ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM
11 בנובמבר 2011
טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את ההשבחה והגיוס של מאגרים ספציפיים של שלפוחיות סינפטיות בקצות עצביים מרכזיים באמצעות טכניקות של דימוי פלואורסצנציה חיה. דבר זה מושג על ידי ניטור שני סבבים של מחזור שלפוחיות סינפטיות, תוך שימוש בצבעי FM באותם קצות עצביים כדי לספק בקרות פנימיות תקפות. כשלב שני, המאגר הזמין לשחרור המיידי והמאגר הרזרבי מרוקנים באופן רצופי באמצעות פרוטוקולי פריקה ספציפיים, המאפשרים את כימות הגדלים היחסיים של המאגרים.
בשלב הבא, שנו את תנאי הטעינה או הפריקה כדי לבחון את השפעת הווריאציה הנבחרת על שלב השקיעים של הוסיקולות הסינפטיות, על מילוי המאגרים או על הגיוס שלהם. התוצאות מראות כי טעינת FM d של מאגרים פיזיים סינפטיים שונים היא ניתנת לשחזור, בהתבסס על כימות וניתוח של פריקת הצבע המעוררת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון משפחת ה-fluent של הדיווחים הגנטיים, הוא שטכניקה זו עוקבת אחר מילוי המאגרים באופן ספציפי על ידי וסיקולות סינפטיות שעברו אנדוציטוזה.
הוא מאפשר גם כימות מדויק. מכיוון שפרוטוקול זה מבוצע פעמיים באותם סיומים עצביים, הוא מספק בקרה פנימית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הסינפסה, ה-CLE, האנדוציטוזה והאקסוציטוזה, כגון כיצד מניפולציה במצבים ספציפיים של אנדוציטוזה יכולה להשפיע על חידוש מאגר המיחזור הכולל ומאגרי ה-CLE הסינפטיים שבתוכו, דוגמת המאגר הזמין לשימוש מיידי (readily reusable pool) והמאגר הרזרבי.
ההגדרה הבסיסית של הניסוי צריכה לכלול מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי הפוך, מצלמת CCD מקוררת, מקור אור פלואורסצנטי, מערכת פרפוזיה מבוססת כבידה, תא הדמיה עם אלקטרודות פלטינה מקבילות וסטימולטור חשמלי, ומחשב. יש לבצע את הניסויים בחשכה או בתנאי תאורה אדומה, עם מינימום חשיפה של הדגימה לאור פלואורסצנטי כדי למנוע הבהרה (bleaching) של צבע ה-FM. התחל את הפרוצדורה בשימוש בגורי חולדה מסוג spra dolly בני שבעה ימים להכנת תרביות ראשוניות של נוירונים גרנולריים מהמוח הקטן (cerebellar granule neurons).
לאחר הכנת התרביות, זרעו את הנוירונים במרכז של לבישת זכוכית (cover slip) בקוטר 25 מילימטר מצופה ב-poly D lysine בתוך טיפה, שקוטרה לא יעלה על שבעה מילימטרים. לאחר שעה, הוסיפו שני מיליליטר של מצע גידול לנוירונים. לאחר שבעה ימים, הניחו לבישת זכוכית אחת בתוך תמיסת מלח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר התייצבות במצע החדש. לאחר מכן, הוציאו את לבישת הזכוכית וייבשו את צדה התחתון ואת האזור שסביב התאים ההודבקים בעזרת פיסת נייר סופג קטנה.
לאחר מכן, השתמש בגריז סיליקון כדי להדביק את זכוכית הכיסוי לתחתית תא הדימות. התאים צריכים להימצא בין שני החוטים המקבילים. השתמש בכמות מספקת של גריז סיליקון כדי לאטום את התא לחלוטין, מבלי שהגריז יחדור למרכז תא האמבט.
בשלב הבא, מלא בעדינות את תא הרחצה בכ-260 µL של תמיסת מלח. לאחר מכן, מלא את צינורות הכניסה והיציאה באותה תמיסה. אטום את התא על ידי הדבקת כיסוי זכוכית (cover slip) נקי לחלק העליון באמצעות גריז סיליקון.
