Name: יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: חקור ספיגת חיידקים על ידי תאי M בכרסת עכבר באמצעות שיטת לולאת מעי קשורה. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של טרנסציטוזיס חיידקי בתאי M, ומספקת כלי לחקר מנגנוני החיסון הרירי במעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לכל חברי EIB לפיתוח טכניקה זו. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק סיוע-in-למחקר מדעי על אזורי עדיפות &quot;התנועה ממברנה&quot; (HO), ו &quot;המטריקס של תופעות זיהומיות&quot; (קרן היסוד), מדענים צעירים (SF ו KH), ואת המחקר המדעי (HO ), וכן על תחומי מחקר מדעי חדשני &quot;לוגיסטיקה תאיים&quot; (HO), ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן.

1. הכנת תאים חיידקיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליצרול Streak מצויד חיידקים ניאון (כמו ה-GFP לבטא ס Typhimurium) LB על צלחת אגר המכילה 100 מיקרוגרם / מ"ל של אמפיצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מושבה אחת מן אגר LB לילה 2 מ"ל של מדיום LB חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ"ל של תרבית החיידקים עד 4.5 מ"ל של מדיום LB דגירה חדשים עד צפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה (3000 XG, 5 דק ', 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 5.0 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חיץ פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה חיידקי עם 5 מ"ל של PBS, ולהשתמש 50 μl של השעיה המכיל כ -10 יחידה 7 המושבה להרכיב (CFU) כמו inoculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של שימוש בחיידקים שכותרתו fluorescently, התאים חיידקי תויגו על ידי מגיב תיוג הקרינה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי. </li></ol> 2.nesthesia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים קופסת פלסטיק קטנה (10 x 10 x 5 ס"מ) עם 5% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי שמונה עד שש עשרה חלש בן עכברים זכר או נקבה בתיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכברים לשולחן נתיחה לאחר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות להרדים את העכברים ב -2% (v / v) מתאדה isoflurane מעורבב עם אוויר (קצב זרימה: 200 mL / min) (איור 1). זהו הליך סופני. </li></ol> 3. לולאה תיקון Peyer Ligated של assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1cm לחרות של עור הבטן ולאחר מכן לחתוך את הבטן הצפק של עכבר הרדים לקחת את המעי הדק המכיל תיקון של Peyer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את המעי עם חוט תפירה, מקפיד להימנע כלי הדם. הערה: רק אחד לאגד צד של המעי, ולהשאיר את הצד השני משוחרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 50 μl של השעיה או חיידקי PBS (שליטה) בעזרת מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated על ים הרופףIDE של המעי (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bind צד רופף, קרוב לבטן של עכבר עם קליפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר h 1, להסיר את ligated של Peyer לולאה תיקון ו להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peyer והבלו של תיקון מן הלולאה תיקון Peyer של ligated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהבהב הצד apical של תיקון של Peyer ידי 1ml של PBS עם שימוש במזרק המצורף מחט להסיר עודפי נוזלים ברירית וחיידקים. הברקה תיקון של Peyer נוסף פעמיים. </li></ol> 4. הר מכתים שלמות ניתוח מיקרוסקופי confocal של תיקון של Peyer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון של תיקון Peyer בפתרון Cytofix / Cytoperm BD על הקרח עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תיקון של Peyer שלוש פעמים עם 1ml של BD פרם / לשטוף חיץ עבור 5 דקות, ולאחר מכן לחסום עם 1 מ"ל של חיץ חסימת המכיל 0.1% (w / v) saponin, 0.2% (w / v) BSA ב PBS למשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 פי בדילול אנטי עכבר GP2 נוגדנים חד שבטיים (5 מיקרוגרם / מ"ל) ל הדגימה כדי לזהותM תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 200 פי נוגדן אנטי דילול עכברוש IgG מצומדות עם DyLight549 (20 מיקרוגרם / מ"ל) כדי הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על מדגם קרח במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר PBS, ולאחר מכן להוסיף 50 פי אלקסה בדילול 633 Phalloidin מצומדות כדי הדגימה כדי לזהות F-אקטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על קרח במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קלות עם 1 מ"ל של קר PBS. אז במקום 3-4 חתיכות זכוכית לכסות מעגלי בשקופית, ולהטביע את הדגימות בתמיסה 30% גליצרול ב PBS בשקופית (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב דגימות עם מיקרוסקופ DM-IRE2 confocal סריקת לייזר או שחזור DeltaVision מיקרוסקופ deconvolution. </li></ol> 5. נציג תוצאות: הדוגמה הדגימה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-S. typhimurium נצפתה עם מיקרוסקופ deconvolution שיקום DeltaVision (איור 4). GFP-S. Typhimurium הוא transcytosed ידי GP2 תאים + M. מעיים תיקון Peyer של העכבר assay לולאה יכול לזהות סוג של חיידקים פתוגניים commensal או שניתן transcytosed ידי תאים ז. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig1.jpg"> באיור 1. הרדמה של עכברים בתנאי isoflurane מתאדה. לאייר isoflurane סופקו על ידי מנגנון הרדמה ייעודי (צד שמאל). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig2.jpg"> באיור 2. סיכום תיקון assay Peyer של ligated לולאה מעיים. המתלים חיידקי פלורסנט היה מוזרק על ידי מזרק לתוך הלולאה תיקון Peyer של ligated בצד רופף של המעי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig3.jpg"> <s pbs></s><img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3225/3225fig4.jpg"> איור 4. דוגמה של עכבר ligated לולאה תיקון של Peyer assay עם GFP-Typhimurium ס. GP2, אשר דיווחו כסמן תא ספציפי M 5, היה מוכתם GP2 נוגדן אנטי עכבר (אדום). הדגימה נצפתה באמצעות מיקרוסקופ deconvolution DeltaVision שיקום. GFP-לבטא ס Typhimurium היה שותף מקומי עם GP2 על הממברנה של התא פלזמה apical M ו שלפוחית ​​cytoplasmic subapical (ראשי חץ). למעלה, apical להציג. התחתונה בצד, נופים לרוחב. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

