איתור Genogrouping של Noroviruses מ שרפרפים לילדים עד Taqman צעד אחד RT-PCR

זיהוי נוירו-וירוס ב-RNA שחולץ על ידי צעד אחד בזמן אמת R-T-P-C-R עם בדיקות TECHMAN ספציפיות. אבל היום אנחנו הולכים לדבר על נוירו-וירוס. זה בלימה, פרו וזו קבוצה של האוניברסיטה וגם של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

נורו-וירוס, מתברר, הוא כנראה אחד הגורמים המוזנחים ביותר לשלשולים. הקבוצה שלנו מצאה כי נורו-וירוס הוא נגיף הקורונה השני במונחים של אשפוזים של ילדים עקב שלשולים וגם מבחינת מספר מקרי השלשול על בסיס אוכלוסייה. אז מדוע נוירו-וירוס לא אובחן בעבר?

ובכן, הסיבה היא שזה וירוס RNA ואנחנו לא יכולים לתרבת, אז זה דורש שיטות ביולוגיות מולקולריות מיוחדות כדי לאבחן. השיטות האלה שאנו משתמשים בהן הן R-T-P-C-R, וזה הולך להדגים כיצד להשתמש ולאבחן כיצד להשתמש ב-R-T-P-C-R כדי לאבחן נוירו-וירוס. בשיטת Ciag GUINE הפנימית בשנת 1989 השתמשנו בשיטת G guine ATE פנימית למיצוי RNA ויראלי לדגימות צואה.

שיטה זו מהווה אלטרנטיבה לערכת ה-RNA הנגיפית המסחרית. שתי השיטות מבוססות על תכונות קשירת חומצות הגרעין של חלקיקי סיליקה. בשילוב עם תכונות האנטי נוקלאז של הכנת G Guad Dium Bio NA של תרחיף סיליקה למיצוי RNA.

להכנת חלקיקי הסיליקה, קחו 30 גרם סיליקון דו חמצני, הוסיפו 250 מילימטר מים דה-מינרליים ותלו את הסיליקון על ידי ניעור. לאחר 24 שעות של שקיעה, הסר 215 מיליליטר מהסופינט והחלק על ידי יניקה ב -250 מיליליטר מים מפורזים ושוב, השהה את הסיליקון על ידי ניעור. לאחר 24 שעות נוספות, הסר את הסופינטה על ידי יניקה והתאם את ה-pH של תרחיף הסיליקה ל-pH 2.0 באמצעות חומצה הידרוכלורית qu השעיה של סיליקה בבקבוקי זכוכית ומיצוי חיטוי עם g guin וסיליקה.

כעת נבחן את מיצוי ה-RNA הנגיפי באמצעות חלקיקי הסיליקה שהוכנו בשלב הקודם. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 70 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין תרחיף צואה של 10% קח כ-0.1 גרם צואה והשלם עם מיליליטר אחד של PBS לפני העקירה.

עומס נמוך יותר דגימות מערבולת למשך חמש שניות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-4,000 סל"ד למשך 10 דקות. בכל תגובה, דגימת צואה חיובית לנוירו-וירוס כבקרה חיובית ומים מטופלים על ידי DEPC בצינור מיקרו צנטריפוגה. מערבבים את הדברים הבאים, מיליליטר אחד של L שישה מאגרים, 20 מיקרוליטר מחלקיקי הסיליקה המוכנים ו -200 מיקרוליטר תמצית צואה.

מערבולת קצרה ומשאירים את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. צנטריפוגה למשך 15 שניות. לאחר מכן שטפו את הגלולה פעמיים עם חיץ L שתיים, ואז שתי שטיפות עם אתנול 70% ושטיפה אחת עם חומצה.

יבש את הגלולה בגוש חימום יבש בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לחות RNA בכדור הסיליקה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר מים מזוקקים ללא RNA. מוסיפים מיקרוליטר אחד של מערבולת חטא RNA ומשאירים בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

מרבה רגליים במשך שלוש דקות במלוא המהירות ואוסף טמפ' שוכבת המכילה את ה-RNA. כמת את הדגימות בטכניקה ללא טיפה ואחסן RNA שחולץ במינוס 70 מעלות צלזיוס. עד לשימוש במיצוי מסחרי של RNA נגיפי.

כעת אנו הולכים להדגים את מיצוי ה-RNA מצואה באמצעות ה-RNA הנגיפי המסחרי הזמין של קיי אמפ. הערכה מכילה את מאגר העמודים הבא של סיליקה ג'ל MinPin, A-V-L-A-W אחד A W2 A VE ו-RNA נושא עלים. על רגל אחת. הנוהל הוא כדלקמן.

מערבבים חלק מהמאגר A VL עם RNA נשא וצינור מערבולת בתמיסה לצינורות של 1.5 מיליליטר ב-114 מיקרוליטר של תרחיף צואה ומעורבבים על ידי הודעות טקסט לאחר המלחמה. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. צנטריפוגה דופק את הדגימות.

הוסף אתנול לדגימות וערבב על ידי הודעות טקסט לאחר המלחמה למשך 15 שניות. ואז צנטריפוגה קצרה, החל את התמיסה על עמוד הסיבוב בצינור איסוף מינימלי. משוך פוגה.

לאחר מכן הנח את עמוד הסיבוב בצינור איסוף חדש. שטפו את העמוד עם RNA קשור באמצעות מאגר A W ללא צנטריפוגת RAN נשא. הנח עמודה בצינור איסוף נקי של שני מיליליטר וצפה בעמודה עם חיץ.

