Name: טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למדו שיטה לטיפוח Schistosoma mansoni במבחנה על ידי טרנספורמציה של צרקריות לשיסטוסומולות באמצעות מחט דו-צדדית. טכניקה זו מאפשרת מחקר בטוח של תולעים טפיליות ומחלת השיסטוסומיאזיס לאורך שישה שבועות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי Case Western Reserve University קרנות ההפעלה הניתן E. העליז. חלזונות אינפקטד סופקו על ידי מרכז משאבים Schistosome, NIH-NIAID (NIAID חוזה מס &#39;HHSN272201000009I). אנו מודים גם כריס המלך רונלד בלנטון תמיכה באבטחת חלזונות schistosome נגוע לדיונים מועילים.

אמצעי בטיחות: Cercariae Schistosome יכול לחדור את העור ישירות ללא לצרכים של חתך או נקבוביות, ולגרום schistosomiasis מחלה כרונית. S. mansoni הוא 2 רמת biosafety האורגניזם, ולכן מתאים ציוד מגן אישי ואמצעי בטיחות נאותה חייב להיות אחריו כאשר עובדים עם cercaria זיהומיות. רוב הציוד הדרוש לגדול ולהפוך schistosomes הוא רגיל, עם כמה יוצאים מן הכלל מפתח ציין בטבלה בסוף הפרוטוקול. כל עבודה cercarial צריך להיעשות בחדר מבודד. Schistosomules צריך להיות תרבותי ברדס סטרילי, biosafety אושרה. שתי שכבות של כפפות גומי או nitrile יש ללבוש, כמו חלוק מעבדה, זוג עמיד למים של נעליים, מכנסיים, ללא חורים או דמעות, מגיני שרוול אטום על פרק כף היד והזרועות צריכים. במקרה של דליפת מקרי, מיד לרסס שטח מזוהם עם אתנול 70% או 10% אקונומיקה, שפשוף נמרץ אם על האדם שלך. זה יהיה מספיק כדי לנטרל את הטפיל, אבל כל זיהום אפשרי צריך להיות מדווחים ברצינות. למרות schistosomules אינם מולד זיהומיות, הנחיות מוסדיים להשתנות, יש להתייעץ עם כדי לקבוע אם BSL2 אמצעי זהירות נדרשים בשלבי החיים noninfectious. לחטא את כל המשטחים אשר באים במגע עם כל חומר זיהומיות פוטנציאלי לאחר הניסוי מתבצע ולסלק פסולת במיכל Biohazard אושרה. הערה: חילזון כיסוי מארח פחי 1-2 ימים לפני שפיכת ולהגן מפני אור 1. מסיק cercariae מהמחשב המארח חילזון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס נקייה, 500ml ללא דטרגנטים מלא באמצע עם מים מזוקקים equilibrated לטמפרטורת החדר. אם עובדים עם חלזונות מארח נגוע miracidia בתאריכים שונים, השתמש כוס נפרדת עבור כל תאריך זיהום (הדבר חשוב במיוחד אם חלזונות יהיה לעשות בה שימוש חוזר עבור ניסויים בעתיד). גודל הכוס יכול גם להיות קטן בהתאם החוויה של המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף המארחים חילזון נגוע אתה רוצה לשפוך בזהירות להפקיד אותם בכוס באמצעות הדגים באקווריום סטנדרטי נטו מלקחיים למטרות כלליות לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוס מניחים על מגש לשפוך חירום כ 8-12 ס"מ מתחת למקור ליבון קל. בואו לעמוד על 1-2 שעות תחת האור. Cercariae יציאה המארח חילזון בעת ​​חשיפה לאור בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסנן חלזונות מתערובת cercariae. קח אמצעי בטיחות נוספים, כמו תערובת היא מדבקת מאוד. זכור, cercariae יכולים לחדור ישירות לעור אנושי! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תערובת תחת מקור אור למשך כ 15 דקות, מה שמאפשר לכל עניין פסולת החלקיקים להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cercariae לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי באמצעות pipet, הימנעות פסולת בתחתית הכוס. מניחים את הבקבוק על כ זווית של ° 45 על הקרח בחושך במשך 45-60 דקות, המאפשר cercariae להתיישב לפינה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet 50 מ"ל להסיר 75-90% מכלל supernatant לבין הפקדת אותה כוס אקונומיקה המכיל 10% או 70% אתנול, נזהרת שלא לתת טיפות מים המכילים לטפטף cercariae מ pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת את הבקבוק המכיל Erlenmeyer cercariae בעדינות resuspend cercariae בתמיסה. השתמש pipet להעביר את המדגם ל -50 מ"ל סטרילי צינורות חרוטי. המקום צינורות שוב על קרח למשך 20 דקות בחושך. Cercariae יישב כלפי התחתון של הצינור בחושך. </li></ol> 2. שינוי ידני של cercariae כדי schistosomules לפני שתתחיל: ודא RPMI 1640 מלאה (RPMI, 5% בסרום שור עוברית, 1X פן / סטרפטוקוקוס) וחם על 37 ° C. (זה חיוני כי בסרום שור העובר בשימוש כבר מומת על ידי דגירה של 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כמו schistosomes יכולים להיות רגישים כדי להשלים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף Biohazard, להסיר supernatant עד 5 מ"ל עד 10 מתוך פתרון בכל חרוטי 50 מ"ל באמצעות pipettor או מכשיר ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מד 22 פעמיים הסתיים, luer Lok emulsifying המחט במזרק בגודל מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לשאוב תערובת לתוך המזרק. איסוף cercariae מכל 50 צינורות מ"ל מזרק. היו קשובים שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפוך מזרק על כך שסוף מחט פנויות תלוי. צרף עוד המזרק בצד הזה של המחט emulsifying. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את התערובת דרך המחט בסך הכל 40 פעמים (20 פעמים הלוך ושוב) להפוך את cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את במאונך כגון מזרקים כי תערובת הכלול מזרק התחתונה את המזרק העליון ריק. הסר את המזרק העליון לחטא ב 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת הפקדה טיפה אחר טיפה לתוך נקי גבוה צלחת חומה 100mm x 50mm פיירקס או צלחת גיבוש. לחטא מחט המזרק אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 37 ° C 1640 RPMI התקשורת להשלים כזהתחתית הצלחת פטרי מכוסה לחלוטין, כאילו שופך צלחת מרק לוריא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות כדי לאסוף schistosomules במרכז צלחת פטרי. הימנע התזה. הערה: זה יכול להיות שימושי כדי לכבות את האור מכסה המנוע של שלב זה בצורה נכונה יותר לדמיין את schistosomules במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להפקיד schistosomules מרוכז לתוך צלחת תא טרי 12 גם בתרבות גם באמצעות טפטפת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.9 ו - 2.10 עד schistosomules אינם מציגים במרכז צלחת (כ 10 פעמים). הפקדה כל אוסף הבאים בבאר טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא כל טוב באמצע הדרך (~ 1.5 מ"ל) עם prewarmed התקשורת RPMI להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו על מיקרוסקופ הפוך לאמת את הנוכחות של schistosomules והיעדר cercariae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את schistosomules ב CO 2 באינקובטור מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. נציג תוצאות: העברת בהמתנה של schistosomules הופכת התקשורת לתרבות, ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוכה (ראו טבלה ציוד למשל) אמור להניב תמונה דומה באיור 1, שבו רק schistosomules הפך נמצאים הבאר. מזהמים פוטנציאליים יכול לכלול cercariae שלם, זנבות cercarial ניתק, או פסולת אחרת. אם לא מיקרוסקופ הפוכה זמין, מיקרוסקופ רגיל או אפילו היקף דיסקציה יהיה מספיק כדי להמחיש את schistosomules. שים לב כי נוהל זה אינו תמיד להפוך 100% cercariae. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: Schistosomulum שינו <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: Cercariae וזנבות הכרות