<ol><li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).</li>
<li>Hapfelmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+microbial+colonization+of+germ-free+mice+reveals+the+dynamics+of+IgA+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses.</a> Science. 328, 1705-1709 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., Jones, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+specialization+within+human+Peyer%27s+patches%3A+an+ultrastructural+study+of+intestinal+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell specialization within human Peyer's patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles.</a> Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).</li>
<li>Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues.</a> Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Hase, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH%28%2B%29+bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462, 226-230 (2009).</li>
<li>Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenicity+of+Escherichia+coli.+I.+Evaluation+of+mouse+intestinal+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops.</a> Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).</li>
<li>Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cell+transport+of+Vibrio+cholerae+from+the+intestinal+lumen+into+Peyer%27s+patches%3A+a+mechanism+for+antigen+sampling+and+for+microbial+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer's patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.</a> J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).</li>
<li>Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M+cells--entryways+of+opportunity+for+enteropathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">M cells--entryways of opportunity for enteropathogens.</a> J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).</li>
<li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer%27s+patch+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).</li>
<li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).</li>
<li>Nagai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Peyer%27s+patches+in+the+induction+of+Helicobacter+pylori-induced+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of Peyer's patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

<html> זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקית היא בדרך כלל עבור שעות 1 כדי לבחון את שילוב חיידקים לתאי M. במקרה של דגירה 4 שעות, חיידקים מזוהים לעתים קרובות באזור תא T של טלאים של Peyer. כמו הרדמה מתאדה נשימתית isoflurane יכול לשמור על עכברים יציב, זמן הדגירה של תיקון Peyer של ligated עם השעיה חיידקי היא להארכה כדי לבחון את חיידקים אשר לנוע לתוך אזור T-cell בתיקון של Peyer. הנקודה החשובה של ניסוי זה הוא לטפל לא לשרוט את כלי הדם כאשר ligating במעי. במקרה של לא להשתמש ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> LB-אגר אמפיצילין 100 </td><td> SIGMA </td><td> L5667 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 מונו-reactive דיי חבילת </td><td> GE Healthcare </td><td> PA23001 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 350 carboxylic חומצה, succinimidyl אסתר </td><td> Invitrogen </td><td> A10168 </td><td></td></tr><tr><td> שאיפת הרדמה מנגנון </td><td> שיננו Seisakusho </td><td> SN-487 </td><td></td></tr><tr><td> קיבוע ו Permeabilization פתרון </td><td> BD </td><td> 554722 </td><td></td></tr><tr><td> נגד עכבר גליקופרוטאין 2 נוגדן </td><td> MBL </td><td>D278-3 </td><td> 200 פי דילול (5μg/ml) </td></tr><tr><td> Anti-Rat עיזים IgG, F (ab &#39;) 2 שבר ספציפי </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 112-505-006 </td><td> 200 פי דילול (20μg/ml) </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 633 Phalloidin </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> A22284 </td><td> דילול של פי 50 </td></tr><tr><td> Confocal לייזר סריקת מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMIRE2 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision שחזור deconvolution מיקרוסקופ </td><td> אפלייד Precision </td><td> DeltaVision Core </td><td></td></tr></tbody></table>