צנטריפוגה W2 במהירות מלאה מניחה עמוד סיכה בצינור מיקרו צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה במהירות מלאה. והרם את ה-RNA באמצעות חיץ RNA ויראלי של מאגר VE במינוס 70 מעלות צלזיוס עד לשימוש בזיהוי נוירו-וירוס ב-RNA שחולץ בצעד אחד PCR בזמן אמת עם בדיקות טכנאי ספציפיות כדי ליצור תערובת עכברים עבור קבוצת גנואו אחת וקבוצת דינה שתיים, שמור את תערובת האנזים RT שלך על קרח במהלך הבדיקה. הערכה שהוגדרה מכילה את השליטה הבאה במים של PCO, שתי ביצים, פריימרים ובדיקות עבור דינה.

קבוצה ראשונה פריימרים ובדיקה עבור דינה קבוצה שתיים. ולבסוף, האנזים RT מערבל מערבולת H מגיב לפני השימוש ב-QU ל-PCR להשקות את תערובת המאסטר שני פריימרים X קוק G אחד קדימה ואחורה וטבעת בדיקה אחת A ואחת B עבור UniGroup. תערובת שרירים אחת ומכינה את COG G שתיים עבור פסוק VA ובדיקה.

צלצול שניים לתיאו גרופ 2 מאסטר מיקס. ולבסוף, הוסף אנזים ארטיקס לשתי תערובות השרירים של קבוצת ה-INO. מערבולת ואלקו 10 מיקרוליטר של תערובת השרירים המתאימה לבארות התגובה.

בארון אחר, הוסף חמישה מיקרוליטרים של לא מדולל, RNA חמישה מיקרוליטר, G אחד ו- G שני RNA בקרה חיובית וחמישה מיקרוליטרים בקרה שלילית לגלגלי התגובה המתאימים. צנטריפוגה מתרוקנת למשך 10 שניות בטמפרטורה של 6, 000 גרם. בשלב הראשון התוכנה מציגה הגדרה מתקדמת.

ובמסך מאפייני הניסוי, הניסוי מזוהה כנורו-וירוס. סוג הניסוי הוא נוכחות או היעדרות במסך היעד. הזן את שם היעד שברצונך לזהות בלוחית תגובת ה-PCR.

ג'ינה, משפחת הכתבים בקבוצה הראשונה והשנייה והקווינצ'ר תמרה על מסך הדגימה והשכפול. הזן את מספר הדגימות והבקרות החיוביות והשליליות הכלולות בלוחית התגובה ולאחר מכן בחר אילו דגימות או כיוון יעד להגדיר בשיטת ריצה. ראשית, בצע שעתוק הפוך ב-50 מעלות צלזיוס לסינתזה של DNA משלים.

לאחר מכן העלו את הטמפרטורה לתשע עד חמש מעלות צלזיוס כדי להפעיל פולימראז התחלה חמה. התחל את הרכיבה לפי משך זמן בתשע עד חמש מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלב משולב של כריעה והגברה ב-60 מעלות צלזיוס. חזור על רכיבה ארבע עד חמש פעמים חזור להגדרת הצלחת.

לחץ על שמור תבנית ושמור את הניסוי. לחץ על התחל הפעלה. מסך עלילת ההגברה מאפשר לך להציג הגברה לדוגמה כאשר המכשיר שלך אוסף נתונים קפואים במהלך ריצה כמו גם את ניגודיות העלילה.

פלואורסצנטי צלילה מנורמל ומספר מחזור. במחזורים הראשונים של PCR, יש שינוי מועט באות הפלורסנט. זה מגדיר את קו הבסיס.

עלייה בקרינה סביב קו הבסיס מצביעה על זיהוי מטרה מצטברת. יש להגדיר סף פלואורסצנטי קבוע לגבי קו הבסיס. מחזור הסף של הפרמטר CT מוגדר כמספר המחזור השברי שבו הקרינה עוברת את הסף הקבוע.

מסך עלילת ההגברה שימושי לזיהוי, בחינת הגברה חריגה כגון פלואורסצנטיות מוגברת בבארות בקרה שליליות והיעדר פלואורסצנטיות ניתנת לזיהוי במחזור צפוי. שיטת הערכה אמינה, אך דורשת כמות עצומה של זמן ומשאבים. כאן הראינו שיטה אמינה לא פחות שהיא חסכונית ומשתמשת בזמינות ריאגנטים ארציים, תוך עקיפת הסתמכות על חומרים שנרכשו בחו"ל, כל אלה יובילו בסופו של דבר לאבחון נגיש יותר וטיפול מהיר בגורמים הוויראליים השכיחים ביותר לגסטרואנטריטיס בילדים באמצעות השיטה הכלכלית הפנימית לבידוד חומצות גרעין, שהשיגו תוצאות דומות לאלה.

הושג עם הערכה המסחרית של Kerogen, יחד עם ה-TAC MAN, R-T-P-C-R, שפותח במעבדה שלנו. אנו יכולים לזהות מגוון רחב של זיהומים נוירו-וירוסיים. הבדיקה הוכיחה את עצמה כשימושית לאבחון שגרתי מכיוון שהיא מבטלת את עיבוד המוצר לאחר ההגברה, ובכך מקצרת את זמן הבדיקה.

מלבד אבחון, הפרוטוקול יכול לשמש גם להבהרת האפידמיולוגיה של זיהום נוירו-וירוס, ובכך להיות שימושי לשליטה בבריאות הציבור במחלה זו.