Name: ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למדו כיצד לכמת את חידוש ותנועת מאגרי הכיסיות הסינפטיות בנוירונים גרגיריים של המוח הקטן באמצעות צביעת FM ודימות פלואורסצנטי חי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי שני מחזורי מיחזור בנוירונים זהים לבקרה פנימית מדויקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן Wellcome (Ref: 084,277).

<ol><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li>
<li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li>
<li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li>
<li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li>
<li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li>
<li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li>
<li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+exocytosis+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li>
<li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li>
<li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li>
<li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li>
<li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li>
<li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li>
<li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li>
<li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li>
<li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li>
<li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li>
<li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

צבעים FM נמצאים בשימוש נרחב לחקור פונקציה מסוף עצב בהכנות עצבי רבים. הם היו מועסקים בעיקר כדי לפקח על היקף אנדוציטוזה או SV, מחזור SV או קינטיקה של exocytosis 6. פרוטוקול תיאר מרחיב את המחקרים הללו כדי לבחון את ההפרש פריקה של בריכות SV ספציפיים. זה מספק מידע נוסף על חידוש של בריכות SV וגם היקף הגיוס שלהם. צבעים FM ניתן להשתמש בתווית מספר סיבובים של מיחזור SV בתוך מסופי העצב אותו. אנחנו צריכים לנצל את רכוש שנועד פרוטוקולים בהם תחלופה SV בטרמינל אחד יכול להיות במעקב פעמיים מסופי העצב אותו. זה מספק בקרה פנימית מדויק, שהוא חיוני בשל אופי הטרוגני של מיחזור SV במסופי עצב מקביל 11. באמצעות שימוש של השלב S1 כמו שליטה פנימי, המילוי של RRP, RP לבין סךבריכת SV בנוכחות תרופות ניתן להשוות באופן אמין וישיר. בנוסף לאספקת מידע על גודל מוחלט של מיחזור, בריכות RRP ו RP בתנאי גירוי שונים, פרוטוקול זה יכול גם לספק נתונים הבאים - 1) חלוקת SVS בין RRP ו RP כפונקציה של הבריכה מיחזור עבור S1 ו - S2, 2) את הגודל היחסי של בריכות S2 (RRP ו RP) כפונקציה של הבריכה הכולל מיחזור S1 ו - 3) את הגודל היחסי של כל הבריכה SV S2 מוגדרת כפונקציה של הבריכה באותו S1. זה פרוטוקול מסוים לא תספק מידע על קינטיקה פריקה עם זאת, מאז הרכישה הזמן הוא איטי מדי (עבור מדידות הקינטית פעמים הרכישה צריך להיות מהיר ככל האפשר ופריקה אוטומטית מסונכרן לכידת תמונה). 30 הרץ שלנו 2 גירויים s מעורר מידה זהה של RRP הפריקה כדי סוכרוז hypertonic 8. מאז גודל RRPמוגדר על ידי סוכרוז hypertonic הפריקה 15, אנו יכולים לקבוע כי פרוטוקול זה פורק כל SVS RRP, בהסכמה עם מחקרים נוירונים בהיפוקמפוס 16. הבריכה מילואים מתרוקן כמעט לחלוטין על ידי שלוש רכבות של 400 גירויים (כל אחד 40 הרץ זה 10) מאז הגירוי הזה פורק סכום זהה של צבע על פרדיגמה (2 גירויים עם 50 מ&quot;מ KCl) כי מכלה 95% מכלל צבען שכותרתו SVS 8,17. כימות מדויק של גודל הן RRP ובמילואים בריכה תלוי גם בהשגת מידע בטווח דינאמי ליניארי של המצלמה CCD. פרוטוקול זה פשוט יכול גם להיות שונה יותר. העוצמה של גירויים טוען גם