לאחר מכן, הסר בועות אוויר שנלכדו בתא באמצעות צינורות הכניסה והיציאה. לאחר מכן, קבע את תא ההדמיה על פלטפורמת פלדת אל-חלד. בדוק אם ישנן דליפות על ידי הזרמה עדינה של תמיסת סלין דרך צינור הכניסה.
השלב הבא הוא להניח את התא המורכב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. יש להזרים תמיסת מלח לכניסה של מערכת הפרפוזיה בכבידה ולחבר את התא לכניסה. לאחר מכן, חברו את חוטי החיבור של התא למעורר החשמלי.
בצעו פרפוזיה לנוירונים עם 1.5 milliliters של צבע fm מדולל. לאחר מכן, גרו את הנוירונים באמצעות הסטימולטור המחובר כדי להשרות ספיגה של הצבע. לאחר הגרוי, בצעו פרפוזיה לנוירונים עם תמיסת סליין טרייה למשך שתי דקות כדי לשטוף את עודפי צבע ה-FM. לאחר מכן, השאירו את הנוירונים בתמיסת הסליין למשך שמונה דקות.
בינתיים, אתרו את רשתות האקסונים שבהן ניתן להבחין בעמסי סופי עצב בודדים של FM D. השתמשו באורכי גל של פלואורסצאין. הימנעו מאזורים הכוללים מקבצי תאים.
לאחר מכן, בצעו מיקוד מחדש של התמונה מיד לפני רכישת התמונה, שכן ייתכן שחלה סטיה קלה במהלך תקופת המנוחה. התחילו ברכישת תמונות בשיטת time-lapse בקצב של פריים אחד בכל ארבע שניות. לאחר רכישת חמש עד 10 תמונות בסיס (baseline), עוררו אקסוציטוזה של מאגר השחרור המהיר (readily releasable pool) על ידי מתן גרייה של 30 hertz למשך שתי שניות.
לאחר רכישת 10 תמונות נוספות, עוררו את האקסוציטוזה של שלפוחיות סינפטיות ממאגר הרזרבה באמצעות שלוש גרגרות של 40 hertz למשך 10 שניות עם מרווח של 40 שניות בין הגרגרות, ורכשו חמש עד 10 תמונות נוספות. לאחר מכן, הפסיקו את רכישת התמונות. אפשרו לנוירונים להתאושש למשך 20 דקות לפחות, וחזרו על פרוטוקול שלב S1 זה שוב בשלב S2 עבור ניסוי הביקורת.
לצורך ניתוח נתונים, המירו את התמונות לערימה (stack). השתמשו בפונקציה מובנית של ImageJ, ולאחר מכן כווננו את הבהירות והניגודיות של הערימה כדי למקסם את הטווח הדינמי במידה והתרחשה סטיה אופקית משמעותית. במהלך הניסוי, הפעילו את התוספים stack reg ו-turbo reg ב-ImageJ כדי ליישר את ערימת התמונות.
לאחר מכן, הפעל את תוסף מנתח סדרות זמן הריצה (runtime series analyzer plugin). בשלב הבא, הגדר את אזורי העניין (regions of interest) עבור לפחות 90 סיומים עצביים. מעבר בין התמונות שלפני ואחרי פריקת הצבע (die unloading) מסייע בחשיפת סיומים עצביים פעילים.
גודל אידיאלי של אזור עניין (region of interest) הוא גודל הגדול במעט מקצה עצב טיפוסי. לאחר מכן, השג את עוצמת הפלואורסצנציה הכוללת של כל אזור עניין לאורך זמן. לאחר מכן, ייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel.
