Name: הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: חקור תגובה אוטואימונית בעור של קופי מקוק רזוס רגישים לגלוטן עם דרמטיטיס הרפטיפורמיס. השיטה כוללת דגימת עור, צביעת H&E וצביעת אימונופלורסצנציה לזיהוי נוגדנים אוטואימוניים נגד טרנסגלוטמינזה עורית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות אמנדה Tardo, ד&quot;ר מוסטאפה Bouljihad, סטפני פילי, קרול קוין, ד&quot;ר ארין Ribka, ד&quot;ר פיט דידייה ודורותי Kuebler לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01-DK076653 ו-3R01 DK076653-02S1 כדי KS ועל ההפעלה הבסיסית מענק של TNPRC RR000164.

1. העור ביופסיה אוסף מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הליך ביופסיה בעור, להרדים בעלי חיים לתוך שריר עם 2.5 מ"ג / ק"ג של hydrochloride tiletamine ו hydrochloride zolazepam תערובת telazol (Fort Dodge לבריאות בעלי חיים, Fort Dodge, IA). צג החיות מהממשל של הרדמה עד שכיבה ולאחר מכן להסיר מן המתחם שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מאזור העור של עניין ניצול הזהב אוסטר קליפר A5 מהירות יחיד וטרינרי עם להב בגודל 40 (אוסטר מקצועיים מוצר, Mcminnville, TN) וגם בסביבה נקייה מחיידקים, להכין עם לסירוגין לשפשף בבטאדין ואלכוהול. Secure וילון fenestrated סטרילי על האתר ביופסיה שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, במקום 4.0 מ"מ Miltex Punch Dermal מכשיר ביופסיה (Miltex, יורק, פנסילבניה) על העור תוך כדי סיבוב המכשיר 180 מעלות בכיוון השעון נגד כוון השעון עם לחץ קל עד אגרוף ביופסיה transects דרך שכבות הדרמיס לתוך טי תת עוריתssue. הסר את דגימת ביופסיה ולתפוס את החלק transected של העור עם מלקחיים, פטורה הרקמה התת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת פגם עור עם תפר 3-0 ניילון קשור מחט חיתוך 08/03 מעגל (Ethilon, Ethicon, חברת Johnson &amp; Johnson Medical בע"מ, ברקשייר, בריטניה) בדפוס הצולבות. תן את כל החיות 0.01 מ"ג / ק"ג hydrochloride עצירות (Hospira, בלייק פורסט, אילינוי) לתוך שריר עבור שיכוך כאבים שלאחר הניתוח. </li></ol> 2. לדוגמא עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה עם דגימות ביופסיה של העור מפני דלקת עור כרונית ושליטה בריא קופי רזוס. השג 02:58 (4 מ"מ קוטר) דגימות ביופסיה כל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן במדגם הראשון פורמלין אבץ (Z-לתקן, Anatech בע"מ, Battle Creek, MI) למשך 24 שעות, לשטוף במים למשך 30 דקות, לשטוף בקצרה אתנול 70%, ואת המקום לתוך מעבד לייקה ASP300 רקמות (לייקה מיקרוסיסטמס , באפלו גרוב, KS) שבו הרקמה מיובש עם ציונים בסדר עולה של 70%, 80%, 95% ו 100% אתנול 48דקות כל אחד (פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה), ואחריו שני שינויים של קסילן (פישר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע בתקשורת פרפין (פישר) עבור אחסון לטווח ארוך בטמפרטורת החדר. מקום ב-20oC במשך 20 דקות לפני חתך. הכן 6 חלקים מיקרומטר באמצעות microtome סיבובית (HM325, Microm הבינלאומי, וולדורף, גרמניה). מקום בסעיפים בשקופיות טעונים (פישר) ואוויר יבש ב 60oC לילה. הכתם עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E) שיטה סטנדרטית (המתואר להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן במדגם השני paraformaldehyde 2% (USB קורפ, קליבלנד, OH) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף שלוש פעמים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), מקום סוכרוז 30% (פישר) עבור 4 שעות, להטביע במדיום הקפאת אוקטובר (סאקורה Finetek, Torrence, CA). שמור ב-80oC במשך 20 דקות לפני חתך. הכן 15 סעיפים מיקרומטר באמצעות cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. H &amp; E מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize להטביעסעיפים ded דרך שלושה שינויים של xylenes (פישר) ו רעננותם דרך ethanols מדורגים: שלושה שינויים של 100%, שני שינויים של 95%, שינוי אחד של 80% מים מזוקקים, 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם hematoxylin (ריצ'רד אלן, מדעי, Kalamazoo, MI) דקות אחד אחר על ידי שטיפה קצרה במים זורמים מהברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם eosin (Sigma) במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים רקמות מוכתמת דרך 95% אתנול ו המוחלט, שני שינויים של 2 דקות כל אחד ולאחר מכן נקה שלושה שינויים של xylenes, 3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverglass באמצעות הרכבה בינונית Cytoseal (ריצ'רד אלן, מדעי) על H &amp; E מוכתם סעיפים רקמות. </li></ol> 4. Histopathological הערכה בדיקת H &amp; E מוכתם סעיפים העור ביופסיה תחת מיקרוסקופ אור באמצעות 4 - הגדלה 40X ו מיקרוסקופ הלייקה עם נקודה Insight מצלמה דיגיטלית (Digital מכשירים בע"מ, מישיגן, ארה"ב). 