אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללמוד על אריזות לנטי-ויראליות. פרוטוקול של חמישה ימים. ביום הראשון, 2 9 3, תאי יצרן TN מצופים בצפיפות מחושבת.

ביום השני, התאים עוברים טרנספטציה עם מבנה וקטור הלנטי המועדף המכיל את הגן המעניין ותערובת פלסמיד אריזה ויראלית. ביום הרביעי, הסאטה הנגיפית נקצרת ומרוכזת על ידי הוספת תמיסת משקעים לנגיף PEG. השלבים האחרונים של ההליך הם לקצור את הנגיף המרוכז PEG, לסלק את הנגיף ולהדביק תאים בנגיף המרוכז לצורך טיטרינג ויראלי.

בסופו של דבר, PCR כמותי של גנים משולבים יציבים משמש לחישוב מספר המבנים המשולבים היציבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקציה של פלזמה או טרנסדוקציה רטרו-ויראלית, הוא שפרוטוקול האריזה האופטימלי של ה-FBI מייצר וירוס פעיל מבחינה תפקודית עם טיטר גבוה, המאפשר העברה יעילה כמעט לכל תא יונק, כולל תאים קשים להעברה כמו תאי גזע ותאים ראשוניים שאינם מתחלקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם אינם מכירים את פרטי הפרוטוקול הקטנים, החיוניים לייצור מוצלח של נגיף טיטר גבוה.

הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שצפיפות התאים המומחשת באמצעות מיקרוסקופ במהלך טרנספקציה קובעת את היעילות של אריזה ויראלית, הקובעת את הטיטר הנגיפי הסופי. במקרים בהם ביטוי מדווח פלואורסצנטי רלוונטי קובע את יעילות הטרנספקציה, שיש לה השפעה משמעותית על הטיטר הנגיפי הסופי. בנוסף, הדגמה חזותית של שיטה זו עוזרת לחוקרים להכיר חלקים עדינים אך חשובים של הפרוטוקול, כגון שיטות עבודה מומלצות לשמירה על סטריליות במהלך כל התהליך, וכיצד להימנע מהכללת פסולת תאים בנגיף שנקטף.

אריזה יעילה של לנטי-ויראלי מסתמכת על שלושה מרכיבים. ראשית, וקטור הביטוי הלנטי-ויראלי חייב להכיל חלק מהאלמנטים הנדרשים לאריזת הנגיף ולאינטגרציה יציבה, כמו גם אלמנטים לביטוי הגן המעניין. סיכת ראש קצרה, RNA, מיקרו RNA או קלטת עיתונאי.

שנית, פלסמידי האריזה הלנטי-ויראלית חייבים לספק את החלבונים החיוניים לאריזת עותק RNA של מבנה הביטוי לחלקיקים פסאודו-נגיפיים רקומביננטיים ולאחר מכן שעתוק הפוך ושילוב נגיף עם הזיהום. שלישית, 2 9 3 תאי יצרן TN חייבים להיות מועברים באופן חולף עם וקטורי הביטוי והאריזה. תאים אלה מייצרים חלקיקים פסאודו-נגיפיים גבוהים שנאספים מאמצעי התרבית.

בסופו של דבר, התמרה מוצלחת של תאי המטרה תלויה בעיקר במספר החלקיקים הנגיפיים לתא עבור סוג תא נתון. במילים אחרות, ריבוי הזיהומים מתחיל בגידול של 2 9 3 תאי TN. בצלחות תרבית תאים של 15 סנטימטר למשך 18 עד 24 שעות כדי להשיג שטף של 60 עד 80%.

בזמן הטרנספקציה, כל צלחת תניב כ-14 מיליון תאים כדי להגדיל את תפוקת הנגיף. ניתן להשתמש ביותר מפלטה אחת למחרת כאשר תאי 2 9 3 TN הם 60 עד 80% מתלכדים, הם מוכנים לטרנספקציה. עבור כל צלחת תאים, הוסף 1.6 מיליליטר, DMEM ללא סרום לשפופרת בז של 15 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף 22.5 מיקרוגרם של ppac H one או Ppac F1 ו-4.5 מיקרוגרם של וקטור ה-lenti שלך Construct ל-DMEM וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, הוסף 55 מיקרוליטר של חיבה טהורה לאותו צינור ומערבולת למשך 10 שניות, ולאחר מכן דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות מוסיפים צינור אחד לכל צלחת תרבות.

לאחר מכן סובב בעדינות את הצלחת, ואז דגר על התאים למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. אם מבנה וקטור הלנטי מבטא גן פלואורסצנטי כמו GFP, בדוק את התאים במיקרוסקופ, טרנספקציה מוצלחת תניב 50 עד יותר מ-90% תאים פלואורסצנטיים ירוקים שאוספים כעת את תרבית התאים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. הסופרנטנט מכיל את החלקיקים הפסאודו-נגיפיים המדבקים.

כל תא שנשלף מהצלחת לא ישפיע לרעה על ייצור הנגיף. להסרת צנטריפוגת פסולת, הסופרנטנט הנגיפי ב -1500 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מבלי להפריע לגלולה, אספו את הסופרנטנט הנגיפי והקפידו להשאיר חיץ של כ-500 מיקרוליטר של סופרנטנט והמשיכו לשלב הבא, שהוא ריכוז החלקיקים הנגיפיים 72 שעות לאחר הטרנספקציה.

