פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים פלטפורמת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ללא עדשה על השבב להדמיית עצמים פלואורסצנטיים על פני שדה ראייה רחב במיוחד. כדי להשיג זאת, מסנן ספיגה דק ולוחית פנים של סיבים אופטיים מונחים בעדינות על גבי מערך חיישנים חשמליים אופטו, או טחב CCDC, ולאחר מכן ממוקם שבב מיקרופלואידית על גבי לוחית הפנים. לאחר מכן, מנסרה מורכבת עם השבב באמצעות שמן תואם אינדקס.

ציטוט פלואורסצנטי מושג דרך הפן הצדדי של מנסרת מעוין והתאורה ההולוגרפית נעשית דרך הפן העליון של אותה פריזמה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תמונות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה מהתמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו על ידי פענוח התמונות הגולמיות באמצעות אלגוריתמים דיגיטליים. במידת הצורך, ניתן לספור אוטומטית את האובייקטים הפלואורסצנטיים המפוענחים באמצעות ממשק שפותח בהתאמה אישית.

על עדשת שבב. הדמיה באופן כללי שואפת להחליף מיקרוסקופים אופטיים מגושמים מבוססי עדשות בעיצובים פשוטים וקומפקטיים יותר. לפלטפורמה הטכנולוגית המתפתחת הזו יש פוטנציאל לבטל את הצורך ברכיבי משיכה מגושמים ויקרים בעזרת תיאוריות חדשות ואלגוריתמי שחזור דיגיטליים.

רשימת העדשות בפלטפורמת הדמיה על השבב כוללת מספר רכיבים אופטיים, כולל מערך חיישנים דיגיטלי, מקור תאורה לא קוהרנטי, פריזמה, מסנן ספיגה ולוחית פנים סיבים אופטיים, או מתחדד סיבים אופטיים. בפלטפורמה זו, ניתן להשתמש בסוגים שונים של מערכי חיישנים לזיהוי האות הפלואורסצנטי מאובייקטי מיקרו מטרה. למטרות סרטון זה, ישמש מכשיר מצמד מטען, מקור אור לא קוהרנטי, כגון דיודה פולטת אור פשוטה משמש לעירור פלואורסצנטי.

שתי שיטות סינון עירור שונות משמשות במקביל ליצירת רקע השדה הכהה הנדרש כפי שמוצג בתרשים זה. ראשית, מנסרת זכוכית או חצי כדור זכוכית משמשת ליצירת השתקפות פנימית מוחלטת או TIR במשטח התחתון של השבב המיקרופלואידי המארח את הדגימות המעניינות. במקביל לכך, נעשה שימוש במסנן ספיגה זול להסרת אורות העירור המפוזרים השבועיים שאינם מצייתים לתהליך ה- TIR.

עם דחייה מוצלחת של העירור באמצעות שני מנגנונים אלה, רק פליטת הפלואורסצנט של הדגימות נרכשת במישור הגלאי. למרות צמצם מספרי זיהוי כה גדול, כתמי הפלואורסצנט הגולמיים במערך החיישנים הופכים רחבים למדי כדי להנדס ולשלוט טוב יותר בהתפשטות המרחבית של אות פלואורסצנטי זה. לוחית פנים סיבים אופטיים תוצב בין האובייקט למישורי החיישן כחלופה ללוחית פנים רגילה.

לוחית פנים סיבים אופטיים מחודדת, בעלת צפיפות גדולה משמעותית של כבלי סיבים אופטיים בפן העליון שלה בהשוואה לחלק התחתון, יכולה לשמש להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר באמצעות הגדלה. השבבים המיקרופלואידיים המשמשים בפלטפורמה זו מיוצרים באמצעות קירות פולי דימתיל סלואן המונחים על שקופיות זכוכית כדי ליצור את תעלות המיקרו הדרושות להדמיה על השבב כדי להתחיל בהרכבה של פלטפורמת ההדמיה על השבב חסרת הקרקע. ראשית, הסר את זכוכית הכיסוי של מערך החיישנים האופטו-אלקטרוניים באמצעות עט ואקום, הנח בעדינות מסנן ספיגה דק בחלק העליון של האזור הפעיל של הגלאי.