5. Immunofluorescent staiנינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה עם אוקטובר, משובצים קטעים העור כתמים immunofluorescent. לפני מכתים, יש להשרות למשך 20 דקות ב PBS המכיל 0.2% עור הדג ג'לטין (FSG, Sigma) עם 0.1% טריטון X-100 (Sigma) כדי להסיר את אוקטובר ועד permeabilize הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה את השקופיות, דגירה עם 10% עז בסרום נורמלי (NGS, Sigma), בדילול מלא PBS-FSG שעה 1, בטמפרטורת החדר, בחדר שקופיות humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמחיש את בתצהיר של IgA ו tTG2 נוגדנים, דגירה שקופיות עם אנטי רזוס IgA ו tTG2 נוגדנים ראשוניים, מדולל ב -10% NGS-PBS-FSG שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) במשך 10 דקות, ואחריו PBS-FSG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם משנית, אלוטיפ נוגדנים ספציפיים מתוייגים עם אלקסה פלואוריד fluorochrome 488 (ירוק), 568 (אדום) או 633 (כחול) (בדיקות מולקולריות, Invitrogen) בדילול 1:1,000. השתמש צבע ToPro-3 כדי להמחיש את ה-DNA גרעיני. השתמש ב -10% NGS-PBS-FSG diluent כמו נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פתרון אנטי מרווה (Sigma) לעלות את הסעיפים רקמה צבעונית. </li></ol> 6. Confocal הדמיה ביצוע הדמיה עם TCS לייקה SP2 נכון מיקרוסקופ סורק לייזר Confocal (לייקה, Wetzlar, גרמניה) מצויד בשלושה לייזרים (שש שורות עבור עירור זמין): ארגון, קריפטון לייזר ב 488 ננומטר (ירוק), לייזר קריפטון ב 568 ננומטר ( אדום) לייזר הליום ניאון ב 633 ננומטר (כחול), כי ההיקף מן הגלוי לצד מרחיקות אדום של הספקטרום. ההפרש שיא הפרעה בניגוד (DIC) תמונות להערכת הארכיטקטורה אי שכותרתו רקמות. 7. נציג תוצאות דוגמה חיובית להכרה של eTG ידי שני tTG2 ונוגדנים IgA מוצג באיור. 3A. בקנה אחד עם המצב בחולים אנושיים, בשל שכיחות נמוכה בהרבה של אטופיק ד"ה כמו מ CD-כמו רגישות לגלוטן גם קופי רזוס, רוב דגימות ביופסיה של העור צפויים show התגובה החיובית עם tTG2 נוגדנים אך ללא נוכחות של IgA tTG2 + + תאים חיובי כפול (איור 4). אלה DH-קשור המקרים, כולל במקרים דרמטיטיס ממוצא מיקרוביאלי, יגלה כמה חד תאים IgA חיובי + מפוזרים מתחת האפיתל אך לא חפיפה ספקטרלית בין tTG2 IgA ו-שכותרתו סמנים (איורים 3 ב ו - 4). לכן, חשוב לשמור על סדר הליכי הבדיקה הציע, החל בדיקה קלינית (איור 1), ואחריו הערכה histopathological (איור 2) ורק אם לא דרמטיטיס הגורמים אחרים, נפוצים יותר סוכנים ניתן לזהות, confocal בדיקה מיקרוסקופית של ביופסיות עור מוכתם עבור tTG2 ו IgA היא מוצדקת. הערכה קלינית ו / או histopathological לבדן אינן מספיקות לצורך אבחון חיובי של מצב זה. במקרים אלה, כאשר פעמיים חיובי (tTG2 + IgA +) תאים מזוהים מסביב לאזור של ואדומות עורי, ד"ה כמו אבחון דרמטיטיס ניתן להנפיק. במקרים כאלה, נסיגה של גלוטן תזונתייםוהמינהל של דיאטה נטולת גלוטן מומלץ על מנת להקל על הסימפטומים דרמטיטיס. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לאזור המפשעה של מקוק EM96 לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 5 שבועות. חידוש של גלוטן תזונתיים בקנה אחד עם הופעתו של דרמטיטיס (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. HE מכתים של EM96 ביופסיות עור מקוק שנאספו לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 9 שבועות. ת: הוא אפיתל מעובה (7-15 שכבות לתאי האפיתל) עם קרום עבה של תאים שטחית hyperkeratotic הסתננו עם נויטרופילים המתנוונת. נויטרופילים להופיע גם בתוך האפיתל ו מעורבבים עם מספרים מתונה של לימפוציטים, תאים פלזמה ו היסטיוציטים סביב adnexa בדרמיס העליון. B: חלק hyperkeratosis עדיין קיים, עובי האפיתל הוא מנורמל (4-7 שכבות) עם חדירה מינימלית lymphoplasmacytic בדרמיס העליון. C: עור בטן רגיל מן מקוק FR56, עם חדירה לא lymphoplasmacytic, נכלל להשוואה. הגדלה 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> באיור 3. תמונות מיקרוסקופיה confocal של EM96 ביופסיות עור מקוק שנאספו לפני (A) ואחרי (ב) הנסיגה של גלוטן תזונתיים במשך 9 שבועות. ת: IgA מכתים (ירוק), tTG2 (אדום) ToPro-3 סמן דנ"א גרעיני (כחול). Co-לוקליזציה של IgA ו tTG2 מופיע צהוב מסביב לאזור של papilae עורי. ב ': מדגם העור נלקח לאחר 9 שבועות של דיאטה ללא גלוטן לא מראה IgA בתוך האפיתל בעוד כמה IgA subepithelial עדיין קיים (ירוק), tTG2 (אדום) ToPro-3 סמן דנ"א גרעיני (כחול). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בעלי חיים תג </td><td> מין [ז / נ] </td><td> גיל [שנה] </td><td> תסמינים קליניים </td><td> פלזמה tTG2 נוגדנים </td><td> דיאטה [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> בריא </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> בריאות, מדי פעם שלשולים </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> שלשול כרוני אידיופטית </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td> דלקת עור כרונית </td><td> + / - (גבולי) </td><td> 1 ו 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> דלקת עור כרונית </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. TNPRC קופי רזוס המשמש לאיסוף ביופסיות עור * דיאטה 1 - קבוע קוף צ'או (המכיל גלוטן); 2 דיאט - דיאטה ללא גלוטן