יישום של עכבר ligated מעיים תיקון של peyer assay loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים m

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

החלק הפנימי של המעי שלנו מאוכלס עם מספר עצום של חיידקים commensal. פני הרירית של מערכת העיכול חשופה ברציפות אליהם מדי פעם כדי פתוגנים. רקמת מעי הקשורים הלימפה (Galt) לשחק תפקיד מפתח לזירוז של התגובה החיסונית ברירית אלה החיידקים 1, 2. כדי ליזום את התגובה החיסונית ברירית, אנטיגנים הרירית חייב להיות מועבר מן לומן המעיים על פני המכשול אפיתל לתוך זקיקי הלימפה מאורגן כמו טלאים של Peyer. Transcytosis אנטיגן זה מתווך על ידי תאים מיוחדים M אפיתל 3, 4. תאים M הם תאים אפיתל טיפוסיות כי פעיל phagocytose מקרומולקולות חיידקים. שלא כמו תאים דנדריטים (DCS) וכן מקרופאגים, אנטיגנים אשר היעד lysosomes של השפלה, תאים M בעיקר transcytose אנטיגנים הפנימו. זה transcytosis macromolecular נמרץ באמצעות תאים M מספק אנטיגן אל זקיקי הלימפה הבסיסית מאורגןד הוא האמין להיות חיוני ליזום אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית ברירית. עם זאת, המנגנונים המולקולריים בקידום זה ספיגת אנטיגן על ידי תאים M אינם ידועים ברובם. יש לנו דיווח בעבר כי גליקופרוטאין 2 (Gp2), הביע במפורש על הממברנה פלזמה apical של תאים M בין enterocytes, משמש לרצפטור transcytotic עבור משנה של commensal ו פתוגניים enterobacteria, כולל coli Escherichia ו סלמונלה enterica serovar Typhimurium (ס Typhimurium ), על ידי הכרה FimH, רכיב של סוג אני פילי על הממברנה החיצונית חיידקי 5. כאן, אנו מציגים שיטה ליישום התיקון assay Peyer של העכבר לולאת המעי להעריך את ספיגת חיידקים על ידי תאים ז. שיטה זו היא גרסה משופרת של assay עכבר לולאת המעי שתואר לעיל 6, 7. נקודות לשיפור הן כדלקמן: 1. Isoflurane שימש כסוכן הרדמה. 2. כ 1 ס&quot;מ ligated includ לולאת המעיתיקון ing של Peyer הוקם. 3. חיידקים נלקח על ידי תאים M היו שכותרתו fluorescently ידי מגיב תיוג או על ידי חלבון פלואורסצנטי overexpressing ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). 4. בתאי האפיתל M זקיק הקשורים מכסה תיקון של Peyer התגלו על ידי כל הר immunostainig עם נוגדן אנטי Gp2. 5. Transcytosis פלורסנט חיידקי ידי תאים M נצפו על ידי ניתוח מיקרוסקופי confocal. מעיים המדבקה Peyer של העכבר assay לולאה יכול לספק את התשובה איזה סוג של commensal או חיידקים פתוגניים transcytosed ידי תאים M, ועלולה לגרום לנו להבין את המנגנון המולקולרי של איך לגרות את המערכת החיסונית ברירית באמצעות תאים ז.