יכול להיות מגוונות כדי לקבוע כיצד הפעילות העצבית מצבי אנדוציטוזה שונה להשפיע על חידוש SV הבריכה. יתר על כן, יותר מאשר שני מחזורים של טעינה ופריקה יכול גם להתבצע אם נדרש. פרוטוקול זה יכול לשמש גם בתאים transfected עם ביטוי יתר אוshRNA וקטורים. בשל היעילות הנמוכה של תרבויות transfection עצבי ראשוני, חלבונים הביע חייב להיות מתוייגים עם חלבוני ניאון. זה חיוני כי אלה תגי פלורסנט לא להפריע לאות לצבוע FM (שימוש ציאן או חלבונים אדום, למשל). במקרה זה, מסופי עצב מתאי transfected ולא transfected באותו שדה הראייה יכול להיות גם בהשוואה בקרה נוספת 8. בניסויים כגון השוואה של מידת הטעינה בין המון S1 ו S2 הוא בעל ערך קטן, שכן ההפרעות שוהה במהלך עומסי שניהם. מחיצות של צבע בין בריכות SV עדיין יכול להיות דמיינו אולם 8. כתבים גנטית בשם pHluorins יכול גם להיות מועסק כדי לפקח exocytosis אנדוציטוזה SV ובתרבות עצבי ראשוני. בדיקות אלו להשתמש בחלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק לסביבה pH של תחומים luminal של חלבונים SV מתויג כגון נצלנית, synaptophysin ו VGLUT1 18 </sup&gt;. כאשר משתמשים בשילוב עם מעכבי שלפוחי ATPase, pHluorins יכול לדווח הן קינטיקה והיקף גיוס בריכה SV 19. הגישה FM-צבע מבוסס המתואר כאן יש כמה יתרונות על פני הטכניקה pHluorin, ראשית, צבעים FM לספק מידע על מצב שבו SV אנדוציטוזה ומחדש RRP ובריכות מילואים 8. ספציפי שנית בריכות SV יכול להיות מתויג עם צבעים FM כי יש תכונות ספקטרליות שונות 20 ולבסוף אין דרישה transfection. צבעים FM לא יכול לספק מידע על התנועה SV בין מנוחה ומיחזור בריכות SV זאת (בניגוד pHluorins 19), שכן מעצם הגדרתו SVS להיות עמוסה לצבוע במהלך אנדוציטוזה יהיו גלויים. כך גם צובעת FM ו pHluorins יש נקודות חוזק וחולשה הם החזקים ביותר כאשר מנוצל ניסויים עצמאיים לכתובת אותה השאלה. תמונות באיכות גבוהה הן חיוניות לצורך ניתוח reproducib תקףle התוצאות. בעוד להיסחף אופקי ניתן לתקן בקלות, ניסויים שבהם יש סחיפה של ציר Z-לא ניתן לשחזר. מסיבה זו, חשוב למקד מחדש את התמונות לפני תחילת פורקת S1 ו - S2. במקרים כאשר ריקבון פלורסנט משמעותי התרחש, תיקונים עששת עלול להיות מיושם (בדרך כלל על ידי הפחתת עקבות שהוקלטו בעבר מ-FM טעון תאים בהעדר גירוי). עם זאת, הוא הציע תיקון ריקבון מבוצע רק עבור ייצוג גרפי ולא לשמש עבור כל ניתוח כמותי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM הכומר 3 מצלמה דיגיטלית </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio מיקרוסקופ Observer.A1 </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> צלחות תרבית תאים (6 בארות) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> צנטריפוגה (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 באינקובטור </td><td> Heraeus מכשירים </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> פלקון צינורות (15 / 50 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / ∞ 0.75 / 0.17 המטרה </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips (Ø25mm) </td><td> VWR הבינלאומי </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> זכוכית פסטר pipettes (230 ננומטר) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> הדמיה קאמרית </td><td> וורנר </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> זרימה למינרית ברדס </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain ופר רקמות </td><td> Mickle מעבדה הנדסה בע&quot;מ </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> מרקורי מנורה </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim מערכת חשמל ממריץ (100mV, 1ms רוחב pluse) </td><td> Digitimer בע&quot;מ </td><td> D330 </td></tr><tr><td> זלוף משאבה </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipettes סרולוגית (5/10/25 מ&quot;ל) </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> תריס בקר </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> מזרק (20 מ&quot;ל) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> מזרק מסננים (Minisart - 0.20 מיקרומטר) </td><td> סארטוריוס Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 שש שסתום ערוץ בקר </td><td> וורנר </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP Filter סט (סט 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ציוד מכשירים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70021 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Bioscience קיימברידג&#39; </td><td> BT70044 </td><td> 100 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Poly-D-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P7886 </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סיליקון גריז </td><td> סיגמא </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 0.3% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 0.25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 מ&quot;ל mg/100 </td></tr></tbody></table> -לעשות 100 מ&quot;ל טרי להכנת כל סטרילי, מסנן לפני השימוש לוח 3. הפתרון B להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריפסין (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המניות, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9201 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 4. פתרון T להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> פתרון ג </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align= &quot;מרכז&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 5. הפתרון W עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNase, 500 U לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> D5025 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פתרון ב &#39; </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סויה מעכב טריפסין (SBTI, 0.5 מ&quot;ג לכל המניות 0.5 מ&quot;ל, -20 ° C) </td><td> סיגמא </td><td> T9003 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> לוח 6. פתרון C עבור CGN הכנה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td> סיגמא </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> ארל פתרון מאוזן של מלח (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2773 </td><td> 3 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 7. EBSS פתרון להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> ציטוזין β-D-arabinofuranoside (ערה-C) * </td><td> סיגמא </td><td> C1768 </td><td> 10 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Foetal שור סרום </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> סיגמא </td><td> G3126 </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 25 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> בינוני Essential מינימלי (מ) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פניצילין (P) / סטרפטומיצין (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(S) </td></tr></tbody></table> * ערה-C יש להוסיף בינוני מ 1 ואילך DIV לוח 8. תרבות מדיה להכנת CGN <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> גרסה </th><th> חברה </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4.8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> המכונים