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שהוקם שלנו לא אנושיים מודל הפרימטים של רגישות לגלוטן היה בשימוש לאחרונה ללמוד את השינויים חדירות המעי מופעלות על ידי גלוטן בתזונה 5,6. פלזמה tTG2 נוגדנים, כמו גם במעיים tTG2 IgA + פיקדונות + התגלו כמה גלוטן רגיש קופי מקוק. מאז זיהינו לאחרונה מקרים נדיר של דרמטיטיס אידיופטית במושבה קופי רזוס, שם לא האטיולוגיה הרגיל (זיהומית / מטבולית) יכול להיות שהוקמה, מטרת המחקר הנוכחי הייתה להעריך אם tTG2 + IgA + פיקדונות נוגדן ניתן היה לזהות דגימות העור מפני אלה במקרים נדירים של דרמט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג מספר / קוד מוצר </td><td> פתק </td></tr><tr><td> Anti-Human-IgA FITC * </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 עובד דילול </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 עובד דילול </td></tr><tr><td> אנטי עכבר IgG1 ** </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> A-21124 </td><td> 1:1,000 עובד דילול </td></tr><tr><td> ToPro-3-DNA *** בדיקה </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> T-3605 </td><td> 1:1,000 עובד דילול </td></tr><tr><td> אבץ פורמלין (Z-לתקן) </td><td> Anatech בע&quot;מ, Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> אוקטובר הקפאת בינוני </td><td> סאקורה Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal הרכבה בינוני </td><td> ריצ&#39;רד אלן, מדעי, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-מרווה פתרון </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (תפר ניילון) </td><td> Ethicon, חברת Johnson &amp; Johnson, ברקשייר, בריטניה </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex Punch כלי Dermal ביופסיה </td><td> Miltex, יורק, הרשות הפלסטינית </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> אוסטר הזהב A5 מהירות יחיד Vet קליפר עם להב בגודל 40 </td><td> אוסטר מוצרים, Mcminnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> לייקה מעבד רקמות </td><td> Leica Microsystems Inc., באפלו גרוב, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> רוטרי Microtome </td><td> Microm הבינלאומי, וולדורף, גרמניה </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> לייקה, Wetzlar, גרמניה </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * והעמסת isothiocyanate ** משניים (אלקסה פלואוריד 568-מצומדות) נוגדן שימוש לאחר tTG2 נוגדן ראשוני ** דיי