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעיות פוטנציאליות כמה יכול להיווצר במהלך הליך השינוי, אולם בפרוטוקול זה נועד למנוע את רוב הבעיות הללו. אחת סכנה פוטנציאלית היא סתימת המחט emulsifying, אשר בדרך כלל עולה בשל פסולת שנשאר מן קצירת בשלב 1.3. הקפידו לאפשר לכל חומר חלקיקי להתיישב צעד 1.5 ולהעביר את cercariae בזהירות בשלב 1.6 כדי למנוע בעיה זו. כמו כן, כפי שתואר קודם לכן, עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שימוש בציוד מגן אישי (גם מגן פנים) והימנעות של לחץ מוגזם על המזרקים רצוי. זנבות cercarial משפחתי ניתן דמיינו בכלי התקשורת, אשר מעיד על ההפרדה עניים במהלך שלב 2.9. זנבות התערוכה תנועה התכווצות דמויי יש צורה ברורה (ראו תרשים 2), thusly וניתן להבחין בקלות schistosomules. זנבות ניתן להסיר על ידי שטיפת schistosomules עודף של RPMI שלם המאפשר schistosomules להתיישב. זנבות יישאר צף והוא יכול להיות שאב משם. אם cercariae שלם נוכחים בתקשורת, השינוי בשלב 2.5 לא בוצעה כראוי. תמונה של cercaria שלם מתואר באיור 3b לעיון. אם בעיה זו מתרחשת, להבטיח את המחט emulsifying בשימוש הוא בגודל הנכון. כמו כן, מספר פעמים את התערובת cercarial עובר דרך המחט ניתן להגדיל, אם כי 40 פעמים הוא בדרך כלל הרבה יותר מאשר מספיק כדי להתקרב הגז 100% של זנבות cercarial. טרנספורמציה של cercaria לתוך schistosomules תוארה לראשונה על ידי קולי ו Wikel (13) בשנת 1974. מאז, הכנת schistosomules נעשה שימוש או אסטרטגיה הגז עם מחט ומזרק כמתואר בפרוטוקול זה, או באמצעות גישה vortexing ומופרד עם מילויים של percoll (14, 15) או מתערבל כפי שמודגם במאמר זה. אלה שתי טכניקות schistosomules הכנת מתוארים להפליא על ידי פרד לואיס (16) ומידע נוסף עבור culturing schistosomules נוספת של צמיחה לטווח ארוך ניתן למצוא משאבים NIAID מרכז Schistosome ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;מחט emulsifying </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-825-17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640 1X בינוני (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> עוברית שור סרום (FBS) חום מומת </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (100x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> תבשיל גיבוש (100mm) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> מטרת מלקטת כללי </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco אקווריום הנקי ארטמיה </td><td> Petco </td><td> מק&quot;ט: 1190954 </td></tr></tbody></table>

