הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה
7 בדצמבר 2011
בדיקת האורך של איבוד מסת העצם של עצמות הירך לבין tibiae של עכברים בוגרים בוצעה בעקבות פגיעה בחוט השדרה באמצעות רציפים במינון נמוך רנטגן סורק. אובדן העצם Tibia זוהה לאורך כל תקופת המחקר, תוך איבוד מסת העצם בעצם הירך לא זוהה עד 40 ימים שלאחר הפציעה.
נוהל זה מדגים שיטה חדשנית המשמשת לזיהוי וכימות של אובדן צפיפות העצם בגפיים האחוריות של עכבר, כתלות בזמן, בעקבות פגיעה בחוט השדרה. הדבר מבוצע תחילה על ידי ביצוע פגיעת חיתוך (transection) של חוט השדרה בעכבר שהורדם תחת תנאים סטריליים ובאישור של ה-alac. לאחר תקופת התאוששות, בעל החיים מורדם שוב ומתקבלות תמונות רנטגן של ה-tibia וה-fibia של שתי הגפיים האחוריות, ימין ושמאל.
פעולה זו מבוצעת מדי שבוע עד ל-40 ימים לאחר הפציעה. לאחר מכן, מבוצע ניתוח תמונה של סריקות הרנטגן. השלב האחרון הוא ביצוע הערכה פוסט-מורטם של צפיפות העצם בעצמות הגפיים האחוריות שהוצאו.
בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד פגיעה בחוט השדרה גורמת לאובדן מהיר ופרוגרסיבי של צפיפות העצם בגפיים האחוריות של העכבר. שיטה חדשנית זו מספקת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה תוך שימוש במינוני קרני x נמוכים מאלו המשמשים בשיטות דימות אחרות. אוסטאופורוזיס הוא מצב מסכן חיים הפוגע באנשים החיים עם פגיעה בחוט השדרה.
אנו מציעים שיטה חדשנית לשימוש במחקרי בעלי חיים על פגיעות בחוט השדרה, המאפשרת לחוקר לעקוב לאורך תקופות זמן ממושכות אחר אובדן העצם הקשור לאוסטאופורוזיס. דבר זה חשוב משתי סיבות. ראשית, הדבר יספק הזדמנות לחקור את המנגנונים המעצבים את התפתחות האוסטאופורוזיס.
השני הוא שהיא מספקת לנו דרך לבחינת התערבויות חדשות שנועדו למנוע או אולי להפוך את התפתחות האוסטאופורוזיס במטופלים החיים עם פגיעה בחוט השדרה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אוסטאופורוזיס המושרה על ידי פגיעה בחוט השדרה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון אובדן עצם הקשור לגיל המתרחש בנשים לאחר גיל המעבר, כמו גם על ירידות אחרות בצפיפות העצם המושרות על ידי טראומה; אי-שימוש בגפיים כתוצאה מבידוד, לאחר שבר או נזק אחר, עלול להוביל לאובדן עצם משמעותי במהלך תהליך ההחלמה. יישום דימות X-ray במינון נמוך ובאורך זמן בבעל החיים השל עשוי לספק נתיבים חדשים לפיתוח טיפולים שנועדו לצמצם או למנוע בעיות אלו.
בצע את ניתוח הפגיעה בחוט השדרה בהתאם לפרוטוקולי sander ובהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC). לאחר מכן, החל מהיום ה-10 לאחר ניתוח חוט השדרה והמשך במרווחים של 10 ימים עד ליום ה-40, העरक את עצמות הפמור והטיביה הימניות והשמאליות של חיות עם פגיעה בחוט השדרה בעקבות חיתוך (transection), תחת הרדמה, ושל קבוצות ביקורת תואמות בגיל שלא נפגעו, באמצעות סריקה במערכת ivus Lumina XR. לפני הסריקה, אתחל את מכשיר ה-Lumina XR כדי לאפשר למצלמה הפנימית להגיע לטמפרטורת עבודה של minus 90 °C.
הנח בעל חיים שעבר הרדמה על הפלטפורמה בתוך ה-Lumina xr. לאחר מכן, הכנס עדשה בהגדלה גבוהה כדי לאפשר מיקוד הן באזור הפמור (עצם הירך) והן באזור הטיביה (שוקמיה).