הכרה transglutaminase עוריות על ידי iga ו transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Transglutaminase רקמות 2 (tTG2) הוא אנזים העיכול במעיים אשר deamidates כבר מעוכל חלקית תזונתיים כגון פפטידים gliadin גלוטן. אצל אנשים נטייה גנטית, tTG2 מעורר תגובות אוטואימונית מאופיינים בייצור נוגדנים tTG2 בתצהיר ישירה שלהם לתוך 1,2 קטן בקיר המעי. נוכחות נוגדנים כאלה מהווה את אחד המאפיינים העיקריים של המחלה צליאק (CD). עוריות transglutaminase (eTG) הוא חבר אחר של המשפחה transglutaminase זה יכול לפעול גם autoantigen במיעוט קטן של חולים CD. אלה מקרים נדירים יחסית, eTG מעורר תגובה אוטואימונית (פריחה בעור) ידוע קליני herpetiformis דרמטיטיס (DH). למרות שהמנגנון המדויק של הפתוגנזה CD ו-DH אינה מובנת היטב, ידוע כי tTG2 ו eTG antigenic לשתף epitopes כי יכול להיות מוכר על ידי נוגדנים בסרום של חולים הן CD ו-DH 3,4. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; במחקר זה, בדיקה מיקרוסקופית של דגימות ביופסיה confocal של נגעים בעור של שני קופי רזוס (Macaca המולאטית) עם דרמטיטיס (טבלה 1, איור. 1 ו -2) שימש כדי ללמוד את רקמות המושפעים. בשנת חיה אחת (EM96) חפיפה ספקטרלית של נוגדנים IgA ו tTG2 (איור 3) הודגם. נוכחות של פעמיים חיובי tTG2 + IgA תאים + היה ממוקד האפידרמיס עמוק, גבשושיות סביב עורי. זה עולה בקנה אחד עם נגעים המתוארים חולים DH 3. כאשר EM96 הושם על דיאטה נטולת גלוטן, דרמטיטיס, כמו גם tTG2 IgA + + פיקדונות נעלם כבר לא היו לגילוי (איורים 1-3). דרמטיטיס והופיע עם זאת, על סמך היכרות מחדש של גלוטן תזונתיים ב EM96 (לא מוצג). ב קופי אחרים, כולל בעלי חיים עם דרמטיטיס קשור, + + פיקדונות tTG2 IgA לא התגלו. דיאטה ללא גלוטן תלויי הפוגה של אטופיק ב EM96 יחד עם נוכחות של IgA tTG2 + + תאים בעור שלה להציע אוטואימוניות, כמו DH-מנגנון התפתחות של מצב זה. זהו הדו&quot;ח הראשון של דרמטיטיס-DH כמו פרימטים לא אנושיים כלשהם.