מקם לוחית פנים של סיבים אופטיים על גבי מסנן ספיגה זה. לאחר מכן הנח את השבב המיקרופלואידי המיוצר ישירות על גבי מערך הסיבים האופטיים. לאחר מכן, מנסרת זכוכית מורכבת מעל אינדקס השימוש בשבב המיקרופלואידי התואם שמן כך שמקדם השבירה של הממשק מותאם לאינדקס השבירה של הזכוכית.

חבר את מקורות האור לכבלי סיבים אופטיים באמצעות מחברי FC. אחד ההיבטים הקשים ביותר בהליך זה הוא יישור הרכיבים. יישר בזהירות את המרחקים בין הרכיבים, את המיקום וזווית התאורה.

לבסוף, קרב את סיב תאורת הצד למנסרה והתאם את הזווית שלו כדי להבטיח שהשתקפות פנימית כוללת תתרחש בממשק האוויר הזכוכית המתאים לשבבים המיקרופלואידיים. ניתן לדמות מצע תחתון, תאים שונים או מודלים של בעלי חיים קטנים באמצעות פלטפורמה זו על השבב, אך תאי דם לבנים יצולמו למטרות הדגמה זו. כדי לסמן את תאי הדם הלבנים בצבע פלואורסצנטי, יש לערבב תחילה כ-100 מיקרוליטר של דם מלא עם כמיליליטר אחד של תאי דם אדומים העולים לדגור למשך כשלוש דקות של טמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצנטריפוגה את תמיסת הדם השקר.

לאחר הסרת השכבה העליונה באמצעות מיקרו פיפטה, השעו מחדש את שכבת הגלולה במי מלח חוצץ פוספט כדי לתייג את חומצת הגרעין של התאים בצבע פלואורסצנטי, הוסיפו SYTO 16 לתרחיף ה-resus ולאחר מכן דגרו את הדגימה למשך כ-30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הדגימה המסומנת בתווית. הסר את השכיבה כדי להפחית את רעשי הרקע עקב פליטת פלורסנט מצבעים לא קשורים.

ריס כופף את שכבת כדורי תאי הדם הלבנים בכחמישה מיליליטר של PBS. הדגימה מוכנה כעת לטעינה בשבב המיקרופלואידי ללא עדשה בהדמיה פלואורסצנטית של שבב. לפני הדמיית תאי הדם הלבנים, יש לכייל את פלטפורמת ההדמיה באמצעות מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים.

הכן דגימת מיקרו-חרוזים מדוללת באמצעות מים נטולי יונים ותמיסת חרוזים גולמיים. באמצעות מזרק מחט חד. הזרקו את הדגימה הראשונית הזו לשבב המיקרופלואידי מהצד של קירות ה-PDMS.

לאחר הרכבת הרכיבים להשגת הדמיה פלואורסצנטית על השבב, רכוש תמונות גולמיות של חרוזי פלורסנט באמצעות ממשק תצוגת המעבדה שפותח בהתאמה אישית באמצעות מחשב. הקפד לבדוק שיש לפחות 20 תמונות חרוזים פלואורסצנטיות מבודדות על פני כל שדה הראייה. שמור את נתוני הכיול, שישמשו מאוחר יותר כדי לכייל ולחלץ את פונקציית התפשטות הנקודה של פלטפורמת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית של העדשה.

הסר את השבב המיקרופלואידי המכיל את דגימת החרוז הפלואורסצנטי ונתק את המנסרה מהשבב הזה. הזריק את דגימת תאי הדם הלבנים שהוכנה קודם לכן לשבב מיקרופלואידית אחר שאינו בשימוש מהצד של דפנות ה-PDMS. A הרכיבו את הרכיבים שוב באותם תנאי ניסוי, במיוחד בכל הנוגע למרחקים וכוח העירור.

