יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ספיגת החיידקים על ידי תאי M הממוקמים בתוך מערכת החיסון של רירית המעי. השלב הראשון בהליך זה הוא לחשוף ולקשור את כתמי מדורות המעי של עכבר מורדם. לאחר מכן מוזרקים חיידקים פלואורסצנטיים לאזור הקשירה.

שעה לאחר מכן, טלאי המדורות נכרתים. לאחר מכן התאים ברקמה מחלחלים ונצבעים עבור סמן תאי M, GP שתיים. לבסוף, הדגימות נצפות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וניתן לדמיין חיידקים העוברים טרנסציטוזיס על ידי תאי M.

בנוסף לספק תובנה לגבי הבסיס המולקולרי של הטרנסציטוזיס החיידקי על ידי תאי m, ניתן להחיל פיטורין על מערכות אחרות. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסייע לחדירות התאים ובמעי ממוסגר באמצעות כלור וחיידקים באמצעות מפזר זכוכית סטרילי פס את החיידקים הפלואורסצנטיים על צלחת מקדחה LB ודגירה על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עד שמושבות בודדות נראות לעין. בחר מושבה בודדת מהמקדחה המוצקה וחסן אותה לשני מיליליטר של מדיה LB טרייה.

לאחר מכן תרבית את החיידקים על שייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שתרבית המתנע גדלה, העבירו 500 מיקרוליטר של חיידקים ל-4.5 מיליליטר של מדיום LB ודגרו על תרבית חדשה זו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות או עד שהצפיפות האופטית שלה ב-600 ננומטר מגיעה לאחת המצביעה על כך שגידול החיידקים נמצא בשלב לוג. בשלב זה, צנטריפוגה את התרבית ב-3000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקצור את החיידקים לאחר צנטריפוגה, להשליך את החטיפה ולשטוף את הגלולה בחמישה מיליליטר PBS סטרילי לאחר חזרה על שלב הכביסה Resus השעו את החיידקים בחמישה מיליליטר PBS.

לאחר הנחת העכבר תחת הרדמה רציפה של פלואור השתמש בכלים סטריליים כדי לפתוח את בטן העכבר באופן אספטי. התחל בחשיפת המעי הדק ואתר את המדבקות של ה-PI. לאחר שנמצאו מדבקות של PI, השתמש בחוט תפירה סטרילי כדי לקשור את המעי כחמישה מילימטרים לצד אחד של המדבקה.

הקפד להימנע מניתוק כלי דם במהלך ההליך. לאחר קשירת המעי, השתמש במזרק כדי להזריק 50 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים כ-10 לשבעת ה-CFU לתוך לולאת תיקון האש הקשורה בצד הרופף של המעי. לאחר מכן השתמש בחוט כדי לקשור את הצד השני של המעי.

סגור את בטן העכבר עם קליפס והשאר את העכבר תחת הרדמה למשך שעה לפני המתת חסד. כדי לקצור את כתם המדורות, כרתו בזהירות את כתם המדורות. לאחר מכן שטפו במרץ PBS דרך החלק שנקטף של המעי מספר פעמים כדי לשטוף את הצד האפיקלי של המדבקה של PI ולהסיר עודפי נוזל רירי וחיידקים.

לאחר שטיפת המדבקה של ה-PI, הנח אותה בבאר של צלחת של 24 בארות והוסף אפקטים של ציטו או תמיסת ציטו פרם. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה. לאחר תיקון מדבקת ה-P'S, יש להשרות אותה במיליליטר אחד של מאגר שטיפת סלסול למשך חמש דקות.

חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים. לאחר מכן הניחו את הדגימה במיליליטר אחד של מאגר חוסם ודגרו אותה על קרח למשך 30 דקות. לאחר שלב החסימה, הוסף נוגדן חד שבטי נגד עכבר GP שני לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר ודגר את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לצבוע את תאי M.

לאחר מכן, שטפו את הדגימה כמו קודם. הוסף רצפה משנית לנוגדנים מצומדים ודגר את הדגימה על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר שהדגימה מוכתמת, שטפו את הדגימה בעדינות ב-PBS.

לאחר מכן הניחו שלוש או ארבע חתיכות של זכוכית כיסוי עגולה על שקופית והטמיעו את תיקון הפירס ב-200 מיקרוליטר של תמיסת גליצרול של 30% ב-PBS. בשקופית, השתמש במיקרוסקופ לייזר DM IRE שני קונפוקליים, או במיקרוסקופ דה-קונבולוציה לשחזור ראייה של דלתא כדי לצפות בדגימה. בתמונה זו, ניתן לראות GFP ירוק שכותרתו סלמונלה טיפימוריום מוקף ב-GP 2 המוצג באדום על קרום הפלזמה האפיקלי.

בתמונה מסובבת זו, חיידקים נראים בתוך השלפוחיות הציטופלזמיות התת-אפיקליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך טרנסציטוזיס חיידקי על ידי תאי M באמצעות מעיים קשורים.