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M<em&gt; In vivo</em&gt;. שיטה זו מספקת שיטה להבין M-תא לתפקד במערכת החיסונית.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

מעינו של הגוף מאוכלס במספר עצום של חיידקים קומנסליים. פני השטח של הרירית בדרכי העיכול חשופים באופן רציף...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לבחון בליעה בקטריאלית על ידי תאי M הממוקמים במערכת החיסון של רירית המעי. השלב הראשון של נוהל זה הוא חשיפה וקישור של ה-Peyer's patches במעי של עכבר בהרדמה. לאחר מכן, מוזרקות בקטריות פלואורסצנטיות לאזור המקושר.שעה לאחר מכן, נגזרים פיסות מהמעי. התאים ברקמה עוברים חדירה וצביעה עבור הסמן של תאי M, ‏GP2. לבסוף, הדגימות נבחנות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, וניתן להדמיות של חיידקים העוברים טרנסציטוזיס על ידי תאי M.בנוסף למתן תובנות לגבי הבסיס המולקולרי של טרנסציטוזיס חיידקית על ידי תאי M, ניתן להחיל את השיטה על מערכות אחרות. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון את חדירות התאים ובמעי דלקתי באמצעות חולו和מיקרובים. בעזרת פורס זכוכית סטרילי, הפצילו את החיידקים הפלואורסצנטיים על צלחת LB אגר והדגירו את הצלחת ב-37 °C עד להופעת מושבות בודדות. בחרו מושבה בודדת מהאגר המוצק והחדירו אותה ל-2 mL של מצע LB טרי.לאחר מכן, תרבתו את החיידקים בנער (shaker) למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. ברגע שתרבית המוצא גדלה, העבירו 500 µL של חיידקים לתוך 4.5 mL של מצע LB והדגירו תרבית חדשה זו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות, או עד שהצפיפות האופטית שלה ב-600 nm תגיע ל-1, מה שמעיד על כך שגידול החיידקים נמצא בפאזה לוגריתמית (log phase). בנקודה זו, סבבו את התרבית בצנטריפוגה במהירות של 3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לאסוף את החיידקים. לאחר הסבב בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את המשקע ב-5 mL של PBS סטרילי. לאחר חזרה על שלב השטיפה, השהו מחדש את החיידקים ב-5 mL של PBS.לאחר הנחת העכבר תחת הרדמה רציפה של isof fluorine, השתמשו בכלים סטריליים כדי לפתוח את בטן העכבר באופן אספטי. התחילו בחשיפת המעי הדק ואתרו את ה-PI's patches. לאחר מציאת ה-PI's patches, השתמשו בחוט תפירה סטרילי כדי לקשור את המעי במרחק של כ-5 mm מאחד מצדי ה-patch.יש להיזהר שלא לקרוע כלי דם במהלך הפרוצדורה. לאחר קשירת המעי, השתמש במזרק כדי להזריק 50 µL של תרחיף חיידקים בריכוז של כ-10⁷ CFU לתוך הלולאה שנוצרה מהקשירה בצד הרפוי של המעי. לאחר מכן, השתמש בחוט כדי לקשור את הצד השני של המעי.סגור את בטנו של העכבר באמצעות תפס וכבד את העכבר תחת הרדמה למשך שעה אחת לפני ההמתה. כדי לקצור את ה-pyres patch, גזור בזהירות את ה-pyres patch. לאחר מכן, שטוף בעוצמה PBS דרך מקטע המעי שנקצר מספר פעמים כדי לשטוף את הצד האפיקלי של ה-PI's patch ולהסיר נוזל ריריי Excess וחיידקים.לאחר שטיפת ה-PI's patch, מקמו אותו בבאר של פלטת 24 בארות והוסיפו תמיסת cyto effects או cyto perm. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה אחת. לאחר קיבוע ה-P'S patch, השרו אותו ב-1 mL של perm wash buffer למשך חמש דקות.חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, העבר את הדגימה ל-1 mL של תמיפת חסימה (blocking buffer) והדגר אותה על קרח למשך 30 דקות. לאחר שלב החסימה, הוסף נוגדן מונוקלונלי anti mouse GP2 לריכוז סופי של 5 µg/mL והדגר את הדגימה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לצבוע את תאי ה-M.בשלב הבא, שטפו את הדגימה כפי שבוצע קודם לכן. הוסיפו שכבה שנייה של נוגדן מצומד והדגירו את הדגימה על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר שצבעו את הדגימה, שטפו אותה בעדינות ב-PBS.לאחר מכן, הניחו שלוש או ארבע זכוכיות כיסוי עגולות על סלייד והטמיעו את רقعת ה-pires ב-200 µL של תמיסת glycerol בריכוז 30% ב-PBS. השתמשו במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי DM IRE two, או במיקרוסקופ דה-קונבולוציה Delta vision restoration, כדי לבחון את הדגימה על הסלייד. בתמונה זו ניתן לראות חיידקי salmonella typhimurium המסומנים ב-GFP בירוק, המוקפים על ידי GP two המוצג באדום על ממברנת הפלזמה האפיקלית.בתמונה מסובבת זו, ניתן להבחין בחיידקים בתוך שלפוחיות ציטופלזמיות סוב-אפיקליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הערכת טרנסציטוזה של חיידקים על ידי תאי M באמצעות בדיקת Lu מעויית של מעי הפס.