הלאומיים לבריאות </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> מיקרוסופט </td></tr></tbody></table> לוח 9. תוכנת מחשב ספציפיים המשמשים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> קטלוג לא. </th><th> ריכוז </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C7902 </td><td> 1.3 mM </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5767 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P5405 </td><td> 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> P9791 </td><td> 0.4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6 שעות 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M0250 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH מעבדה ספקי </td><td> 10264 </td><td> 1.2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> TES </td><td> סיגמא </td><td> T1375 </td><td> 20 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> לוח 10. תמיסת מלח (pH 7.4)

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות synaptic בריכת ב cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים fm

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

לאחר שחרור הנוירוטרנסמיטר במסופי העצבים המרכזית, SVS מאוחזרות במהירות על ידי אנדוציטוזה. SVS קטגוריה הם ומילא אז עם העצבי להצטרף בריכה מיחזור, כהגדרתו SVS הזמינים 1,2 exocytosis. הבריכה מיחזור בדרך כלל ניתן לחלק לשתי בריכות נפרדות - הבריכה releasable בקלות (RRP) ובריכת מילואים (RP). כמו שמותיהם לרמוז, RRP מורכב SVS כי הם מיד זמין עבור היתוך בעוד RP SVS משתחררים רק במהלך 1,2 גירוי עז. חשוב יש assay אמין כי הדיווחים חידוש ההפרש של בריכות אלה SV כדי להבין 1) איך SVS תנועה לאחר מצבים שונים של אנדוציטוזה (כגון אנדוציטוזה clathrin תלויי ופעילות תלויי אנדוציטוזה בתפזורת) ו 2) את המנגנונים שליטה על גיוס של שני RRP ו RP בתגובה לגירויים שונים. צבעים FM הם מעסיקים באופן שגרתיעורך הדו&quot;ח כדי כמותית מחזור SV במסופי העצבים המרכזית 3-8. יש להם זנב פחמימני הידרופובי המאפשר חלוקת הפיך ב bilayer השומנים, וקבוצה ראש הידרופילי כי מעבר אבני דרך ממברנות. צבעים יש הקרינה קטנה בתמיסה מימית, אך התשואה הקוונטים שלהם גדל באופן דרמטי כאשר למחיצות בקרום 9. כך צובעת FM הם בדיקות ניאון אידיאלי עבור מעקב פעיל מיחזור SVS. הפרוטוקול הסטנדרטי לשימוש FM לצבוע הוא כדלקמן. תחילה הם מוחלים על נוירונים נלקחים במהלך אנדוציטוזה (איור 1). אחרי לא הפנימו צבע נשטף הרחק הממברנה פלזמה, ממוחזר להפיץ SVS בתוך הבריכה מיחזור. SVS אלה מתרוקנים מכן באמצעות גירויים פריקה (איור 1). מאז FM תיוג צבען של SVS הוא quantal 10, הירידה הקרינה המתקבלת היא פרופורציונלית לסכום של שלפוחית ​​שפורסמו. לפיכך, מיחזור היתוך של SVS שנוצר יח&quot;צבסיבוב evious של אנדוציטוזה ניתן לכמת באופן מהימן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שונתה כדי להשיג שני מרכיבים נוספים של מידע. ראשית, גירויים פריקה רציפים משמשים דיפרנציאלי לפרוק את RRP לבין RP, על מנת לאפשר כימות של חידוש המלאי של בריכות SV ספציפיים. שנית, כל מסוף העצב עובר את הפרוטוקול פעמיים. לכן, התגובה של המסוף העצב באותו S1 ניתן להשוות נגד הנוכחות של חומר המבחן בשלב S2 (איור 2), מתן הבקרה הפנימית. זה חשוב, שכן היקף מיחזור SV ברחבי הטרמינלים עצב שונים משתנה מאוד 11. כל התרבויות חסיד עצבי ראשוני יכול לשמש עבור פרוטוקול זה, אולם צפיפות ציפוי, פתרונות התנאים גירוי מותאמים נוירונים גרגיר cerebellar (CGNs) 12,13.

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

