יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M
December 17th, 2011
בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים M In vivo. שיטה זו מספקת שיטה להבין M-תא לתפקד במערכת החיסונית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ספיגת החיידקים על ידי תאי M הממוקמים בתוך מערכת החיסון של רירית המעי. השלב הראשון בהליך זה הוא לחשוף ולקשור את כתמי מדורות המעי של עכבר מורדם. לאחר מכן מוזרקים חיידקים פלואורסצנטיים לאזור הקשירה.
שעה לאחר מכן, טלאי המדורות נכרתים. לאחר מכן התאים ברקמה מחלחלים ונצבעים עבור סמן תאי M, GP שתיים. לבסוף, הדגימות נצפות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וניתן לדמיין חיידקים העוברים טרנסציטוזיס על ידי תאי M.
בנוסף לספק תובנה לגבי הבסיס המולקולרי של הטרנסציטוזיס החיידקי על ידי תאי m, ניתן להחיל פיטורין על מערכות אחרות. לדוגמה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסייע לחדירות התאים ובמעי ממוסגר באמצעות כלור וחיידקים באמצעות מפזר זכוכית סטרילי פס את החיידקים הפלואורסצנטיים על צלחת מקדחה LB ודגירה על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עד שמושבות בודדות נראות לעין. בחר מושבה בודדת מהמקדחה המוצקה וחסן אותה לשני מיליליטר של מדיה LB טרייה.
לאחר מכן תרבית את החיידקים על שייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שתרבית המתנע גדלה, העבירו 500 מיקרוליטר של חיידקים ל-4.5 מיליליטר של מדיום LB ודגרו על תרבית חדשה זו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד ארבע שעות או עד שהצפיפות האופטית שלה ב-600 ננומטר מגיעה לאחת המצביעה על כך שגידול החיידקים נמצא בשלב לוג. בשלב זה, צנטריפוגה את התרבית ב-3000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקצור את החיידקים לאחר צנטריפוגה, להשליך את החטיפה ולשטוף את הגלולה בחמישה מיליליטר PBS סטרילי לאחר חזרה על שלב הכביסה Resus השעו את החיידקים בחמישה מיליליטר PBS.
לאחר הנחת העכבר תחת הרדמה רציפה של פלואור השתמש בכלים סטריליים כדי לפתוח את בטן העכבר באופן אספטי. התחל בחשיפת המעי הדק ואתר את המדבקות של ה-PI. לאחר שנמצאו מדבקות של PI, השתמש בחוט תפירה סטרילי כדי לקשור את המעי כחמישה מילימטרים לצד אחד של המדבקה.
הקפד להימנע מניתוק כלי דם במהלך ההליך. לאחר קשירת המעי, השתמש במזרק כדי להזריק 50 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים כ-10 לשבעת ה-CFU לתוך לולאת תיקון האש הקשורה בצד הרופף של המעי. לאחר מכן השתמש בחוט כדי לקשור את הצד השני של המעי.
סגור את בטן העכבר עם קליפס והשאר את העכבר תחת הרדמה למשך שעה לפני המתת חסד. כדי לקצור את כתם המדורות, כרתו בזהירות את כתם המדורות. לאחר מכן שטפו במרץ PBS דרך החלק שנקטף של המעי מספר פעמים כדי לשטוף את הצד האפיקלי של המדבקה של PI ולהסיר עודפי נוזל רירי וחיידקים.
לאחר שטיפת המדבקה של ה-PI, הנח אותה בבאר של צלחת של 24 בארות והוסף אפקטים של ציטו או תמיסת ציטו פרם. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה. לאחר תיקון מדבקת ה-P'S, יש להשרות אותה במיליליטר אחד של מאגר שטיפת סלסול למשך חמש דקות.
חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים. לאחר מכן הניחו את הדגימה במיליליטר אחד של מאגר חוסם ודגרו אותה על קרח למשך 30 דקות. לאחר שלב החסימה, הוסף נוגדן חד שבטי נגד עכבר GP שני לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר ודגר את הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לצבוע את תאי M.
לאחר מכן, שטפו את הדגימה כמו קודם. הוסף רצפה משנית לנוגדנים מצומדים ודגר את הדגימה על קרח בחושך למשך שעתיים. לאחר שהדגימה מוכתמת, שטפו את הדגימה בעדינות ב-PBS.
לאחר מכן הניחו שלוש או ארבע חתיכות של זכוכית כיסוי עגולה על שקופית והטמיעו את תיקון הפירס ב-200 מיקרוליטר של תמיסת גליצרול של 30% ב-PBS. בשקופית, השתמש במיקרוסקופ לייזר DM IRE שני קונפוקליים, או במיקרוסקופ דה-קונבולוציה לשחזור ראייה של דלתא כדי לצפות בדגימה. בתמונה זו, ניתן לראות GFP ירוק שכותרתו סלמונלה טיפימוריום מוקף ב-GP 2 המוצג באדום על קרום הפלזמה האפיקלי.
בתמונה מסובבת זו, חיידקים נראים בתוך השלפוחיות הציטופלזמיות התת-אפיקליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך טרנסציטוזיס חיידקי על ידי תאי M באמצעות מעיים קשורים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מתמקד בתאי M במערכת החיסון הרירית של המעיים, במיוחד בתפקידם בטרנסציטוזיס חיידקי. השיטה המתוארת מאפשרת הערכה של תפקוד תאי M in vivo, ותורמת להבנתנו של מעקב חיסוני רירי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- מיקרוביולוגיה
- נוירולוגיה
רקע
- תאי M הם תאים אפיתליאליים מיוחדים בגופיפי פאייר.
- הם ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית של המעיים.
- הבנת תפקודם יכולה לספק תובנות לגבי בריאות המעיים ומחלות.
- טרנסציטוזיס חיידקי הוא תהליך מרכזי במעקב החיסוני.
מטרת המחקר
- להעריך את ספיגת החיידקים על ידי תאי M in vivo.
- לפתח שיטה לחקר תפקוד תא M.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני מעקב חיסוני רירי.
שיטות בשימוש
- כיבוש גופיפי פאייר במעיים בעכברים מורדמים.
- הזרקת חיידקים פלואורסצנטיים לאזור הכבוש.
- הוצאת גופיפי פאייר לאחר שעה.
- צביעת דגימות רקמות לסמן GP2 של תאי M והתבוננות במיקרוסקופ קונפוקלי.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של טרנסציטוזיס חיידקי על ידי תאי M.
- הוכחת היתכנות שיטת ההערכה.
- מתן תובנות לגבי התפקוד החיסוני של תאי M.
- תרומה להבנת הרקמה הלימפה הקשורה למעיים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת לימוד מפורט של תפקוד תא M.
- הבנת תאי M יכולה להודיע אסטרטגיות לבריאות המעיים.
- מחקר נוסף יכול לחקור את ההשלכות לטיפולים חיסוניים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