application-mouse-ligated-peyers-patch-intestinal-loop-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל לולאה איליאלית לחקר חדירות המעי במודל עכבר. שיטה זו מספקת מודל חי להבנת תפקוד מחסום האפיתל והתגובה החיסונית הנובעת ממנו.

מודל Mouse Ileal Loop: מודל כירורגי לחקר חדירות המעי בעכבר

בסרטון זה, אנו מתארים הליך כירורגי ליצירת לולאת מעי גס פרוקסימלית של עכבר או קטע pcLoop ואחריו הזרקה intraluminal של סמנים פלואורסצנטיים לתוך קטע כדי לחקור את חדירות אפיתל המעי.

יצירת מודל לולאת מעי גס פרוקסימלי של עכבר: הליך כירורגי ליצירת לולאת מעי גס פרוקסימלית ומדידת חדירות המעי על ידי זיהוי סמנים פלואורסצנטיים בסרום לאחר הזרקה תוך לומינלית

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בתכשירי רקמת מעיים שנכרתו או "שקי מעיים" כמודל ex vivo של תפקוד מחסום המעי. מודל זה עשוי לשמש להערכת שלמות מחסום האפיתל ושכבת הג'ל הרירית באתרי מעיים ספציפיים במודלים של מחלות עיכול בבעלי חיים.

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת נקודות קצה חשובות וסמנים מתרבים של נזקי מעיים קטנים ופיצוי יתר באמצעות מודל של mucositis המושרה כימותרפיה. אנו להדגים את הזיהוי של תאים מתרבים באמצעות מחזור התא סמן מסוים באמצעות משקל המעי קטן, עומק קריפטה, ו בגובה ליה כנקודות קצה.

חשוב נקודות קצה וסמנים ההתרבות כדי להעריך פגיעה במעיים קטנים והסתגלות באמצעות מודל העכבר של Mucositis הנגרמת כימותרפיה

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.

תצפית מיקרוסקופית של לימפוציטים דינמיקה במדבקות של עכברוש פייר

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

אנו מתארים מודל מורין של אילאוס לאחר הניתוח שנוצר באמצעות מניפולציה במעיים. תפקוד המעבר במערכת העיכול, שינויים פתולוגיים והפעלת תאי מערכת החיסון הוערכו 24 שעות לאחר הניתוח.

מודל Ileus Murine לאחר הניתוח

מחקר זה מציג שיטת הדמיה תלת מימדית המשתמשת ברקמות מעי שלמות ומיקרוסקופיה מרובת פוטונים כדי לכמת ריר מופרש, המאפשר ניתוח נפחי מדויק והדמיה של דינמיקת ריר בתגובה לגירויים כמו קרבמוילכולין כלוריד.

כימות תלת מימדי של ריר המעי באמצעות הדמיית רקמות שלמות

חקור ספיגת חיידקים על ידי תאי M בכרסת עכבר באמצעות שיטת לולאת מעי קשורה. שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות של טרנסציטוזיס חיידקי בתאי M, ומספקת כלי לחקר מנגנוני החיסון הרירי במעי.

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

גלה סרטונים נוספים