Name: הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: חקור הדבקה של לויקוציטים לאנדותל בכלי דם תפוקים תחת לחץ תוך-לומינלי משתנה. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת באמצעות דם שלם ותורמת להבנת מנגנוני דלקת ויתר לחץ דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS, הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי מענקים אוסטרליה תוכנית הפרויקט (JPF הסנטר טלק) וכן מלגה לתואר שני (ד מישל).

1. בידוד עורקי הראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Euthanase10 בן שבוע ספראג Dawley חולדות דרך ה-CO 2 / O 2 מחנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו עורקי התרדמה על ימין ועל שמאל משותפת עם אבי העורקים והלב הבטחת מתיחה מינימלי של הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב חיץ קרח קרבס קר להפריד את עורקי הראש של אבי העורקים והלב ולבצע דיסקציה קרוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כלי מבודד קרבס על הקרח לפני הרכבה. </li></ol> כ. זמן = 45 דקות 2. תחול הקאמרית כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב המחברים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של החיץ קאמרית כלי קרבס סומק שמרו ב-pH הפיזיולוגי על ידי יציקת גז carbogen (95% O 2, 5% CO 2) דרך למאגר ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא צינורות cannulas סמוקות לגמרי מיושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש חיץ Kreb דרך P1 (פרוקסימלי) ו P2 (דיסטלי) מתמרים. הברזים סגור כדי להבטיח שאין בועות אוויר מתמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מתמרים למחברים המתאימים ושוב סומק יותר חיץ קרבס הבטחת אין בועות אוויר. סגור את הברזים לחדר. </li></ol> כ. זמן = 15 דקות 3. Pressurizing הקאמרית כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ציוד הלחץ: הלחץ סרוו, לפקח על לחץ, משאבת peristaltic (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המשאבה peristaltic על הלחץ סרוו הלחץ על חיץ אוטומטי קרבס לרוץ דרך צינורות ב 20 מ"מ כספית (חיוג ב 1), הבטחת אין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות כדי מתמר P2 סגור. הלחץ יהיה יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ברז P2 לתא כלי לשטוף את כל הבועות ואז לסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את האמבט עם קרבס חיץ (5-7 מ"ל). </li></ol> כ. זמן = 10 דקות 4. הרכבה כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לנתח תחת מיקרוסקופ קשרים פוליאסטר שחור על גבי כל צינורית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר cannulas ובעלי צינורית בנפרד הר ¼ כלי (סוף קשת אבי העורקים) על גבי הצינורית P1. ודא שלא לקרוע את כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק מלא קרבס חיץ בעדינות סומק עודף דם מתוך כלי השיט באמצעות מתמר P1. סגור את P1 לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי מאובטחת על צינורית P1 עם העניבה פוליאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר cannulas / מחזיקי הצינורית יותר להרכבה על צינורית P2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף הר דיסטלי של כלי השיט (~ ¼ אורך) על הצינורית הדיסטלית. מאובטח עם עניבה פוליאסטר. </li></ol> כ. זמן = 20 דקות 5. Pressurizing כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מחזיקי הצינורית כדי להבטיח שאין לכופף או למתוח את הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם P1 ו-P2 סגור לחדר להחליף את שרת הלחץ אוטומטית ידנית. בדוק את הלחץ על סרוו אין ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש, דליפת מתרחש ואת הקשרים מתמרים צריך להיות מאובטח במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את סרוו הלחץ חזרה P2 לפתוח אז אוטומטית לתא. תחת המיקרוסקופ לצפות כלי להתרחב כאשר הברז נפתח לחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את סרוו לחץ ידני. שוב לבדוק ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש נזילה אז המערכת לא לחץ חזק שם צפוי להיות חור הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בחזרה ל P1 לפתוח אוטומטית לתא. על הגדרה ידנית לבדוק שהלחץ נשאר יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין דליפה, על הגדרת חיוג ידני להגדיל ל 2 (40 מ"מ כספית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אוטומטית ולבחון את כלי מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, להתאים את בעל צינורית כדי להבטיח שום עיקול vessel.Check על הדלפות על הגדרה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.6-5.7 הגדלת חיוג ל 3 (60 מ"מ כספית), 4 (80 מ"מ כספית) וכך הלאה, עד הלחץ הרצוי הוא הגיע. </li></ol> כ. זמן = 15-30 דקות 6. דוגרים כלי בלחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקר הטמפרטורה מוגדר 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שני peristaltic משאבת perfuse קרבס חיץ (1 mL / min) לאמבטיה קאמרית כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר aspirator לתא להבטיח רק את השכבה העליונה של האמבט מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי בלחץ על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם הלחץ מוגדר אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הלחץ לא דולף (מעבר ידני) מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות שונות ניתן לראות פשוט על ידי הוספת תרכובת לאמבטיה במהלך הדגירה. </li></ol> כ. זמן = 1 שעה 7. המרוססת כלי בלחץ דם שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה להשיג לפחות 7.5 מ"ל דם כל אדם / כלי שנאספו הפרין U 40 / מ"ל ​​דם. דגירה של 50 מ"ל בז ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני תום tהוא תווית הדגירה דם עם VybrantDil (1:1000) במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לאסוף דם מזרק ניקוי כל הבועות ולצרף על משאבת מזרק עם ז'קט חום נקבע על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מתמר P1 לחדר / כלי ולהתחבר מזרק צינורות פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר דם μL 1000 / min דרך צינורות הפסולת כדי להסיר כל הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח P1 לחדר. סרוו לחץ תתאים באופן אוטומטי כדי לשמור על הלחץ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse דם μL 100 / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצמידים להקליט מצלמה דיגיטלית שני שדות של כלי perfused למשך 15 שניות ב 1, 3, 5, 7.5 ו - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף הודעה תקינות תפקוד האנדותל ניתן להעריך באמצעות שיטות פרמקולוגיים כגון myograph ו מולקולה ביטוי הדבקה ניתן לקבוע באמצעות אימונוהיסטוכימיה להמשיך לאמת את התגובה הדלקתית. </li></ol> כ. זמן = 15 דקות 8. נציג תוצאות: תרשים סכמטי של תא הלחץ ההתקנה מוצג באיור 1. עם מצלמה דיגיטלית מצמידים את תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן דמיינו מיידי באמצעות הקלטות וידאו חי. נציג תמונות וידאו נראים באיור 3 שבו leukocytes נחשבים חסיד אל האנדותל אם יישארו נייחים במשך 10 שניות. עם הקלטות וידאו על תאים לולאה רציפה דבק ניתן לספור כשדה הממוצעת. אמנם הן נמוכות (איור 3A) גבוה (איור 3 ב) הלחץ יגרום מידה מסוימת של הידבקות עלייה משמעותית הידבקות ליקוציט בלחץ גבוה intraluminal נתפסת וזה הוכיח גם כמותית (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Pressurised כלי לשעבר vivo סכמטית קאמרית. כלי cannulated מחובר מתמר (P1) הפרוקסימלית ו דיסטלי (P2) מתמרים המאפשרת את לחץ הדם כדי לטפל בתוך הכלי. זלוף היא באמצעות מתמר P1 והלחץ נשמר באמצעות מתמר P2. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Cannuala עם קשרים. הקשרים פוליאסטר שחור מחוברים צינורית כל אחד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תמונות וידאו נציג. הידבקות התא דינמי (חץ אדום) תחת הקרינה ב 80 מ"מ כספית (א) ו - 120 מ"מ כספית (ב) לאחר 10 דקות של טפטוף. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הדבקה ליקוציט ב ספראג Dawley הראש העורקים לאחר דגירה 1 שעה בשפל (80 מ"מ כספית) ו בלחץ גבוה (120 מ"מ כספית). *** P &lt;0.001, נותחו על ידי 2-way ANOVA אמצעים חזר באמצעות מבחן Bonferroni פוסט הוק.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.</li>
<li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li>
<li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
<li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ההסתדרות הרפואית אלפרד מחקר וחינוך בעלי התחנה ועדת האתיקה ובית החולים אלפרד ועדת האתיקה.