במידת הצורך, פתחו את הדלת ומקמו מחדש את בעל החיים. מיקום נכון של בעל החיים מוצג כאן. לאחר שהמיקום תקין, ניתן לבצע את פונקציית הצילום בקרני X.
בחרו מהרשימה הנפתחת של האנרגיה ערך המתאים לבעל חיים. לאחר מכן, פתחו את לוח הבקרה. הפעילו את תכונת רנטגן על ידי סימון תיבת הבחירה x-ray, ורכשו את תמונת הרנטגן.
יש לוודא כי כל העצם הירך (femur) והשוק (tibia) נראות, כפי שמוצג כאן. מכיוון שתוכנת הדמיון החי מציגה כברירת מחדל תמונות רנטגן שעברו טרנספורמציה, ודאו שתמונות רנטגן גולמיות מוצגות על ידי כניסה לתפריט כלי סינון התיקונים והסרת סימון ה-V לצד ספיגת רנטגן (x-ray absorption). נתוני תמונה גולמיים נשמרים באופן אוטומטי בכונן הקשיח.
קבצי TIFF מייצגים נשמרים גם הם. לאחר ההדמיה, העכבר מוחזר לכלובו ומורשה להתאושש תחת השגחת החוקר. התהליך חוזר על עצמו עם העכבר הבא.
ראשית, פתח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל ה-living image בתיבת הדו-שיח המופיעה. בחר את התיקייה הרצויה ולחץ על אישור. טען תמונת רנטגן על ידי לחיצה על כפתור ה-browse.
דפדפן התמונות החיות מציג את הנתונים שנבחרו יחד עם מזהה המשתמש. מידע על תוויות ומידע על תצורת המצלמה. כדי לפתוח נתונים, יש להקליק פעמיים על שורת הנתונים. התמונה ולוח כלי העבודה יוצגו.
הנתונים הפתוחים מודגשים בכחול בדפדפן. כעת, לחצו על ROI tools. בפלטת הכלים ב-ROI tools, פתחו את רשימת הבחירה של ה-type ובחרו ב-measurement ROI.
כדי לטעון את שלושת ה-ROIs המשמשים בניסוי זה, לחצו על סמל הריבוע וטענו ריבועים. באמצעות סרגל, מדדו את אורך ה-femur, והתאימו את אורך שני הריבועים כך שיהיו שמינית מאורך ה-femur הכולל. התאימו את רוחב הריבועים כך שיהיו אחת ל-24 מאורך ה-femur הכולל.
כעת, בעזרת הסרגל, מדדו שמינית מהמרחק מקצה הפמור הפרוקסימלי ומקמו מלבן אחד כך שיהיה ממורכז במיקום זה. העבירו את המלבן השני לקצה הפמור הדיסטלי ומקמו אותו כך שיהיה ממורכז בתוך האזור הטרבכולרי של הברך. לאחר מכן, מדדו את אורך הטיביה.
כווננו את אורך התיבה לשמינית מאורך השוקה (tibia) הכולל. כווננו את הרוחב לשלושיםית מאורך השוקה הכולל. לבסוף, מקמו את התיבה כך שתהיה ממורכזת, ובמרחק של שמינית מאורך השוקה הכולל מקצה השוקה הפרוקסימלי (proximal), כפי שניתן לראות כאן.
בשלב הבא, לחצו על סמל המדידה; מדידות העוצמה של ה-ROI יופיעו בתמונת הרנטגן וטבלת מדידות ה-ROI תוצג. ייצאו טבלה זו למיקום הרצוי כקובץ CSV עם נקודה. פעולה זו תאפשר לפתוח את הטבלה באמצעות Excel.
חזור על שלב זה עם כל התמונות השמורות המיועדות לניתוח. לבסוף, רכז את כל הנתונים בגיליון Excel אחד. מובהקות סטטיסטית נקבעת באמצעות מבחן t של student באמצעות תוכנה כגון Microsoft Excel או תוכנת Sigma Plot 11.0. במידת הצורך, ניתן להשוות את התוצאות לאלו שהתקבלו מניתוח פוסט-מורטם של צפיפות העצם באמצעות dual energy x-ray absorb geometry, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לשיטה זו.