Herpetiformis דרמטיטיס (DH) היא מחלה דלקתית כרונית המאופיינת תגובה אוטואימונית בין IgA ו אפידרמיס transglutaminase (eTG). ד&quot;ה מפתחת בחלק קטן מאוד של חולים הרגישים לגלוטן ו / או צליאק. תוצאות המחקר הזה מצביעים על כך ד&quot;ה יכול גם להתפתח לארח רזוס קוף עם סימפטומים של אטופיק idiopatic.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

טרנסגלוטמינאז רקמתי 2 (tTG2) הוא אנזים עיכול במעי שדאמיד את הגלוטן התזונתי שעבר כבר עיכול חלקי, למשל פפטידים של גליאדין. ב...

מאמר וידאו זה מדגים שיטה להדמיה של התגובה האוטואימונית בעור של כלבי Reeses Maccas הרגישים לגלוטן עם dermatitis herpetiformis. הדבר מושג תחילה על ידי זיהוי בעלי חיים עם דרמטיטיס שאינה ניתנת לקשירה לגורמים נפוצים יותר למחלה, מתוך מקרים אידיופתיים אלו ובתוספת קבוצות ביקורת בריאות בהתאמה לגיל. דגימות עור נלקחות מהאזור הפגוע כדי להעריך את ארכיטקטורת הרקמה, את הדלקת וכן את נוכחותו של epidermal transglutaminase.דגימות שנאספו של נוגדנים עצמיים מקובעות בפורמלין אבץ וב-2% פאראלדהיד המטין ב-EOSIN או HNE. לאחר מכן מבוצע צביעה להערכת מידת הדלקת וההיסטופתולוגיה, וצביעה אימונופלואורסצנטית מבוצעת להערכת שקיעת נוגדנים עצמיים לטרנסגלוטמינאז אפידרמלי באפידרמיס העמוק. דרמטיטיס הרפטיפורמיס היא מצב דלקתי כרוני המאופיין בתגובה אוטואימונית בין IgA לטרנסגלוטמינאז אפידרמלי, והיא מתפתחת בחלק קטן מאוד של חולי צליאק הרגישים לגלוטן. תוצאות מחקר זה מעידות כי DH יכולה להתפתח גם בחלק קטן של קופי רזוס הרגישים לגלוטן.תוצאותינו מאששות את התקיפות של מודל ה-Resus Meac לרגישות לגלוטן שפותח לאחרונה כפי שהוצג. התוצאות מראות כי הביטויים הקליניים של מצב זה אינם מוגבלים למעי הדק בלבד. פרוטוקול טיפוסי כולל בעל חיים אחד עם דרמטיטיס אידיופתית וביקורת בריאה אחת תואמת גיל.לאחר הרדמה מתאימה והכנת האתר באמצעות טכניקה סטרילית, הצמד מכשיר דגימה של העור (punch biopsy) מסוג miltex בקוטר 4.0 מילימטר לעור בעל החיים תוך הפעלת לחץ קל. סובב את המכשיר 180 מעלות עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון, עד שמעצב הדגימה חותך את שכבות העור אל תוך הרקמה התת-עורית. חזור על הפעולה עבור דגימה שנייה באמצעות פינצטה.אחזו בחלק החתוך של העור ושחררו אותו מהרקמה התת-עורית. הניחו את הדגימה הראשונה, שתעבור צביעת h and e, בתוך zinc formin. לאחר מכן, הניחו את הדגימה השנייה, שתיבחן באמצעות מיקרוסקופיית immunofluorescence, ב-2%Paraform aldehyde, תוך שימוש במחט חיתוך מעגלית בגודל three eighth ובחוט תפר nylon במידה three dash zero.סגור את פגם העור בתפר בצורת צלב (cruciate pattern). חזור על תהליך זה כדי להשיג שתיים עד שלוש דגימות ביופסיה מכל חיה. ניתן משככי כאבים לאחר הניתוח כפי שמתואר בפירוט בפרוטוקול הכתוב לבדיקת הנוכחות והמיקום של IGA ו-TTG two.