זוהי שיטה שונה ללמוד הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי הדם ללא פגע מבודד בתנאים בלחץ בזמן אמת. זלוף של החדר כלי לבד מאפשר אימות מהירה של הפרו דלקתי זנים של עכברים גדולים וכלי חולדה. מניפולציה הפעלת הלחץ מאפשר אינטראקציות תא דינמי לצפות נמוך מ ללחצים intraluminal גבוהה מאוד, ולכן עדיף לחקות-ing פיזיולוגיים תנאי pathophysiological. קוטר כלי ניתן למדוד באמצעות תוכנית מספיק תאים הדמיה תזרים גזירה ולכן וקצב ניתן לקבוע מניפולציות לכן. עם יכולות myograph שלה, התערבות פרמקולוגית להציב באמבטיה להוסיף מימד נוסף של תנאי הניסוי אפשרי עם המודל הזה מאפשר מחקרים של מסלולים מכניסטית איתות. בעוד שימור האנדותל לא ניתן לאשר במהלך מניפולציה לחץ, התגובות ACH ו-PE יכול להתנהל זלוף הודעה 9. יצויין כי התקנה זו ממחישה את ההשפעות של הלחץ intraluminal על התא אל התא אינטראקציות לא את ההשפעות של זרימת הדם הסיסטולי pulsatile ולא לחצים או הדיאסטולי. יתר על כן, בעוד שינויים בלחץ חריפה על הידבקות ליקוציט נצפו, ההתקנה זה יכול להיות מנוצל גם להסתכל על ההשפעות לחץ כרוני (כלומר הגדלת פעמים הדגירה באמצעות מודל כרוני בבעלי חיים בלחץ). ספראג העורקים Dawley הראש הנפוצים הם הפגינו להגדיר זאת אך זנים ומינים אחרים ניתן להשתמש עם התאמות מתאימות לגודל צינורית. ואכן, חשוב לציין כי גיל ומשקל של החיות להשפיע על גודל הספינה ובכך להגדיר את זה למעלה צריך להיות אינדיבידואלי עבור כל ספינה. דיסקציה סגור וזהיר של הרקמה החיבורית יכול לשפר להדמיה של לויקוציטים מאוד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> סטריאו דיסקברי V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 מזרק משאבה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית ואת הבקר </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת תאורה פלואורסצנטי </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> כלי הקאמרית </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> סרוו לחץ בקר ומשאבה peristaltic </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> נ.ב. - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Monitor זלוף </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x מתמר לחץ </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> בקר טמפרטורה </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltic משאבה </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil התא תיוג פתרון </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> השתמש 1:1000 </td></tr></tbody></table>