לאחר שחרור הנוירוטרנסמיטורים בטרמינלים של העצבים המרכזיים, וסיקולות סינפטיות (SVs) נאספות במהירות באמצעות אנדוציטוזה. ה-SVs שנאספו ממולאות מחדש ב...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את ההשבחה והגיוס של מאגרים ספציפיים של שלפוחיות סינפטיות בקצות עצביים מרכזיים באמצעות טכניקות של דימוי פלואורסצנציה חיה. דבר זה מושג על ידי ניטור שני סבבים של מחזור שלפוחיות סינפטיות, תוך שימוש בצבעי FM באותם קצות עצביים כדי לספק בקרות פנימיות תקפות. כשלב שני, המאגר הזמין לשחרור המיידי והמאגר הרזרבי מרוקנים באופן רצופי באמצעות פרוטוקולי פריקה ספציפיים, המאפשרים את כימות הגדלים היחסיים של המאגרים.בשלב הבא, שנו את תנאי הטעינה או הפריקה כדי לבחון את השפעת הווריאציה הנבחרת על שלב השקיעים של הוסיקולות הסינפטיות, על מילוי המאגרים או על הגיוס שלהם. התוצאות מראות כי טעינת FM d של מאגרים פיזיים סינפטיים שונים היא ניתנת לשחזור, בהתבסס על כימות וניתוח של פריקת הצבע המעוררת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון משפחת ה-fluent של הדיווחים הגנטיים, הוא שטכניקה זו עוקבת אחר מילוי המאגרים באופן ספציפי על ידי וסיקולות סינפטיות שעברו אנדוציטוזה.הוא מאפשר גם כימות מדויק. מכיוון שפרוטוקול זה מבוצע פעמיים באותם סיומים עצביים, הוא מספק בקרה פנימית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הסינפסה, ה-CLE, האנדוציטוזה והאקסוציטוזה, כגון כיצד מניפולציה במצבים ספציפיים של אנדוציטוזה יכולה להשפיע על חידוש מאגר המיחזור הכולל ומאגרי ה-CLE הסינפטיים שבתוכו, דוגמת המאגר הזמין לשימוש מיידי (readily reusable pool) והמאגר הרזרבי.ההגדרה הבסיסית של הניסוי צריכה לכלול מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי הפוך, מצלמת CCD מקוררת, מקור אור פלואורסצנטי, מערכת פרפוזיה מבוססת כבידה, תא הדמיה עם אלקטרודות פלטינה מקבילות וסטימולטור חשמלי, ומחשב. יש לבצע את הניסויים בחשכה או בתנאי תאורה אדומה, עם מינימום חשיפה של הדגימה לאור פלואורסצנטי כדי למנוע הבהרה (bleaching) של צבע ה-FM. התחל את הפרוצדורה בשימוש בגורי חולדה מסוג spra dolly בני שבעה ימים להכנת תרביות ראשוניות של נוירונים גרנולריים מהמוח הקטן (cerebellar granule neurons).לאחר הכנת התרביות, זרעו את הנוירונים במרכז של לבישת זכוכית (cover slip) בקוטר 25 מילימטר מצופה ב-poly D lysine בתוך טיפה, שקוטרה לא יעלה על שבעה מילימטרים. לאחר שעה, הוסיפו שני מיליליטר של מצע גידול לנוירונים. לאחר שבעה ימים, הניחו לבישת זכוכית אחת בתוך תמיסת מלח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר התייצבות במצע החדש. לאחר מכן, הוציאו את לבישת הזכוכית וייבשו את צדה התחתון ואת האזור שסביב התאים ההודבקים בעזרת פיסת נייר סופג קטנה.לאחר מכן, השתמש בגריז סיליקון כדי להדביק את זכוכית הכיסוי לתחתית תא הדימות. התאים צריכים להימצא בין שני החוטים המקבילים. השתמש בכמות מספקת של גריז סיליקון כדי לאטום את התא לחלוטין, מבלי שהגריז יחדור למרכז תא האמבט.בשלב הבא, מלא בעדינות את תא הרחצה בכ-260 µL של תמיסת מלח. לאחר מכן, מלא את צינורות הכניסה והיציאה באותה תמיסה. אטום את התא על ידי הדבקת כיסוי זכוכית (cover slip) נקי לחלק העליון באמצעות גריז סיליקון.לאחר מכן, הסר בועות אוויר שנלכדו בתא באמצעות צינורות הכניסה והיציאה. לאחר מכן, קבע את תא ההדמיה על פלטפורמת פלדת אל-חלד. בדוק אם ישנן דליפות על ידי הזרמה עדינה של תמיסת סלין דרך צינור הכניסה.השלב הבא הוא להניח את התא המורכב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. יש להזרים תמיסת מלח לכניסה של מערכת הפרפוזיה בכבידה ולחבר את התא לכניסה. לאחר מכן, חברו את חוטי החיבור של התא למעורר החשמלי.