ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את החידוש והניוד של מאגרי השלפוחית הסינפטית הספציפיים במסופי העצבים המרכזיים באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות חיות. זה מושג על ידי ניטור שני סבבים של מיחזור שלפוחית סינפטית, תוך שימוש בצבעי FM באותם מסופי עצבים כדי לספק בקרות פנימיות תקפות. כשלב שני, המאגר הניתן לשחרור ומאגר המילואים מתרוקנים ברצף באמצעות פרוטוקולי פריקה ספציפיים, המאפשרים לכמת את גדלי המאגר היחסיים.

לאחר מכן, שנה את תנאי ההעמסה או הפריקה על מנת לחקור את השפעת הווריאציה שנבחרה על השלפוחית הסינפטית, חידוש הבריכה או הגיוס. התוצאות מראות כי טעינת FM d של בריכות פיזיות סינפטיות שונות ניתנת לשחזור על סמך כימות וניתוח של פריקת הצבע המעוררת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו משפחת המדווחים הגנטיים השוטפים, הוא שטכניקה זו עוקבת אחר חידוש המאגרים במיוחד על ידי שלפוחיות סינפטיות, שעברו אנדוציטוזיס.

זה גם מאפשר כימות מדויק. מכיוון שפרוטוקול זה מבוצע פעמיים באותם מסופי עצבים המספקים בקרה פנימית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסינפטי, CLE, אנדוציטוזיס ואקסוציטוזיס, כגון כיצד מניפולציה במצבי אנדוציטוזיס ספציפיים יכולה להשפיע על חידוש המאגר הכולל של מאגר המיחזור הכולל ומאגרי ה-CLE הסינפטיים שבתוכו, כגון המאגר הרב פעמי ומאגר השמורה.

מערך ניסוי בסיסי צריך להיות מורכב ממיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי הפוך, מצלמת CCD מקוררת, מקור אור פלואורסצנטי, מכשיר זלוף כבידה, תא הדמיה עם אלקטרודות פלטינה מקבילות וממריץ חשמלי ומחשב. בצע את הניסויים בחושך או בתנאי אור אדום עם תאורה פלואורסצנטית מינימלית של הדגימה כדי למנוע הלבנת צבע FM. התחל הליך זה על ידי שימוש בגורי חולדות ספרה דולי בני שבעה ימים כדי להכין את התרביות הראשוניות של נוירונים גרגירי מוח.

לאחר הכנת התרבויות, צלחו את הנוירונים במרכז כיסוי 25 מילימטר מצופה פולי D ליזין בטיפה, בקוטר שלא יעלה על שבעה מילימטרים לאחר שעה, הוסיפו שני מיליליטר של אמצעי תרבית לנוירונים לאחר שבעה ימים. הנח החלקת כיסוי בודדת בתמיסת המלח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר ייצוב במדיום החדש. לאחר מכן, הסר את החלקת הכיסוי, יבש את החלק התחתון שלה ואת האזור המקיף את התאים המחוברים בעזרת מגבת נייר קטנה או נייר סופג.

לאחר מכן, השתמש בשומן הסיליקון כדי להדביק את החלקת הכיסוי לתחתית תא ההדמיה. תאים צריכים להיות בין שני החוטים המקבילים. השתמש בשומן סיליקון מספיק כדי לאטום לחלוטין את החדר מבלי לפלוש למרכז תא האמבטיה.

לאחר מכן, מלאו בעדינות את תא האמבטיה בתמיסת מלח של כ -260 מיקרוליטר. לאחר מכן מלא את צינורות הקלט והפלט באותו פתרון. אטום את החדר על ידי הדבקת תלוש כיסוי נקי עם שומן סיליקון למעלה.

לאחר מכן, הסר את כל בועות האוויר הכלואות בתא עם צינורות הקלט והפלט. לאחר מכן שתק את תא ההדמיה בפלטפורמת נירוסטה. בדוק אם יש נזילות על ידי החדרה עדינה של תמיסת מלח דרך צינור הכניסה.

השלב הבא הוא הרכבת החדר המורכב על במת מיקרוסקופ הפוך. יש להניח את כניסת מערכת הזלוף של כוח הכבידה בתמיסת מלח ולחבר את החדר לכניסה. לאחר מכן חבר את חוטי החיבור של החדר לממריץ החשמלי.