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה intraluminal

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

יתר לחץ דם ברחבי העולם, היא דיווחה כי ברבעון כ האוכלוסייה הוא הגורם המוביל ביו הסיכון עבור תמותה ברחבי העולם. ב יתר לחץ דם בכלי הדם קשורה בתפקוד האנדותל דלקת מוגברת המובילה טרשת עורקים מדינות מחלה שונים, כגון מחלת כליות כרונית 2, 3 שבץ ואי ספיקת לב 4. הצעד הראשוני דלקת בכלי הדם המובילים atherogenesis הוא מפל הידבקות שכרוך מתגלגל, קשירה, הדבקות ואת גלגול מאוחר של לויקוציטים דרך האנדותל. גיוס הצטברות של לויקוציטים כדי האנדותל הוא מתווך על ידי הגברת הביטוי של מולקולות הדבקה כגון הידבקות התא וסקולרית מולקולה-1 (VCAM-1), הדבקה תא תאיים מולקולה-1 (ICAM-1) ו-E-selectin וכן עליות ציטוקינים ו chemokine לשחרר upregulation של מינים החמצן מגיב 5. In vitro שיטות כגון מבחני הידבקות סטטי לעזור לקבוע מנגנונים מעורבים התא אל התא הדבקה כמו גם ניתוח של מולקולות הידבקות התא. שיטות המועסקים הקודם במבחנה הראו עליות חדות הלחץ על האנדותל יכול להוביל הידבקות מונוציטים, upregulation של מולקולות הדבקה ו סמנים דלקתיים 6 עם זאת, דומה הרבה מבחני חוץ גופית, ממצאים אלה לא בוצעו בזמן אמת בתנאים זרימה פיזיולוגיות, וגם עם דם כולו. לכן, מבחני vivo מנוצלים ויותר במודלים של בעלי חיים כדי להדגים דלקת בכלי הדם והתפתחות פלאק. מיקרוסקופיה Intravital כיום בשימוש נרחב על מנת להעריך הידבקות לויקוציטים, הגירה מתגלגל, גלגול 7-9. כאשר המשלב את ההשפעות של הלחץ על ליקוציט הידבקות אנדותל במחקרים vivo הן נרחבות. מחקר אחד כזה בוחן את ההשפעות בזמן אמת של זרימה גזירה על צמיחת עורקים סמנים דלקתיים שיפוץ אך הוערכו רק באמצעות אימונוהיסטוכימיה 10. כאן אנו מציגים מודל הקלטה הידבקות ליקוציט בזמן אמת ללא פגע כלי דם בלחץ הדם באמצעות זלוף כולו. המתודולוגיה היא שינוי של מודל קאמרית לשעבר vivo זלוף 9 כלי המאפשר ניתוח בזמן אמת של לויקוציטים-אנדותל האינטראקציות דבק בכלי ללא פגע. שינוי שלנו מאפשר מניפולציה של הלחץ intraluminal עד 200 מ&quot;מ כספית ומאפשר ללמוד לא רק בתנאים זרימה פיזיולוגיות אלא גם בתנאי לחץ. בעוד myography מערכות הלחץ הוכחו בעבר לצפות קיר לומן כלי בקוטר 11 כמו גם התכווצות כלי זה הוא הפעם הראשונה הוכחת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות בזמן אמת. כאן אנו להדגים את הטכניקה באמצעות עורקי הראש שנקטפו מן חולדות cannulated לתא מחוייט זרימה מצמידים את מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החדר כלי מצויד coverglass תחתית גדול המאפשר עדשה בקוטר גדול אובייקטיבי עם מרחק עבודה קצר לתמונה כלי. יתר על כן, אגוניסט נבחרים ו / או היריבים יכול להיות מנוצל כדי להמשיך לחקור את מנגנוני השליטה הידבקות התא. היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופיה intravital כוללים שום מעורבות של ניתוח פולשני ולכן התפוקה גבוהה יותר ניתן להשיג. שיטה זו גם מאפשרת את השימוש של טיפול מעכב מקומי לכלי הרצוי ואילו intravital רק מאפשר טיפול מעכב מערכתי.