מוצגת כאן תרשים זרימה של ניסוי ביקורת שבו נוירונים גרנולריים של המוח הקטן נטענו ב-10 µM FM 1 43 באמצעות גרייה של 80 Hz למשך 10 seconds. כאן מוצגת תמונה המראה סיומי עצב נטענים ב-FM 1 43. כאן מוצגת אותה תמונה המראה 90 אזורי עניין (regions of interest) ממוספרים שנבחרו לניתוח לאחר זיהוי סיומי עצב פעילים, ואלו הן תמונות של סיומי העצב בנקודות זמן נבחרות.
תמונות אלו מוצגות בצבעי פסאודו כדי להמחיש את השינויים בפלואורסצנציה ככל שמאגרי השלפוחית הסינפטית השונים התרוקנו. לבסוף, מוצגות כאן היחידות הפלואורסצנטיות הנורמליזציה של 90 סיומי עצבים אלו. בשלבי S one ו-S two, ניתן למדוד את הירידה בפלואורסצנציה של כל גירוי עוקב ולהשוותה בין שלבי S one ל-S two.
בניסוי ביקורת זה, הן S one והן S two הביאו לאותם גודלים של המאגרים הזמינים לשחרור המהיר (readily releasable) והמאגרים הרזרביים (reserve pools). לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת את ההשלמה והגיוס של מאגרי שלפוחיות סינפטיות ספציפיים בטרמינלי עצבים מרכזיים באמצעות טכניקות של דימוי פלואורסצנציה חיה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאשר את חיות התאים ואת תגובתם על ידי ביצוע ניסויי הביקורת של S one לפני שינוי התנאים הניסויים של S two.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה של דימוי פלואורסצנציה בחי (live imaging) לכימות של חידוש וגיוס של מאגרים ספציפיים של שלפוחיות סינפטיות (SV) בטרמינלי עצב מרכזיים. השיטה מאפשרת ניטור של שני סבבים של מיחזור SV באותם טרמינלי עצב, ובכך מספקת בקרה פנימית לצורך כימות מדויק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימוי
רקע
- הבנת הדינמיקה של שלפוחיות סינפטיות היא חיונית להשגת תובנות לגבי תמסורת עצבית.
- טכניקות של דימוי חי (Live imaging) משפרות את היכולת לחקור תהליכים סינפטיים בזמן אמת.
- בשיטות קודמות חסרה היכולת לעקוב ביעילות אחר מאגרי שלפוחיות ספציפיים.
- מחקר זה שואף לשפר את הטכניקות הקיימות על ידי אספקת בקרות פנימיות.
מטרת המחקר
- לכימות של חידוש וגיוס מאגרי שלפוחית סינפטית.
- לניטור של שני סבבים של מיחזור שלפוחית סינפטית באותם קצוות עצביים.
- להערכת ההשפעות של תנאי טעינה ופריקה שונים על דינמיקת השלפוחיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימות פלואורסצנציה חי עם צבעי FM להדמיית שלפוחיות סינפטיות.
- דלטורה רצופה של מאגרי השלפוחיות הזמינים לשחרור (readily releasable) ומאגרי הרזרבה באמצעות פרוטוקולים ספציפיים.
- דימות Time-lapse ללכידת הדינמיקה של השלפוחיות במהלך גרייה.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות לצורך כימות עצימות הפלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת מעקב הדירReproducible של טעינה ופריקה של שלפוחיות סינפטיות.
- ביקורות פנימיות משפרות את תוקף התוצאות שהתקבלו.
- מניפולציות של מצבי אנדוציטוזה משפיעות באופן משמעותי על חידוש השלפוחיות.
- ניתוח כמותי חושף תובנות לגבי גדלי מאגרי השלפוחיות הסינפטיות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מהימנה לחקר הדינמיקה של שלפוחיות סינפטיות.