ניתן לזהות באמצעות השיטה לעיל את אובדן צפיפות העצם היחסי בשוק ובירך של עכבר לאחר פגיעה בחוט השדרה, בהשוואה לעכברים נאיביים. איור זה מראה אובדן בצפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה בחלק הפרוקסימלי של השוק, 10, 20, 30 ו-40 ימים לאחר הפגיעה. בהשוואה לקבוצת ביקורת נאיבית תואמת גיל, נצפתה ירידה משמעותית של 12% בצפיפות העצם של השוק כבר לאחר 10 ימים, עם אובדן של עד 15% בצפיפות העצם ביום ה-40.
כאן אנו רואים ירידה בצפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה בפמור הפרוקסימלי, 10, 20, 30 ו-40 ימים לאחר הפגיעה. בהשוואה לקבוצת ביקורת תואמת גיל, נצפתה ירידה של 7% בצפיפות העצם בפמור הפרוקסימלי ביום ה-40 לאחר הפגיעה. גרף זה מציג את הירידה בצפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה בפמור הדיסטלי 10, 20, 30 ו-40 ימים לאחר הפגיעה.
בהשוואה לקבוצות ביקורת נאיביות תואמות בגילן, ניתן היה להבחין באובדן צפיפות עצם בחיצונית הפמור כבר 10 ימים לאחר הפציעה, ומצב זה נשמר לאורך יתרת הניסוי. תמונה מייצגת זו של נתוני גאומטריית קרן-X באנרגיה כפולה (dual energy x-ray abor geometry) מציגה את פלט תוכן המינרלים בעצם וצפיפות המינרלים בעצם. הפמור שהוצאו נותחו 40 ימים לאחר פגיעה בחוט השדרה.
כדי להשוות את יעילות השיטה המוצגת בפרוטוקול זה לשיטות אחרות הזמינות כיום, איור זה מציג ניתוח גאומטריה של תוכן מינרלי בעצם בגרמים בירך של עכברים עם פגיעה בחוט השדרה באמצעות ספיגת קרני רנטגן באנרגיה כפולה (dual energy x-ray absorption), 40 ימים לאחר הניתוח, בהשוואה לקבוצת ביקורת תמימה תואמת גיל. נצפה אובדן משמעותי של 12% בתוכן המינרלי של העצם בעכברים עם פגיעה בחוט השדרה בהשוואה לקבוצת הביקורת.
כאן אנו רואים ניתוח גיאומטריה של צפיפות מינרליים בעצם במיליגרם לסנטימטר רבוע (mg/cm²) בשיטת dual energy, extra abor, בירך של עכברים עם פגיעה בחוט השדרה, 40 ימים לאחר הפגיעה, בהשוואה לעכברים נאיביים תואמי גיל. אובדן צפיפות המינרלים בעצם לא השתנה באופן מובהק, אך הראה מגמה דומה לזו של תוכן המינרלים בעצם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע זאת בתוך 20 עד 30 דקות, אך זכרו כי חשוב למקם את הגפיים האחוריות בצורה נכונה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה כיצד לבצע הערכה אורכית של צפיפות העצם בבעלי חיים חיים לאחר פגיעה בחוט השדרה, באמצעות מכשיר ה-Caliper Instruments Lumina XR.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית לגילוי ולכימות של אובדן צפיפות עצם בגפיים האחוריות של עכברים בעקבות פגיעה בחבל השדרה. באמצעות דימות בקרני X במינון נמוך, חוקרים יכולים לעקוב אחר שינויים לאורך זמן, אשר חושפים אובדן עצם משמעותי בטיביה (שוקם) ואובדן מאוחר יותר בפמור (ירך).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- בריאות העצם
- טכניקות דימוי
רקע
- פגיעות בחבל השדרה מובילות לעיתים קרובות לאוסטאופורוזיס.
- אובדן צפיפות העצם עלול להשפיע באופן משמעותי על ההחלמה ועל איכות החיים.
- שיטות דימות נוכחיות עשויות שלא לספק רזולוציה זמנית מספקת.
- דימוי באמצעות קרני X במינון נמוך מציע חלופה מבטיחה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכה אורכית (longitudinal) של אובדן צפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה.
- הבנת מנגנוני האוסטאופורוזיס במודלים של פגיעה בחוט השדרה.
- הערכת התערבויות פוטנציאליות למניעת אובדן מסת עצם.
שיטות שהשתמשו בהן
- ביצוע פגיעת חיתוך של חוט השדרה בעכברים תחת הרדמה.
- דימות רנטגן שבועי של עצמות הגפיים האחוריות למשך 40 ימים.