זוהי שיטה לדמיין הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי בלחץ שנקטפו. הטכניקה מאפשרת ללמוד הידבקות כלי דם תחת זרם גזירה עם לחצים שונים intraluminal עד 200 מ&quot;מ כספית ובכך לחקות-ing התנאים pathophysiological של לחץ דם גבוה.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

דיווחים מצביעים על כך שברחבי העולם, יתר לחץ דם שכיח בכשעה רבע מהאוכלוסייה, והוא גורם הסיכון הביו-רפואי המוביל לתמותה בעולם. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדמיות של היצמדות לוקוציטים לאנדותל בכלי דם דחוסים שנסגרו. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד עורק תגיר מחולדה או מעכבר. לאחר מכן, כלי הדם מורכב על תא לחיץ.לאחר מכן, הכלי מועמד תחת לחץ ומודגש במשך שעה אחת בלחץ הרצוי. לבסוף, דם שלם מסומן מזורם דרך הכלי הממוערך. באופן זה, ניתן לקבל תוצאות המראות היצמדות של לוקוציטים לאנדותל בזמן אמת, באמצעות תא כלי דם ex vivo מותאם אישית, המחובר למשאבה סרוו ולמיקרוסקופ פלואורסצנטי.היתרון המרכزي של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות היצמדות סטטיות, הוא שניתן לצפות בהיצמדות של לוקוציטים בעורקים תפקודיים שלמים באמצעות דם מלא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר שליתר ערקים (hypertension), כגון השפעת לחץ תוך-לומנלי גבוה על דלקת, וכיצד היא עשויה לתרום לאתרוסקלרוזיס. לאחר בידוד עורקים קרטיד מנשפני חולדות מסוג spread dolly בני 10 שבועות, והכנה והלחצון של תא הפרופוזיה, קבעו את כלי הדם תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי הצבת רצועות פוליאסטר שחורות על כל קנולה, העבירו את כלי הדם לאמבט, ולאחר מכן קבעו רבע מהכלי על קנולה P1.היזהרו לא לקרוע את כלי הדם בעת שימוש במזרק מלא במאפר Krebs. שטפו בעדינות דם עודף מתוך כלי הדם דרך התחסן P one. סגרו את P one אל התא.בעזרת קשירת פוליאסטר, הדקו את הכלי לדקני ה-P one. קרבו את הדקניים ואת מחזיקי הדקנים לצורך ההרכבה על דקני ה-P two. הרכיבו את הרבע הדיסטלי של קצה הכלי על דקני ה-P two.אבטחו זאת באמצעות רצועת פוליאסטר כדי להתחיל להפעיל לחץ על הכלי. כווןו את מחזיקי הקנולות כדי להבטיח שאין כיפוף או מתיחה של הכלי כאשר P one ו-P two סגורים כלפי התא. העבירו את ਸਰבו הלחץ ממצב אוטומטי למצב ידני.בדוק את משרת הלחץ (pressure servo) כדי לוודא שלא חלה ירידה בלחץ בתוך 10 שניות. ירידה בלחץ מעידה על קיום דליפה, ובמקרה זה יש להדק את החיבורים ואת המתמר כדי להבטיח שהם אטומים ללחץ. החזר את משרת הלחץ למצב אוטומטי, לאחר מכן פתח את P שתיים אל התא שמתחת למיקרוסקופ, וצפה בהתרחבות כלי הדם.כאשר הברז פתוח אל התא. העבירו את שרת הלחץ (pressure servo) למצב ידני. בדקו שוב אם קיימות ירידות בלחץ.אם ירידת הלחץ נמשכת, הדבר מעיד כי המערכת אינה אטומה ללחץ וסביר שקיים חור בכלי. העבירו חזרה למצב אוטומטי ופתחו את P one אל התא. בהגדרה הידנית, בדקו שהלחץ נותר יציב.אם המצב יציב, הגבירו את החיוג לשניים, פעולה המגבירה את הלחץ בכלי ל-40 millimeters of mercury. עברו למצב אוטומטי וצפו בכלי תחת המיקרוסקופ. במידת הצורך, כווןנו את מחזיק הקנולה כדי להבטיח שאין כיפוף בכלי בהגדרת הידני.בדקו את הדליפות. לאחר מכן, הגבירו את החיוג במרווחים של אחת, תוך מעבר למצב אוטומטי בין לבין, כדי להשגיח על הכלי תחת המיקרוסקופ עד להגעה ללחץ הרצוי. עם הגעה ללחץ הרצוי, העבירו את התא למיקרוסקופ הסטריאו.חברו את בקר הטמפרטורה המכוון ל-37 °C. לאחר מכן, חברו את משאבת הפריסטלטיקה ואת השואב כדי לשמור על רעננותו של בופר קרבס (Krebs buffer) באמבט. דגרו את כלי הלחץ בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.בדוק דליפות באופן תקופתי. סמן 7.5 milliliters של דם שלם שנאסף ב-preco עם vibrant dye בחושך. לאחר מכן, דגור למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius.אסוף את הדם למזרק, הסר בועות אוויר וחבר אותו למשאבת מזרקים בעלת מעטפת חימום המכוונת ל-37 °C. סגור את המתמר P one אל התא וחבר את המזרק ואת צינור הפסולת. נקה את הדם בקצב של 1000 µL לדקה דרך צינור הפסולת כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן פתח את P one אל התא.סרוו הלחץ יכוון את עצמו באופן אוטומטי כדי לשמור על הלחץ הרצוי; בצעו פרפוזיה של הדם בקצב של 100 microliters per minute באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית, והקליטו שני שדות של הכלי שעבר פרפוזיה למשך 15 שניות במספר נקודות זמן. תמונות מייצגות של לוקוציטים מוצגות כאן, כאשר לוקוציטים נחשבים כנדבקים לאנדותל אם הם נשארים נייחים למשך 10 שניות. באמצעות הקלטות וידאו בלולאה רציפה, ניתן לספור תאים כממוצע לכל שדה, כאשר הן לחץ נמוך והן לחץ גבוה יגרמו לרמה מסוימת של הידבקות.נצפתה עלייה משמעותית בהיצמדות לוקוציטים בלחץ תו-לומי גבוה יותר. הדבר מוצג באופן כמותי בגרף זה, שבו מספר רב יותר של תאים לשדה נצמדים בלחץ של 120 לעומת 80 millimeters of mercury. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון PCR ואימונוהיסטוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון ביטוי גנים וחלבונים של מולקולות היצמדות.