איסוף שני אופציונלי של הסופרנט הנגיפי עשוי להיעשות באותה טכניקה לאחר איסוף החומר הנגיפי. מרוכז על ידי הוספת נפח אחד של תמיסת משקעים של נגיף יתד קר קרח לכל ארבעה נפחים של סופרנטנט בצינור צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 50 מיליליטר. הפוך את התמיסה כדי לערבב אותה.

לעולם אל תשתמש במערבולת, ולאחר מכן אחסן את התמיסה ללא תסיסה בארבע מעלות צלזיוס עד 96 שעות. לאחר מינימום של 12 שעות קירור צנטריפוגה את התערובת בחום של 1500 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, חלקיקי הלנטי-ויראלים המשקעים של פגו יופיעו ככדור בז' או לבן בתחתית הצינור.

כעת, הסר את כל עקבות הנוזל על ידי שאיפה זהירה מבלי להפריע לחלקיקים הלנטי-ויראלים המשקעים בגלולה. לחלופין, הסר את רוב הסופרה נאטין והשהה מחדש את הכדור בשכיבה שנותרה. לאחר מכן העבירו את המתלה לצינור עינור סטרילי של שני מיליליטר וצנטריפוגה את הצינור במיקרו פוגה קרה למשך שתי דקות.

ב-14,000 סל"ד הרחיקו את הסופרנטנט שנותר והשעו מחדש את כדור החלקיקים הלנטי-ויראלי בקרח, מאגר קר וסטרילי ב-10 עד 100. הנפח המקורי פיפטה בזהירות את הגלולה לתמיסה מבלי ליצור בועות, ושומר עליה קרה כל הזמן. ודא שהגלולה מושעה לחלוטין.

לבסוף, הכינו דיו של 15 עד 25 מיקרוליטר, בקבוקונים קריוגניים סטריליים על קרח ואחסנו את הבקבוקונים בטמפרטורה שלילית של 70 מעלות צלזיוס. ריצת אריזה מוצלחת תניב 10 עד 1000 מיליון IFUs למיליליטר להעברת וירוסים בצלחת תרבית של 24 בארות, 50,000 תאים לבאר וגידול אותם בן לילה בתנאי הגידול שצוינו. התאים צריכים להיות בין 50 ל-70% מתכנסים לצורך התמרה למטרות טיטרינג.

HT 10 80 תאים יכולים לשמש כקו תאי בקרה קל להתמרה, למחרת שואבים את המדיה מהתאים. ואז שלב את מדיום התרבות עם תמיסת ברווז מרוכזת. אז הריכוז הסופי של ברווזי טרנס הוא x אחד, הוסף חצי מיליליטר של המומר לכל באר עם תאי מטרה בצפיפות הנכונה של 50 עד 70% שטף Co הוסף וירוס לכל באר בדילולים הבאים, אחד ל-100, אחד ל-10, ודילול ישר אחד לאחד.

הנגיף יכול להישאר במגע עם תאי המטרה עד 72 שעות מבלי לשנות את המדיום. לאחר 72 שעות, הפרו-וירוס ישתלב ביציבות בגנום המארח ויבטא את הגן המעניין. אם ניתן להשתמש בביטוי סמן פלואורסצנטי נוכחי כדי להעריך את יעילות ההתמרה עם דילול וירוסים שונים, ניתן לכמת את מספר היחידות הזיהומיות על ידי QPCR.

לאחר שידוע טיטר הנגיף, חשב את נפח הנגיף המתאים כדי להשיג את ריבוי ההדבקה הרצוי עבור תאי מטרה אחרים. מדידת הטיטר ושליטה ב-MOI מבטיחים עקביות בין ניסויים והכנות נגיפיות שונות. הנגיף מוכן כעת לשימוש בניסויים נוספים.

צפיפות ההתחלה של תאי 2 9 3 TN הייתה קריטית לאריזה ויראלית מוצלחת ביום הטרנספקציה. 2 9 3 תאי TN אלה היו בין 60 ל -80% קונפלואנטים. 24 שעות לאחר טרנספקציה מוצלחת עם וקטור לנטי המבטא GFP, נמצא כי לפחות 90% מ-2 9 3 תאי TN הראו פלואורסצנטיות ירוקה.

72 שעות לאחר ההתמרה GFP המשיך להתבטא ב-HT 10 80 תאים מארחים. זה מצביע על כך שהמבנה הלנטי-ויראלי המשולב ביציבות בגנום המארח המתמיר את אותם תאי מארח בדילול פי עשרה הפחית באופן יחסי את הביטוי של GFP. מכיוון שהקשר בין טיטר ויראלי לביטוי גנים מתווך לנטי-ויראלי הוא פרופורציונלי ישיר.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו במשך חמישה ימים בערך שעה עד שעתיים ביום אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לארוז חלקיקים נגיפיים זיהומיים פונקציונלית ביעילות ובבטחה ובהצלחה תאים שהועברו עם הנגיף. אל תשכח שעבודה עם lentivirus עלולה להיות מסוכנת ואמצעי זהירות כמו עבודה במכסה המנוע של BSL שני רקמות.

יש ללבוש תמיד מעיל מעבדה וכפפות בזמן ביצוע הליך זה.