לחלחל את הנוירונים עם 1.5 מיליליטר של צבע fm מדולל. לאחר מכן לעורר את הנוירונים באמצעות הממריץ המצורף כדי לעורר ספיגת צבע לאחר הגירוי, יש להחדיר את הנוירונים בתמיסת מלח טרייה למשך שתי דקות כדי לשטוף עודפי צבע FM. לאחר מכן שמור את הנוירונים בתמיסת המלח למשך שמונה דקות.

בינתיים, אתר את הרשתות האקסונליות בהן נראים מסופי העצבים הטעונים FM D הבודדים. שימוש באורכי גל פלואורסצאין. הימנע מהאזורים עם אשכולות תאים.

לאחר מכן מקד מחדש את התמונה מיד לפני רכישת התמונה מכיוון שייתכן שהתרחשה סחיפה קלה במהלך תקופת המנוחה. התחל ברכישת תמונות דולג זמן בקצב של פריים אחד כל ארבע שניות. לאחר רכישת חמש עד 10 תמונות בסיסיות, מעורר אקסוציטוזיס של המאגר הניתן לשחרור בקלות על ידי מתן גירוי של 30 הרץ למשך שתי שניות.

לאחר רכישת 10 תמונות נוספות, עורר שלפוחית סינפטית, אקסוציטוזיס של מאגר המילואים באמצעות שלושה גירויים של 40 הרץ למשך 10 שניות עם מרווח של 40 שניות בין גירוי, רכש עוד חמש עד 10 תמונות. לאחר מכן השהה את רכישת התמונה. אפשרו לתאי העצב להתאושש במשך 20 דקות לפחות, וחזרו על פרוטוקול S חד-פאזי זה שוב ב-S דו-פאזי עבור ניסוי הבקרה.

לניתוח נתונים, המירו את התמונות לאוסף. השתמש בפונקציה מובנית של תמונה J, ולאחר מכן כוונן את הבהירות והניגודיות של הערימה כדי למקסם את הטווח הדינמי אם התרחשה סחיפה אופקית משמעותית. במהלך הניסוי, הפעל תוספי stack reg ו-turbo reg בתמונה J כדי ליישר את ערימת התמונות.

לאחר מכן תוסף מנתח סדרות זמן ריצה. לאחר מכן, הגדירו את אזורי העניין על פני לפחות 90 מסופי עצבים. זה מועיל לעבור בין התמונות לפני ואחרי הפריקה כדי לחשוף מסופי עצבים פעילים.

אזור אידיאלי של גודל עניין הוא כזה שהוא מעט גדול יותר ממסוף עצבי טיפוסי. לאחר מכן קבל את עוצמת הקרינה הכוללת של כל אזור עניין לאורך זמן. לאחר מכן, ייצא ל-Microsoft Excel.

מוצג כאן תרשים זרימה של ניסוי בקרה שבו נוירונים של גרגירי המוח הקטן הוטענו ב-10 מיקרו-מולרי FM 1 43 תוך שימוש בגירוי של 80 הרץ 10 שניות. הנה תמונה המציגה מסופי עצבים טעונים ב-FM 1 43. הנה אותה תמונה המציגה 90 אזורי עניין ממוספרים שנבחרו לניתוח לאחר זיהוי מסופי עצב פעילים, ואלו הן התמונות של מסופי העצבים בנקודות זמן נבחרות.

תמונות אלה מוצגות בצבע פסאודו כדי להמחיש את השינויים בקרינה כאשר בריכות השלפוחית הסינפטיות השונות התרוקנו. לבסוף, הוצגו כאן היחידות הפלואורסצנטיות המנורמלות של 90 מסופי העצבים הללו. בשני שלבים S אחד ו-S, ניתן למדוד ולהשוות את ירידת הקרינה של כל גירוי עוקב בין שלב S אחד לשני שלבים.

בניסוי בקרה זה, גם S 1 וגם S 2 הביאו לאותם גדלים של המאגרים הניתנים לשחרור והמילואים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לכמת את החידוש והניוד של בריכות שלפוחיות סינפטיות ספציפיות במסופי העצבים המרכזיים באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות של חיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאשר את כדאיות התא ותגובתו על ידי ביצוע ניסויי בקרה S one לפני שינוי תנאי הניסוי S 2.