רכוש את התמונות הגולמיות של תאי דם לבנים באמצעות תצוגת מעבדה מותאמת אישית עם אותם פרמטרי תוכנה המשמשים למיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים. נתוני הכיול ותמונות תאי הדם הלבנים הגולמיים משמשים לאחר מכן ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ב-MATLAB באמצעות עיבוד דיגיטלי. תוצאות מייצגות של הדמיה פלואורסצנטית של עדשת שדה רחב על שבב של תערובת המכילה ארבעה חלקיקים פלואורסצנטיים ירוקים של מיקרון ו-10 מיקרון מוצגות כאן למטרות השוואה, מיקרוסקופ פי 10.

מסופקות גם תמונות אובייקטיביות, המתאימות היטב לתמונות הפחות פלואורסצנטיות של העדשה המוצגות. לאחר מכן, תוצאה של עדשת שדה רחבה, הדמיה פחות פלואורסצנטית של תערובת המכילה חלקיקים פלואורסצנטיים ירוקים של 10 מיקרון ו-10 מיקרון אדום. התמונות הפחות פלואורסצנטיות של העדשה מספקות התאמה הגונה לתמונות אובייקטיביות של 10 x מיקרוסקופ של אותן דגימות.

איור זה מספק השוואת ביצועים של דגימת הדקונבולוציה של לוסי ריצ'רדסון ודגימת דחיסה המבוססת על אלגוריתמי פענוח להדמיה של זוגות חרוזים שונים של 10 מיקרון. השורה העליונה ממחישה את העדשה תמונות פלואורסצנטיות פחות גולמיות שבהן תמונות משובצות מציגות את השוואות המיקרוסקופ של אותם חלקיקים הנדרשים באמצעות עדשה אובייקטיבית פי 10. השורה האמצעית מדגימה את תוצאות הפענוח הדחיסה ואילו השורה התחתונה ממחישה את תוצאות הדקונבולוציה של לוסי ריצ'רדסון DDCS ו-DLR מתייחסים למרחקים ממרכז למרכז ותמונות מיקרוסקופ, תמונות עדשות מפוענחות CS ותמונות LR de מפותלות ללא עדשה בהתאמה.

לאחר מכן, עיבוד דיגיטלי של עדשה, תמונות גולמיות פחות פלואורסצנטיות מומחשות. אלגוריתם מבוסס דחיסה משמש להשגת רזולוציה מרחבית של פחות מארבעה מיקרון על ידי פתרון שני זוגות חרוזים בקוטר מיקרון. התוספות מציגות השוואות אובייקטיביות של 40 x מיקרוסקופ, שמסכימות היטב עם התמונות הפלואורסצנטיות המפוענחות.

כאן D מתייחס למרחקים של מרכז למרכז בתמונות מיקרוסקופ. בעוד DCS מתייחס למרחקים ממרכז למרכז בעדשה המפוענחת CS, תמונות פחות פלואורסצנטיות. איור זה מציג את התוצאות של הדמיה ללא עדשה של תאי דם לבנים המסומנים פלואורסצנטית.

התמונות הגולמיות ללא עדשות מפוענחות במהירות באמצעות מפענח מבוסס CS, שמסכים היטב עם תמונת מיקרוסקופ קונבנציונלית של אותה דגימה שנרכשת עם עדשת אובייקטיבית פי 10. בנוסף להדמיה במידת הצורך, ניתן גם לספור אוטומטית את האובייקטים הפלואורסצנטיים המפוענחים באמצעות ממשק שפותח בהתאמה אישית עבור יישומי ציטומטריה על השבב המוצג כאן הוא ממשק ספירת אובייקטים פלואורסצנטיים אוטומטי שתוכנן בהתאמה אישית ב-matlab. זה עתה הדגמנו את הנוהל למיקרוסקופיה פלואורסצנטית חסרת קרקע של תאים מסומנים ומיקרו פעימות על פני שדה ראייה של שמונה סנטימטרים מרובעים.

פלטפורמת הדמיית ספינה כזו בהשוואה עם מפענח הדחיסה המהיר מאחור. זה יהיה די משתנה עבור ציטומטריה בתפוקה גבוהה, ניתוח מיקרו נדיר ויישומי מחקר תאים אמיתיים.