טרנספורמציה cercarial ו במבחנה טיפוח schistosoma mansoni schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

טפילים Schistosome הם סוכני סיבתי של schistosomiasis, מחלה כרונית מתישה המשפיעה על מעל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם ומדרגת השנייה מלריה בקרב מחלות טפיליות במונחים של בריאות הציבור חברתי כלכלי ההשפעה (1-4). טפילים Schistosome הם תולעים trematode עם מחזור חיים מורכב interchanging בין חיים טפילי ב המארחים molluscan ו יונקים עם התערבות חופשי שחייה שלבים. בקצרה, חופשי שחייה cercariae להדביק מארח יונקים ידי חודר את העור בעזרת פרוטאזות מופרש, במהלכן cercariae מאבדים את זנבותיהם, והופך schistosomules. Schistosomules חייב עכשיו להתחמק ממערכת החיסון המארח, לפתח בטן לעיכול של כדוריות דם אדומות, ולהעביר למרות הריאות ומחזור הדם הפורטל בדרכם ליעדם הסופי במערכת הפורטל הכבד, ובסופו של דבר הוורידים mesenteric (עבור ס mansoni) שם זכר ונקבה זוג תולעים ו להזדווג, ייצור מאות ביצים ביום. חלק מן הביצים מופרשים מהגוף לתוך מים מתוקים, שם הביצים בוקעות חופשי שחייה miracidia (50-10). Miracidia להדביק מינים חילזון ספציפיים להפוך sporocysts אם ובתה, אשר בתורו, לייצר cercariae זיהומיות, השלמת מחזור החיים. למרבה הצער, מחזור חיים שלם schistosome לא יכול להיות מתורבת במבחנה, אך cercariae זיהומיות ניתן להפוך schistosomules, ואת schistosomules יכול להיות מתורבת במשך שבועות לניתוח התפתחות schistosome במבחנה או ניתוח microarray. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור חזותי של טרנספורמציה cercarial ו culturing במבחנה של schistosomules. אנו לשפוך cercariae זיהומיות מן glabrata מארח חילזון Biomphalaria באופן ידני ולהפוך אותם schistosomules על ידי ניתוק זנבותיהם באמצעות emulsifying פעמיים הסתיים מחט. במבחנה cercarial שינוי וטכניקות schistosomules תרבות תיאר להימנע משימוש לארח יונקים, אשר מפשט להדמיה של schistosomes ומקל על אוסף של הטפיל לניתוח ניסיוני. בשינוי במבחנה טכניקות culturing של schistosomes נעשו במשך שנים (11, 12), אבל אין פרוטוקולים חזותי פותחו הזמינים הקהילה כולה.