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת זרימה למינרית כדי לאפיין את האינטראקציה של לויקוציטים ושותפים תאיים כגון תאי אנדותל. שיטה זו מספקת תובנות דינמיות על הידבקות, deadhesion, ו transmigration של לויקוציטים כאשר מחוררים על שכבה שלמה ו confluent של תאים וסקולריים.

בדיקה מבוססת זרימה למינרית לחקר האינטראקציות בין לויקוציטים ותאי אנדותל

גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר להעריך דינמיקת גיוס לויקוציטים לשעבר vivo על ידי חיבור קאמרי מצופים במולקולות דבקות-נגזר האנדותל למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים שכן הוא מאפשר להערכה לויקוציטים בתנאים ביולוגיים יחסי.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב Ex Vivo Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב המודד מונוציט subpopulation סחר תחת זרימה במבחנה באמצעות סמני פני שטח מסוים, מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את השלבים רציפים גיוס גם לגבי פרופיל אחרים יחוברו ליקוציט באמצעות סמנים אחרים משטח מסוים.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי, ניתוח נתונים להערכה של תגובות דלקתיות ב hiPSC-ECs וניתוח של אדהזיה ליקוציט תחת זרימה פיזיולוגיים.

Microfluidic Assay עבור הערכה של ליקוציט הדבקה על נגזר אנושיים לתאי גזע Pluripotent המושרה בתאי אנדותל (hiPSC-ECs)

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

חקור הדבקה של לויקוציטים לאנדותל בכלי דם תפוקים תחת לחץ תוך-לומינלי משתנה. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת באמצעות דם שלם ותורמת להבנת מנגנוני דלקת ויתר לחץ דם.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

גלה סרטונים נוספים