- היא מציעה פוטנציאל למתן מענה לשאלות מפתח בפיזיולוגיה סינפטית.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על תמסורת עצבית ופלסטיות סינפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של הדינמיקה של מאגרי הוריקולות הסינפטיות, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף המטרה עבור תוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים. באמצעות אספקת בקרות פנימיות וניתוח דיפרנציאלי של המאגרים, היא מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, שבהם מנגנוני תעבורת הוריקולות מהווים מטרות טיפוליות. הגישה פותרת את בעיית השונות בין דגימות שונות, ובכך משפרת את השחזור עבור שיתופי פעולה רב-תחומיים בצינורות פיתוח של בדיקות (assays).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולי תעבורת שלפוחיות סינפטיות לצורך תיקוף של מטרות המעורבות בשחרור ובמיחזור של מוליכים עצביים.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של המאגר הזמין לשחרור המיידי ושל התחדשות מאגר הרזרבה תחת תנאי גרייה משתנים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות מוכנות לבדיקה של קינטיקת גיוס וסיגנלינג של שלפוחיות, שניתן להשתמש בהן לסריקת תרכובות המשפיעות על אנדוציטוזיס או אקסוציטוזיס.
- ערך תפעולי: משתמש בסימון בצבע FM כדי להפיק אותות פלואורסצנציה קוונטליים הפרופורציונליים לשחרור שלפוחיות, מה שמאפשר פורמטים של סריקה כמותית וסטנדרטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלה על ידי כימות האופן שבו מניפולציות של מצבי אנדוציטוזה משפיעות על מאגרי וסיקולות ספציפיים בתוך נוירונים גרנולריים של המוח הקטן.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואות בתוך אותה הכנה (שלבי S1 מול S2) כדי לשלוט בשונות ביולוגית, ובכך מגביר את אמינות הבדיקה במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי תרכובות מובילות (lead identification), כאשר הבנת הדינמיקה של מאגר הוזיקולות מספקת מידע על מנגנון הפעולה והשפעות התרכובות על התפקוד הפרסינפטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות לגבי האופן שבו מסלולי אנדוציטוזה (למשל, אנדוציטוזה תלוית-קלתין לעומת אנדוציטוזה המונית תלוית-פעילות) מווסתים את גיוס מאגר הוריסיקולות.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור (קינטיקה של דעיכת פלואורסצנציה) המאפשרות השוואה של השפעות תרכובות על מיחזור וריסיקולות.
- אנליטיקה: מספק מדידות של עוצמת פלואורסצנציה ברזולוציית זמן מאזורים נבחרים (regions of interest), מה שמאפשר חישוב של קצבי מילוי ספציפיים למאגר.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות שימוש במודלים נוירונליים רלוונטיים למחלה כדי להעריך כיצד הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות משנות את תעבורת הוריסיקולות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תזרים עבודה סטנדרטי של דימוי שניתן להתאימו למודלים נוירונליים ופרוטוקולי גירוי שונים לשימוש חוזר במסעות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי בידוד התרומה של מאגרי שלפוחיות סינפטיות ספציפיות לדינמיקה של התמסורת העצבית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות בקרות פנימיות (מדידות דו-פאזיות באותם קצוות עצביים) ופרוטוקולי צבע FM סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות פרה-סינפטיות, ובכך תומך בקבלת החלטות go/no-go טובות יותר בשלבי הגילוי המוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעות על חידוש מאגר השלפוחיות, מנגנון פרה-סינפטי מרכזי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי פלואורסצנציה בשידור חי ובהכנת תרביות נוירונים, במיוחד עבור נוירוני גרנול של המדולית ראשוניים.
- תלוי במיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה הפוכה, מצלמת CCD מקוררת, גירוי חשמלי ומערכות פרפוזיה להחלפת תמיסות מדויקת.
- מחייב סטנדרטיזציה של זמני הצביעה, השטיפה והגירוי בין הרצות שונות כדי להבטיח טעינה ופריקה השוואתיות של וזיקולות.
- חייב לקחת בחשבון שונות בצפיפות ובבריאות של סופי העצבים, דבר המטופל על ידי בחירת סופים פעילים ושימוש בביקורות פנימיות.
- מוגבל לדגימות הנגישות מבחינה אופטית; אינו מתאים לפורמטים של סריקה רחבה (high-throughput) ללא אוטומציה של הדימוי והניתוח.