אנו מתארים<em&gt; במבחנה</em&gt; שיטת schistosomula culturing של טפיל התולעת השטוחה<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, באמצעות קצירת וטרנספורמציה של cercariae זיהומיות של חילזון הטרי מים glabrata מארח ביניים Biomphalaria.

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

טפילים מסוג שיסטוזומה (Schistosome) הם הגורמים למחלת השיסטוזומיאזיס (schistosomiasis), מחלה כרונית מחלישה המשפיעה על למעלה מ-200 מיליון בני אדם ברחבי העולם ו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפוך CRC זיהומיים ל-shisom. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף CRC זיהומיים מהחלזון המארח. ה-CRC הזיהומיים מרוכזים ולאחר מכן מומרים ל-shisom שאינם זיהומיים באמצעות מחט דו-צדדית.לבסוף, ה-shisom מרוכזים ונאספים לתוך צלחת תרבית ומודגרים ב-RPMI בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. באמצעות שיטה זו ניתן לקבל shisom שעברו טרנספורמציה עם FU cial או זיהום של cial tail. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הליך טרנספורמציה עשוי להיות קשה ללמידה ובעל פוטנציאל להיות מסוכן.ה-Cica הם זיהומיים ובריכוז גבוה, ובידודם דורש טיפול עדין ומדויק כדי להתבצע בבטחה וביעילות. את הפרוצדורה ידגים ג'ון, עוזר מחקר במעבדתי. מלאו חצי מכלי בקר של 500 milliliter נקי במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. העבירו את החלזונות הזיהומיים אל כלי הבקר באמצעות רשת דגים סטנדרטית של אקווריום ופינצטה.הניחו את הכוס על מגש לאיסוף נשפכים, במרחק של 8 עד 12 אינץ' מתחת למקור אור להט, והשאירו אותה שם למשך שעה עד שעתיים. חשיפה לאור בהיר גורמת ל-CRC לצאת מתוך השבלול המארח. בעת הוצאת השבלולים, הקפידו לנקוט באמצעי בטיחות נוספים כדי למנוע כל מגע עם המים המדבקים, המכילים CRC שיכולים לחדור ישירות דרך עור האדם.הסיר את החלזונות, ולאחר מכן החלף את התמיסה תחת מקור אור למשך כ-15 דקות כדי לאפשר לשאריות חומרים מזהמים שקועים לשקוע לתחתית הבקבוק. לאחר שהפסולת שקעה, השתמש בפפיטה כדי להעביר את התמיסה לבקבוק ארלנמאייר נקי, תוך הימנעות מהמשקעים שבתחתית הכוס.הנח את הבקבוק על קרח בזווית של 45 מעלות. דגרו את התמיסה בחושך למשך 45 עד 60 דקות כדי לאפשר ל-CRC לשקוע בפינה אחת. לאחר שהטפילים שקעו, השתמש בפיפט של 50 milliliter כדי להסיר את רוב העלייה (snat) והשלך אותה בזהירות.בתוך כלי כימי המכיל 10%bleach או 70%ethanol, סובב בעדינות את הבקבוק המשולש (erlenmeyer flask) כדי להשעות מחדש את הטפילים. לאחר מכן, השתמש בפיפט כדי להעביר את הדגימה לשפופרות קוניות סטריליות של 50 milliliter. הנח את השפופרות על קרח והדגר אותן שוב בחושך למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-CRC לשקוע.לאחר שהטפילים שקעו, השתמשו בפיפט כדי להסיר את רוב נוזלי העל, והשאירו בין 5 ל-10 מיליליטר של נוזל בכל מבחנה. לאחר מכן, חברו למזרק מחט אמולסיה בעלת נעילה כפולה (double-ended lure lock) בכיל 22. שאבו באיטיות את התמיסה המכילה את הטפילים מכל מבחנה אל תוך המזרק.יש להקפיד על מניעת טפטוף של התערובת הזיהומית בתוך המנדף. סובב בזהירות את המזרק כך שהמחט תופנה כלפי מעלה וחבר מזרק שני לקצה החופשי של המחט. העבר את התערובת הלוך ושוב בין שני המזרקים כ-20 פעמים כדי להפוך את ה-crc.לאחר מכן, מקמו את המזרקים בצורה אנכית כך שהמזרק הריק יהיה למעלה. הסירו את המזרק העליון בזהירות וחטאו אותו ב-70%Ethanol. העבירו את הטפילים טיפה אחר טיפה לתוך כלי התגבשות נקי בעל דפנות גבוהות מ-Pyrex.לאחר מכן, חטאו את המחט והמזרק ב-70% ethanol. בשלב הבא, הניחו את הצלחת על רקע לבן כדי לסייע בויזואליזציה של הטפילים והוסיפו תמיסת RPMI המחוממת מראש ל-37 degrees Celsius, כך שתחתית צלחת הפיירקס תהיה מכוסה לחלוטין.סובבו בעדינות כדי לרכז את ה-shisom במרכז באמצעות טפטפת סטרילית. אספו חלק מה-shisom המרוכז והעבירו את הטפילים לפלטת תרבית תאים נקייה בעלת 12 בארות. חזרו על שלב שטיפה זה עד שלא יישארו עוד טפילים.לאחר העברת הטפילים, מלאו כל באר עד למחציתה ב-RPMI חם כדי לוודא את נוכחותם של ה-shisom. הדמינו את הפלטה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך. בשלב זה, מרבית הטפילים אמורים היו להפוך ל-shisom, אותם ניתן להבדיל מ-CRC E מכיוון שהם פחות מודאליים וחסרים את הזנב ה-cial האופייני.מספר קטן של תאי CRC שלמים או שרידי תאי CRC קטועים או פסולת אחרת עשויים להיות נוכחים גם הם. לאחר מכן ניתן לגדל ולתחזק את ה-Shta באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך עד שש שבועות, עם החלפות מדיה שבועיות. זכרו כי עבודה עם חיידקים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שכבות כפולות של כפפות ומגני שרוול, ושימוש נכון במתקנים ובמכבצת ביולוגית (biohazard hood) בעת ביצוע הליך זה.