התחילו בהדגרה של הדגימות שהוצבו ב-2% formaldehyde למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר כדי לקבע אותן לאחר הקיבוע. הסירו את ה-para formaldehyde ושטפו עם PBS למשך 30 עד 60 דקות על פלטפורמת נדנדה (rocker). חזרו על הפעולה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות, ולאחר מכן הסירו את ה-PBS והחליפו אותו ב-30% sucrose למשך ארבע שעות לפחות ועד שבועיים.לאחר מכן, מקמי את הדגימה בתוך מדיום הקפאה OCT ושקיעי אותה באמבטיה של trimethyl butane וקרח יבש עד שה-OCT השקוף הופך ללבן מוצק, מה שמעיד על הקפאה מלאה. לאחר מכן, העבירי את הבלוקים לטמפרטורה של 80°C- למשך 20 דקות לפחות. פעולה זו מבטיחה שהרקמה קפואה לחלוטין, כך שהלהב יוכל לחתוך אותה מבלי למעוך אותה.ניתן לאחסן את הרקמה לטווח ארוך ב-OCT בטמפרטורה של 80°C- . לאחר החיתוך והעמדת החתכים על תבניות, יש להסיר את ה-OCT כדי לאפשר חדירה לרקמה. טבול את התבניות בצנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה PBS עם 0.2% ג'לטין מעור דג ו-0.1% triton X 100.לאחר מכן, מקמי את הצנצנת על מכשיר ערבוב (rocker) למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, שטפי את השקופיות במשך 10 דקות ב-PBS עם 0.2% fish skin gelatin, ולאחר מכן הדגירי עם 10% normal goat serum מדולל ב-PBS עם 0.2% fish skin gelatin למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר בתוך תא שקופיות לח. הדגירי את השקופיות עם שני נוגדנים ראשוניים, anti resus IGA ו-TTG, כל אחד בנפרד, למשך שעה אחת. לאחר מכן, תוך כדי החזקת השקופית מקצוותיה, הרצי עליה בעדינות P-B-S-F-S-G Triton X 100 באמצעות פיפטת העברה.לאחר מכן, הניחו אותו בתוך צנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה את אותו הבופר. לאחר מכן, הניחו את הצנצנת על רוקר (rocker) למשך 10 דקות. חזרו על פעולת השטיפה פעם אחת.לאחר מכן, בצע שטיפה עם P-B-S-F-S-G למשך 10 דקות. דגרו עם נוגדנים משניים המסומנים ב-Alexa fluor וספציפיים לאיזוטייפ למשך 40 דקות לאחר הדגירה. שטפו את הפיתח כפי שבוצע קודם לכן.לאחר מכן, הוסיפו את צבע ה-DNA הגרעיני לתווך קיבוע מסוג pro three to anti quenching בדילול של 1:2000. טפטפו טיפה אחת מהתווך ישירות על כל זכוכית. לאחר מכן, הניחו זכוכית כיסוי מעל הרקמה ואטמו אותה בעזרת לק.הנח את הזכוכית בחושך והנח לה להתייבש. כדי להדגים את הצביעה הכפולה של IGA ו-TTG, בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי המצויד בלייזרים המתאימים לנוגדנים המשניים ששימשו להערכה של רקמה לא מסומנת. רשום תמונות בניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, DIC.DIC הוא ערוץ במיקרוסקופ המציג את הרקמה בסולם אפור. דבר זה מאפשר קביעה טובה יותר של הארכיטקטורה התאית לצורך ביצוע צביעת HNE. הדגימה שהוכנה ב-zinc formin נבלוקת תחילה בפרפין ונחתכת לפרוסות על עלויות.