בצעו פרפוזיה לנוירונים עם 1.5 milliliters של צבע fm מדולל. לאחר מכן, גרו את הנוירונים באמצעות הסטימולטור המחובר כדי להשרות ספיגה של הצבע. לאחר הגרוי, בצעו פרפוזיה לנוירונים עם תמיסת סליין טרייה למשך שתי דקות כדי לשטוף את עודפי צבע ה-FM. לאחר מכן, השאירו את הנוירונים בתמיסת הסליין למשך שמונה דקות.בינתיים, אתרו את רשתות האקסונים שבהן ניתן להבחין בעמסי סופי עצב בודדים של FM D. השתמשו באורכי גל של פלואורסצאין. הימנעו מאזורים הכוללים מקבצי תאים.לאחר מכן, בצעו מיקוד מחדש של התמונה מיד לפני רכישת התמונה, שכן ייתכן שחלה סטיה קלה במהלך תקופת המנוחה. התחילו ברכישת תמונות בשיטת time-lapse בקצב של פריים אחד בכל ארבע שניות. לאחר רכישת חמש עד 10 תמונות בסיס (baseline), עוררו אקסוציטוזה של מאגר השחרור המהיר (readily releasable pool) על ידי מתן גרייה של 30 hertz למשך שתי שניות.לאחר רכישת 10 תמונות נוספות, עוררו את האקסוציטוזה של שלפוחיות סינפטיות ממאגר הרזרבה באמצעות שלוש גרגרות של 40 hertz למשך 10 שניות עם מרווח של 40 שניות בין הגרגרות, ורכשו חמש עד 10 תמונות נוספות. לאחר מכן, הפסיקו את רכישת התמונות. אפשרו לנוירונים להתאושש למשך 20 דקות לפחות, וחזרו על פרוטוקול שלב S1 זה שוב בשלב S2 עבור ניסוי הביקורת.לצורך ניתוח נתונים, המירו את התמונות לערימה (stack). השתמשו בפונקציה מובנית של ImageJ, ולאחר מכן כווננו את הבהירות והניגודיות של הערימה כדי למקסם את הטווח הדינמי במידה והתרחשה סטיה אופקית משמעותית. במהלך הניסוי, הפעילו את התוספים stack reg ו-turbo reg ב-ImageJ כדי ליישר את ערימת התמונות.לאחר מכן, הפעל את תוסף מנתח סדרות זמן הריצה (runtime series analyzer plugin). בשלב הבא, הגדר את אזורי העניין (regions of interest) עבור לפחות 90 סיומים עצביים. מעבר בין התמונות שלפני ואחרי פריקת הצבע (die unloading) מסייע בחשיפת סיומים עצביים פעילים.גודל אידיאלי של אזור עניין (region of interest) הוא גודל הגדול במעט מקצה עצב טיפוסי. לאחר מכן, השג את עוצמת הפלואורסצנציה הכוללת של כל אזור עניין לאורך זמן. לאחר מכן, ייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel.מוצגת כאן תרשים זרימה של ניסוי ביקורת שבו נוירונים גרנולריים של המוח הקטן נטענו ב-10 µM FM 1 43 באמצעות גרייה של 80 Hz למשך 10 seconds. כאן מוצגת תמונה המראה סיומי עצב נטענים ב-FM 1 43. כאן מוצגת אותה תמונה המראה 90 אזורי עניין (regions of interest) ממוספרים שנבחרו לניתוח לאחר זיהוי סיומי עצב פעילים, ואלו הן תמונות של סיומי העצב בנקודות זמן נבחרות.תמונות אלו מוצגות בצבעי פסאודו כדי להמחיש את השינויים בפלואורסצנציה ככל שמאגרי השלפוחית הסינפטית השונים התרוקנו. לבסוף, מוצגות כאן היחידות הפלואורסצנטיות הנורמליזציה של 90 סיומי עצבים אלו. בשלבי S one ו-S two, ניתן למדוד את הירידה בפלואורסצנציה של כל גירוי עוקב ולהשוותה בין שלבי S one ל-S two.בניסוי ביקורת זה, הן S one והן S two הביאו לאותם גודלים של המאגרים הזמינים לשחרור המהיר (readily releasable) והמאגרים הרזרביים (reserve pools). לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת את ההשלמה והגיוס של מאגרי שלפוחיות סינפטיות ספציפיים בטרמינלי עצבים מרכזיים באמצעות טכניקות של דימוי פלואורסצנציה חיה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאשר את חיות התאים ואת תגובתם על ידי ביצוע ניסויי הביקורת של S one לפני שינוי התנאים הניסויים של S two.

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית ​​סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

למדו כיצד לכמת את חידוש ותנועת מאגרי הכיסיות הסינפטיות בנוירונים גרגיריים של המוח הקטן באמצעות צביעת FM ודימות פלואורסצנטי חי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי שני מחזורי מיחזור בנוירונים זהים לבקרה פנימית מדויקת.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

גלה סרטונים נוספים