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

סוכן Trypanosoma cruzi Chagas המחלה מייצרת לטווח ארוך ללא תסמינים זיהומים בפתאומיות להתפתח פתולוגיה רפואית מוכרת. פרוטוקול המחקר הבאים מתאר הקצר על בסיס משפחתי אפידמיולוגיים מחקר כדי לפענח את הזיהום טי cruzi מחלות מהאב את רומא.

העברה מינית של Trypanosomes האמריקאי של זכרים ונקבות כדי החברים נאיבי

כאן, סיפקנו שיטה כדי להשיג שינוי יציב של העוף Eimeria טפילים על-ידי נוקלאונופיטים sporozoites או הדור השני merozoites. טפילים מהונדסים גנטית שונה ביטוי הטרוולוגי הגנים ניתן להשתמש ככלי משלוח החיסון.

נוקלאופלוט ובהפצת Vivo של העופות האימריריה טפילים

חקירות מפורטות על שלבי יתושים של טפילי מלריה הם קריטיים לתכנון אסטרטגיות חסימת שידור יעילות. פרוטוקול זה מדגים כיצד לתרבות ביעילות gametocytes זיהומיות ולאחר מכן להאכיל את המשחקים האלה יתושים כדי ליצור שלבי יתושים של P. falciparum.

פלסמודיום פאלציפארום תרבות המשחק וזיהום יתושים באמצעות האכלה מלאכותית של ממברנה

אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

במאמר זה נתאר את המתודולוגיה ששימשה ליצירת הזנים L. panamensis ו-L . donovani המבטאים את הגן ל-eGFP כטרנסגן משולב יציב באמצעות מערכת pLEXSY. טפילים נגועים שובטו על ידי הגבלת דילול, ושיבוטים בעלי עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר בשני המינים נבחרו לשימוש נוסף בבדיקות סינון תרופות.

התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

מלריה מועברת באמצעות חיסון של שלב sporozoite של פלסמודיום על ידי יתושים נגועים. פלסמודיום מהונדס איפשר לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המלריה ותרם ישירות למאמצי פיתוח החיסון למלריה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה ליצירת פלסמודיום ברגהיי sporozoites מהונדס.

יצירת פלסמודיום מהונדס גנטית ברגהיי ספורוזואיטים

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

למדו שיטה לטיפוח Schistosoma mansoni במבחנה על ידי טרנספורמציה של צרקריות לשיסטוסומולות באמצעות מחט דו-צדדית. טכניקה זו מאפשרת מחקר בטוח של תולעים טפיליות ומחלת השיסטוסומיאזיס לאורך שישה שבועות.

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

גלה סרטונים נוספים