לאחר מכן מחממים את השקופיות בטמפרטורה של 60 °C למשך לילה ומניחים אותן בצובע אוטומטי, הצובע את השקופיות ב-HNE עם השלמת תהליך הצביעה. בוחנים את נתחי הביופסיה הצבועים תחת מיקרוסקופ אור המצויד במצלמה דיגיטלית תוך שימוש ב-Forex והגדלה של 40x. מקליטים שלוש עד ארבע תמונות עבור כל הגדלה. דגימות ביופסיה מנגעי עור של Reuss Maca הושגו ונצבעו כפי שמתואר בסרטון זה כדי לחקור את השפעת הפסקת צריכת גלוטן בתזונה על דרמטיטיס כאן.מוצג האזור המפשעתי של מקאק אחד לפני הפסקת צריכת גלוטן בתזונה. כאשר בעל חיים זה הועבר לתזונה נטולית גלוטן, הדלקת בעור נעלמה ולא ניתן היה לזהותה יותר, כפי שניתן לראות כאן. הדלקת בעור הופיעה שוב לאחר החזרת הגלוטן לתזונה כדי להעריך את מבנה הרקמה.צביעת H and e בוצעה לפני הפסקת צריכת הגלוטן. האפיתל היה מעובה עם שבע עד 15 שכבות של תאי אפיתל וקשקשת שטחית עבה של תאים היפרקרטוטיים שחוללו על ידי נויטרופילים נבלעים. נויטרופילים הופיעו גם בתוך האפיתל והיו מעורבבים עם מספרים בינוניים של לימפוציטים, תאי פלזמה והיסטיוציטים סביב הנספחים (ad nexa) בדרמיס העליון לאחר הפסקת צריכת גלוטן תזונתית למשך תשעה שבועות.נצפו עדיין מידה של היפרקרטוזיס ואפיתל מעובה, עם זאת, בהשוואה לכך נצפתה רק חדירה לימפופלסמציטית מינימלית בדרמיס העליון. כאן מוצגת עור בטן נורמלית ללא עיבוי אפיתל וללא חדירה לימפופלסמציטית לדרמיס העליון. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של אותן ביופסיות של עור מקאק שנאספו לפני הפסקת צריכת גלוטן בתזונה; קולוקליזציה של IGA המוצג בירוק ו-ttg two המוצג באדום מופיעה בצהוב סביב אזור הפפילה הדרמלית, מה שמעיד על נוכחות של נוגדנים עצמיים נגד טראנסגלוטמינז אפידרמלי.סמן ה-DNA הגרעיני to pro three מוצג בכחול לאחר תשעה שבועות של תזונה נטולת גלוטן. לא נצפתה יותר IGA בתוך האפיתל, מה שמעיד על היעדר נוגדנים עצמיים נגד epidermal transglutaminase, אשר היו מוצגים בצהוב. חלק מה-iga, A הסב-אפיתלי המוצג בירוק עדיין היה נוכח; סמן ה-DNA הגרעיני to pro three מוצג בכחול במיקומים אחרים, כולל בבעל חיים עם dermatitis אידיופתית לא קשורה.לא זוהו נוגדנים עצמיים. צביעת ה-IGA היא בירוק, ttg two באדום, וסמן DNA גרעיני to pro three בכחול. תאים חיוביים ל-ttg two נמצאים בתוך האפיתל.מספר תאים חיוביים ל-IGA מתחת לאפיתל. לא נצפתה חפיפה ספקטרלית נרחבת בין הסמנים האדומים והירוקים, מה שמעיד על היעדר נוגדנים עצמיים נגד טרנסגלוטמינאז אפידרמלי. במחקר זה, אנו משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להדגים את נוכחותם של נוגדנים עצמיים מסוג IGA נגד טרנסגלוטמינאז אפידרמלי.במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב לזכור שרוב מקרי הדרמטיטיס אינם נגרמים מרגישות לגלוטן. לכן, יש לבצע מראש שיטות אחרות, הכוללות בדיקת סרום לגילוי נוגדנים ל-gladin ול-tissue transglutaminase, לצד הערכה קלינית קפדנית. על אף זאת, השכיחות של dermatitis herpetiformis נמוכה יותר מהשכיחות של gluten sensitive enteropathy שהוצגה.התוצאות מספקות בסיס למחקר עתידי, בהנחה שיזוהו בעלי חיים נוספים עם מצב זה.

