בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולתרבית תאי גזע ראשוניים של פסגה עצבית, או N CSCs מרקמות קרקפת אנושיות. זה מושג על ידי קילול עור הקרקפת האנושי לרצועות ברוחב סנטימטר אחד ודגירה במדיה המכילה מפרצי דיס. לאחר מכן העור מסודר במדיה הטרייה וזקיקי השיער נסתמים.

השלב השני של ההליך הוא טיפול בזקיקי השיער באמצעות טריפסין ומתקבלים מתלים של תאים בודדים. השלב האחרון של ההליך הוא מיון CD 2 71 HNK ncsc חיובי כפול אחד באמצעות ציטומטריית זרימה וצלחת בלוחות תרבית. בסופו של דבר מיקרוסקופ ניגוד פאזה משמש לחקר היווצרות וצמיחה של כדורי נוירוס, כאשר הדגמה של שיטות אלה היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את השלבים האנכיים של חילוץ ובידוד הבריאות מכיוון שקשה מאוד לנתח את העור וחלקיקי הבריאות במיקרוסקופ.

כדי להתכונן לתרבית תאי גזע, מצפים את החלק התחתון של כל באר של צלחת שש בארות בפולי דה ליצין ומאפשרים לצלחות להתייבש במכסה המנוע. לאחר שהבארות יבשות, יש לשטוף במים סטריליים ולשאוף, ואז לאפשר לבארות להתייבש שוב. מצפים את הצלחות בתמיסה של 0.17 מיליגרם למיליליטר של פיברונקטין.

לאחר מכן, לפני שהפיברונקטין מתייבש בצלחת במדיום תרבית NCSC, הכינו והכינו את המדיה והריאגנטים הבאים. 97% D-M-E-M-F 12 2%B 27 תוסף 1% ושני תוספים B-F-G-F-E-G-F IGF אחד ודיס. אסוף עור קרקפת אנושי בוגר טרי מהליכי מתיחת פנים או רקמת קרקפת עוברית ושטוף אותו עם PBS המכיל סטרפטומיצין פניצילין.

מעבירים את העור לצינורות של 50 מיליליטר ומודגרים ב-DMEM עם 10 מיליגרם למיליליטר שטח DIS ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את העור לצלחת פטרי מעוקרת והסירו את השערות מהעור על ידי אחיזה בפיר השערה ליד פני העור ומשיכה חזקה וחלקה. זקיקי השיער יראו מורפולוגיה של אנטיגן אורגן, ידגרו את שברי הזקיקים המבודדים ב-0.05% נסיעות ב-EDTA למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול מדי פעם.

לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר DMEM עם 10% FBS כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, העבירו את האפיתל הזקיקי דרך מסנן של 40 מיקרון כדי לקבל תרחיף תא בודד המכיל תאים בגודל וצורה שונים. ואז סובב את המתלה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות.

השליכו בזהירות את הסופרנטנט S והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS עם 2% FBS כדי לבודד N CSCs באמצעות עובדות תחילה, סמנו את התאים עם נוגדנים כנגד CD מצומד CD 2 71 FE C מצומד hnk אחד או CD 2 71 PE מצומד אלפא ארבע אינטגרין על ידי דגירה על קרח במשך 40 דקות בצנטריפוגה החשוכה ב-200 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ושאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-PBS המכילים 2% FBS ושני מיקרוגרם למיליליטר. Propidium iodide כדי להוציא את התאים המתים.

בצע מיון תאים על ידי זרימה ציטומטרית ואסוף CD 2 71 H ו-K אחד כפול חיובי או CD 2 71 אלפא ארבע אינטגרין תרבית תאים חיוביים כפולים. התאים בלוחות הצמדה נמוכים במיוחד במדיום NCSC, משנים את המדיום פעם ביום. בדוק את תרבית התאים כל יום במיקרוסקופ.

NCSC יתחיל ליצור אגרגטים קטנים צפים לאחר מספר ימים וכדורים מעוצבים היטב תוך שבועיים עד חמישה שבועות בתרבית, תלוי בגיל התורמים. צמיחה תופיע בעוד מספר ימים באזור הבליטה וכדורים מעוצבים היטב באתרם בעוד מספר שבועות כאשר זקיקי שיער שלמים מתורבתים במדיום NCSC. כדי להרחיב את תרביות NCSC, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS מחמם פעמיים ב-EDTA ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הוסיפו אותו לתאים למשך שבע עד 15 דקות כדי שתא הגזע של זקיק הברד יתנתק. כדי לעצור את הטריפסין ADD DMEM עם 10% FBS יש לזרוק בעדינות למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים. ואז סובב ב -200 פעמים G למשך חמש דקות.

יש להשעות מחדש את התאים במדיום NCSC ובתרבית ובלוחות מצופים פיברונקטין ב-37 מעלות צלזיוס. תרבות NCSC. מדיום מספיק כדי לשמור על NCSC אנושי במצב לא מובחן.

ללא צורך בתאי הזנה, קרטינוציטים לא יתרבו וימותו בהדרגה במדיום. כמה תאים עגולים קטנים יתרבו ויצרו אגרגטים קטנים בתרחיף. לאחר שלושה עד חמישה ימים, אגרגטים צפים אלה גדלים לאט לאט ויוצרים מבנים דמויי כדור תלת מימדיים, הנקראים כדורי שיער.

כאשר לוחות מקודדים מתורבתים, ה-N CSCs נצמדים לפני השטח וגדלים מהר יותר מאשר תאים יוצרי כדור בתרחיף, הן תאי גזע היוצרים כדור והן תאי גזע מחוברים. סמני NCSC מבטאים כאשר זקיקי שיער שלמים הם מתורבתים, נוצרים כדורים באזור המתאים לאזור הבליטה. לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתרבות.

תאי גזע נוירולוגיים ראשוניים מרקמות קרקפת הרמה.