יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

המטרה הכללית של נוהל זה היא לבחון בליעה בקטריאלית על ידי תאי M הממוקמים במערכת החיסון של רירית המעי. השלב הראשון של נוהל זה הוא חשיפה וקישור של ה-Peyer's patches במעי של עכבר בהרדמה. לאחר מכן, מוזרקות בקטריות פלואורסצנטיות לאזור המקושר.

שעה לאחר מכן, נגזרים פיסות מהמעי. התאים ברקמה עוברים חדירה וצביעה עבור הסמן של תאי M, ‏GP2. לבסוף, הדגימות נבחנות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, וניתן להדמיות של חיידקים העוברים טרנסציטוזיס על ידי תאי M.

בנוסף למתן תובנות לגבי הבסיס המולקולרי של טרנסציטוזיס חיידקית על ידי תאי M, ניתן להחיל את השיטה על מערכות אחרות. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון את חדירות התאים ובמעי דלקתי באמצעות חולו和מיקרובים. בעזרת פורס זכוכית סטרילי, הפצילו את החיידקים הפלואורסצנטיים על צלחת LB אגר והדגירו את הצלחת ב-37 °C עד להופעת מושבות בודדות. בחרו מושבה בודדת מהאגר המוצק והחדירו אותה ל-2 mL של מצע LB טרי.

לאחר מכן, תרבתו את החיידקים בנער (shaker) למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. ברגע שתרבית המוצא גדלה, העבירו 500 µL של חיידקים לתוך 4.5 mL של מצע LB והדגירו תרבית חדשה זו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות, או עד שהצפיפות האופטית שלה ב-600 nm תגיע ל-1, מה שמעיד על כך שגידול החיידקים נמצא בפאזה לוגריתמית (log phase). בנקודה זו, סבבו את התרבית בצנטריפוגה במהירות של 3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לאסוף את החיידקים. לאחר הסבב בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את המשקע ב-5 mL של PBS סטרילי. לאחר חזרה על שלב השטיפה, השהו מחדש את החיידקים ב-5 mL של PBS.

לאחר הנחת העכבר תחת הרדמה רציפה של isof fluorine, השתמשו בכלים סטריליים כדי לפתוח את בטן העכבר באופן אספטי. התחילו בחשיפת המעי הדק ואתרו את ה-PI's patches. לאחר מציאת ה-PI's patches, השתמשו בחוט תפירה סטרילי כדי לקשור את המעי במרחק של כ-5 mm מאחד מצדי ה-patch.

יש להיזהר שלא לקרוע כלי דם במהלך הפרוצדורה. לאחר קשירת המעי, השתמש במזרק כדי להזריק 50 µL של תרחיף חיידקים בריכוז של כ-10⁷ CFU לתוך הלולאה שנוצרה מהקשירה בצד הרפוי של המעי. לאחר מכן, השתמש בחוט כדי לקשור את הצד השני של המעי.

סגור את בטנו של העכבר באמצעות תפס וכבד את העכבר תחת הרדמה למשך שעה אחת לפני ההמתה. כדי לקצור את ה-pyres patch, גזור בזהירות את ה-pyres patch. לאחר מכן, שטוף בעוצמה PBS דרך מקטע המעי שנקצר מספר פעמים כדי לשטוף את הצד האפיקלי של ה-PI's patch ולהסיר נוזל ריריי Excess וחיידקים.

לאחר שטיפת ה-PI's patch, מקמו אותו בבאר של פלטת 24 בארות והוסיפו תמיסת cyto effects או cyto perm. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה אחת. לאחר קיבוע ה-P'S patch, השרו אותו ב-1 mL של perm wash buffer למשך חמש דקות.

חזור על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, העבר את הדגימה ל-1 mL של תמיפת חסימה (blocking buffer) והדגר אותה על קרח למשך 30 דקות. לאחר שלב החסימה, הוסף נוגדן מונוקלונלי anti mouse GP2 לריכוז סופי של 5 µg/mL והדגר את הדגימה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C כדי לצבוע את תאי ה-M.

בשלב הבא, שטפו את הדגימה כפי שבוצע קודם לכן. הוסיפו שכבה שנייה של נוגדן מצומד והדגירו את הדגימה על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר שצבעו את הדגימה, שטפו אותה בעדינות ב-PBS.

לאחר מכן, הניחו שלוש או ארבע זכוכיות כיסוי עגולות על סלייד והטמיעו את רقعת ה-pires ב-200 µL של תמיסת glycerol בריכוז 30% ב-PBS. השתמשו במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי DM IRE two, או במיקרוסקופ דה-קונבולוציה Delta vision restoration, כדי לבחון את הדגימה על הסלייד. בתמונה זו ניתן לראות חיידקי salmonella typhimurium המסומנים ב-GFP בירוק, המוקפים על ידי GP two המוצג באדום על ממברנת הפלזמה האפיקלית.

בתמונה מסובבת זו, ניתן להבחין בחיידקים בתוך שלפוחיות ציטופלזמיות סוב-אפיקליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הערכת טרנסציטוזה של חיידקים על ידי תאי M באמצעות בדיקת Lu מעויית של מעי הפס.