באמצעות להבה של מבער בוטאן לאיטום שני קצוות הקפילרות, הניחו את צינורות הקפילרה ואת המחזיק בתוך ה-rapid cycler של Idaho technology והשתמשו בתוכניות התרמוסייקלינג המתוארות בטבלה 1 של הפרוטוקול הכתוב עבור סוגי ה-PCR השונים של all ELO.עם השלמת התוכנית במכשיר התרמוסייקלר, המשיכו לשלב האלקטרופורזה בג'ל של 15 על 10 סנטימטרים, ג'ל אגרוז בדרגת ביולוגיה מולקולרית בריכוז 1.5% המכיל את תמיסת ה-ethidium bromide, בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. לאחר שהג'ל התגבש, העבירו אותו לתא אלקטרופורזה אופקי מסוג submersible המכיל באפר אלקטרופורזה TAE בריכוז 1x, עם 200 µL של 0.25 mg/mL שומולאו מראש.טענו סממני משקל מולקולרי של DNA עם 40 µL של צבע טעינה ל-DNA בריכוז פי 6, ו-4.8 µL של סמן משקל מולקולרי של DNA מוכן מראש לבארות הראשונה, האמצעית והאחרונה. לאחר מכן, הוציאו מהמחזיק קפילרית זכוכית המכילה תגובת PCR של דגימה וחרצו את שני קצות הקפילרית באמצעות חותך זכוכית. לאחר מכן, הניחו את האגודל והאצבע המורה של שתי הידיים משני צדדי הקפילרית שסומנה על ידי חותך הזכוכית ושברו את הקפילרית; מקמו את מפזר הקפילריות בקצה הנגדי לתערובת תגובת ה-PCR וסובבו לאט את הבוכנה עם כיוון השעון עד שהנוזל יגיע לתחתית הפרונלה.הנח את הקפילרה לתוך הבאר שיוכנס אליה הדגימה, וסובב באיטיות את הבוכנה עם כיוון השעון כדי להעביר את הדגימה השקולה לתוך הבאר. הקפד לא לנקב את הבאר באמצעות הקפילרה ולא להכניס בועת אוויר לבאר על ידי המשך סיבוב הבוכנה לאחר שכל הנוזל יצא מהקפילרה. לאחר שכל הדגימות והסטנדרטים הוטענו, הגדר את המתח הקבוע של ספק הכוח ל-90 volts.עם השלמת האלקטרופורזה, העבירו את הג'ל למאיר UV (trans-illuminator) כדי להנמיך את מקטעי ה-DNA ואת תקני המשקל המולקולרי, וצלמו תמונות באמצעות מערכת gel dock XR. לבסוף, הניחו את מחזיקי הקפילריות בתמיסת אקונומיקה 10% למשך 15 עד 30 דקות. שטפו שלוש פעמים במים מזוקקים והחזירו לחדר ה-PCR לייבוש באוויר.ג'ל צביעת אתריום ברומיד ראשון זה מציג את תוצאות ה-multiplex PCR עבור אלל O הקשור ל-salmonella entera var, enteritis, hadda Heidelberg.Antifa. נתיבים 1 ו-13 מכילים סולם DNA של 100 base pair.נתיב שתיים מכיל את בקרות ה-multiplex PCR עבור אללים B, C one, C two, D one ו-E. הנתיבים הנותרים, שלושה עד 12, מכילים בידודים של salmonella. ייחוס אלל ניתן לבידוד salmonella על בסיס התאמת האמפליקון לגודל בקרת ה-PCR וכפי שנחזה עבור מערכי הפריימרים של האללים ששימשו משמאל לימין. גדלי אמפליקונים אלה הם כדלקמן: D 1 620 base pairs, C two 400 base pairs, E 1 280 base pairs, C 1 340 base pairs ו-B 560 base pairs.ג'ל צבוע בברום-אירידיום זה מציג את תוצאות ה-multiplex PCR של אלל H1 לזיהוי אללי ה-FLA ב-eye ו-gm. הג'ל נטען באותו סדר כפי שהוצג קודם לכן. שוב, אלל H1 משויך לכל בידוד בהתאם לנוכחות של אמפליקון שתואם בגודלו לבקרת ה-PCR וכפי שנחזה עבור ארבעת סטים של פריימרים לאלל H1 ששימשו, משמאל לימין.גדלי האמפליקונים הם 310 זוגות בסיסים עבור GM ו-510 זוגות בסיסים עבור I. ג'ל זה, הצבוע ב-ethidium bromide, מראה את תוצאות ה-multiplex PCR של אלל H1 לזיהוי אללי הגלין r ו-z10. שוב, הג'ל נטען באופן שהוצג קודם לכן, ולאלל H1 משויך כל בידוד בהתאם לנוכחות של אמפליקון התואם בגודלו לבקרת ה-PCR; כפי שנחזה עבור ארבעת סטים של פריימרים לאלל H1 שנעשה בהם שימוש, גדלי האמפליקונים הם 170 זוגות בסיסים עבור R ו-360 זוגות בסיסים עבור Z10 לאחר השלב הסופי.ניתן לבצע טכניקה זו בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו להפריד פיזית בין הכנת התבנית, הגדרת ה-PCR ואלקטרופורזה של ג'ל, כדי למזער את הפוטנציאל לזיהום ממקור PCR (carryover contamination).

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל...

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות...

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

סלמונלה spp /שיגלה spp. הם נפוצים פתוגנים לייחס שלשול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין דגימות דנ א מזון, סביבתית microbiomes זיהוי מתואמת, subtyping של חיידקי סלמונלה דרך רצף quasimetagenomic. שימוש משולב של העשרת תרבות, immunomagnetic ההפרדה (IMS) ועקירה מרובים הגברה (מד א) מאפשרת ריכוז אפקטיבי של DNA גנומי סלמונלה מזון ודוגמאות סביבתיים.

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

הטיפול בדו משתני משתנה מספר לוקוס-repeat (MLVA) המוצג כאן מאפשר מחקר ברזולוציה גבוהה, חזק ונייד של החיידק הפתוגני של הדג. החל מתרבויות טהורות, היישום משתמש ב-PCR מולטיפלקס ובאלקטרופורזה קפילר כדי לייצר פרופילי MLVA 10-הבסים ליישומי מטה.

משתנה רב-לוקוס-ניתוח חוזר של מספר מחזור של הדג -חיידק הפתוגניים באמצעות מולטיפלקס ואלקטרופורזה קפיסימית

זו גישה מולקולרית מבוסס לקביעת כושר חיידקי מאפשר זיהוי מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים באמצעות ברקודים ייחודי DNA גנומית כי הם כימות דרך ה-PCR הדיגיטלי. הפרוטוקול מתאר חישוב המדד תחרותי עבור זני סלמונלה ; עם זאת, הטכנולוגיה ניתנת להתאמה בקלות לפרוטוקולים הדורשים קוונפיקציה מוחלטת של אורגניזם גנטית מחושל.

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

מאמר זה מציג סדרה של שיטות רצופות לביטוי וטיהור של סלמונלה טיפוס סינתאז comp פרוטוקול זה מערכת מהירה כדי לטהר את קומפלקס החלבון ביום. שיטות מכוסות הן מוטאגנסיס מכוונת אתר, ביטוי חלבון ב Escherichia coli, כרומטוגרפיה זיקה, כרומטוגרפיה סינון ג'ל, והתגבשות.

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

למדו שיטת Allelotyping PCR לזיהוי מהיר של Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ו-Typhimurium. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של גנים ייחודיים לכל serovar ומשפרת את יכולות האבחון במעבדה.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

גלה סרטונים נוספים