- ניתוח תמונה לכימות שינויים בצפיפות העצם.
- הערכה לאחר המוות של עצמות שהוצאו לצורך תיקוף.
תוצאות עיקריות
- נצפתה אובדן עצם משמעותי בטיביה לאורך כל המחקר.
- אובדן עצם בפמור נצפה החל מ-40 ימים לאחר הפגיעה.
- השיטה מאפשרת מעקב מפורט אחר שינויים בצפיפות העצם.
- יישומים פוטנציאליים מתרחבים למצבים אחרים המשפיעים על צפיפות העצם.
מסקנות
- שיטת דימות חדשנית זו מספקת תובנות לגבי אוסטאופורוזיס המושרה על ידי פגיעה בחבל השדרה.
- היא מאפשרת לחוקרים ללמוד את התקדמות אובדן העצם לאורך זמן.
- מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בגישה זו כדי לבחון התערבויות טיפוליות חדשות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה אורךית של אובדן צפיפות העצם במודלים פרה-קליניים מאפשרת הפחתת סיכונים מנגנונית של טיפולים באוסטאופורוזיס. שיטה זו תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות על ידי כימות שינויים תלויי-זמן בצפיפות העצם של הגפיים האחוריות בעקבות פגיעה בחוט השדרה. היא מספקת ביטחון חזוי להערכת התערבויות שמטרתן למנוע או להפוך אובדן עצם באוכלוסיות עם חוסר ניידות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למנגנוני אובדן צפיפות העצם לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI).
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות מדידות אורכיות וכמותיות של BMD ו-BMC.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי מטרות בעלות השפעה מדידה על שימור העצם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקת תרכובות באמצעות הדמיית קרני X רב-שחזורית במינון נמוך.
- פלט כמותי: הפקה של קריאות BMD ו-BMC סטנדרטיות המאפשרות הערכה מהימנה של התרכובות לאורך נקודות זמן שונות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מספקת יכולת הדמיה אורכית הניתנת להרחבה וניתנת ליישום במודלים שונים של אובדן עצם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אוסטאופורוזיס המושרה על ידי SCI עם התאמה תרגומית לאובדן עצם תת-נגעי באדם.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני באמצעות ניטור רציף של צפיפות העצם in vivo.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go על בסיס מסלולי אובדן עצם ארוכי טווח ויעילות ההתערבות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה חוזרת, in vivo, של שינויים בצפיפות העצם לאורך זמן.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות התקדמות אובדן העצם בשוקיים ובירכיים לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI).
- סריקה: מבטיחה שחזוריות של הבדיקה ורגישות כמותית לזיהוי פנוטיפים של אובדן עצם מוקדם (שוק, יום 10) ומאוחר (ירך, יום 40).
- אנליטיקה: מספקת מדידות עצימות מבוססות ROI ונתונים הניתנים לייצוא לקובץ CSV לצורך השוואה סטטיסטית באמצעות מבחני t.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות אישור DXA לאחר המוות של אובדן BMC שהתגלה במערכת IVIS Lumina XR (12% ביום 40).
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמת הדמיה אורכית הניתנת לשימוש חוזר עבור מודלים של אוסטאופורוזיס, אטרופיה עקב חוסר שימוש ואובדן עצם הקשור לגיל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות נתונים של אובדן צפיפות עצם, הרלוונטיים מבחינה מכניסטית ובעלי רזולוציית זמן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ודימות אורך (longitudinal) במינון נמוך על פני קבוצות נבדקים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת אי-הוודאות הביולוגית במדדי יעילות העצם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות המותאם לסיכון, בהתבסס על פרופילי שימור עצם לאורך זמן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכרסמים, בניתוחים של פגיעות בחוט השדרה ובדימות של בעלי חיים חיים.
- תלוי במכשור IVIS Lumina XR עם יכולת קרני X באנרגיה נמוכה ותוכנה לניתוח ROI.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי דימות, משטרי הרדמה והגדרות ROI של אזורי העצם.
- כולל שיקולי התאמה עבור אזורי עצם שונים (tibia לעומת femur) ומודלים של פגיעה מעבר ל-SCI.
- מוגבל על ידי הצורך בתיקוף לאחר המוות ובעקביות פוטנציאלית במיקום בעלי החיים ובהחלמתם.