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במודל של בעלי החיים המתוארים בעבודה הנוכחית שלנו, מטוהרי נוגדני IgG נגד מתיחה של 200 חומצות אמינו (aa 757-967) של קולגן VII מוזרקים שוב ושוב לעכברים להתרבות פנוטיפ שלפוחיות כמו גם histo וimmunopathological תכונות אופייניות לאדם epidermolysis ולוזה acquisita...

שלפוחיות עור Autoantibody-Induced granulocyte תלויים

כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

כאן, הצגנו את השיטות כדי לזהות עצמיים איון האנושי באמצעות מבחני electrochemiluminescence (ECL). הפרוטוקול, השתמשו כדי לחזות סוכרת מסוג 1, ניתן להרחיב על כדי לזהות עצמיים למחלות אוטואימוניות אחרות.

מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

מוצג כאן פרוטוקול להפרדת אפידרמיס מדרמיס להערכת ייצור מתווך דלקתי. בעקבות דלקת, אפידרמיס כף רגל אחורית חולדה מופרדת מהדרמיס על ידי תרמוליסין ב 4 °C (50 °F).  האפידרמיס משמש לאחר מכן לניתוח mRNA על ידי RT-PCR והערכה של חלבונים על ידי כתם מערבי ואימונוהיסטוכימיה.

הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

פרוטוקול זה משתמש G6PI פפטידים מעורבים לבנות מודלים דלקת מפרקים שגרונית כי הם קרובים לזו של דלקת מפרקים שגרונית האדם ב CD4+ T תאים ציטוקינים. טוהר גבוהה קבוע הרוצח טבעי תאים T (בעיקר iNKT2) עם פנוטיפים ספציפיים פונקציות הושגו על-ידי בvivo אינדוקציה וטיהור מבחנה עבור חיסוני המאמצת.

חיסוני המאמצת של תאים iNKT ב גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI)-הנגרמת עכברים RA

אנו מדגמים בדיקת ECL כפולה פשוטה המשלבת 7 מבחני נוגדנים עצמיים יחד. הבדיקה מסוגלת לבצע סינון ל-T1D ולמחלות אוטואימוניות רבות אחרות, בו זמנית, כולל צליאק, מחלת בלוטת התריס אוטואימונית ותסמונת פוליגלנדולרית אוטואימונית 1.

בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 7 פלקס לבדיקה בו-זמנית של סוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות מרובות

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

נגעי עור הם מאפיינים נפוצים וחשובים במחלות ראומטיות רבות, וביופסיה עם ניתוח פתולוגי ממלאת תפקיד קריטי באבחון. מאמר זה מספק סקירה מפורטת של הליך ביופסיית העור הסטנדרטי, ותוך שימוש בזאבת אדמנתית דיסקואידית כדוגמה, מדגיש את התפקיד החיוני של דרמטופתולוגיה באבחון מחלות ראומטיות.

ביופסיית עור לאבחון זאבת אדמנתית דיסקואידית

חקור תגובה אוטואימונית בעור של קופי מקוק רזוס רגישים לגלוטן עם דרמטיטיס הרפטיפורמיס. השיטה כוללת דגימת עור, צביעת H&E וצביעת אימונופלורסצנציה לזיהוי נוגדנים אוטואימוניים נגד טרנסגלוטמינזה עורית.

הכרה Transglutaminase עוריות על ידי IgA ו Transglutaminase רקמות 2 נוגדנים במקרה נדיר של רזוס דרמטיטיס

גלה סרטונים נוספים