הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הכנת הדגימות הביולוגיות לחיתוך והדמיה תחת מיקרוסקופ סריקת קצה הסכין, או KESM והדמיה של נתוני ערימת התמונות המתקבלות. זה מושג על ידי קיבוע, צביעה והטמעה של הרקמה כדי להכין אותה להדמיה תחת KESM. השלב השני של ההליך הוא הגדרת ה-KESM וביצוע חתכים והדמיה באמצעות תוכנת הבקרה האוטומטית.

לאחר מכן, התמונות המתקבלות נרשמות ונחתכות. השלב האחרון הוא לטעון ולחקור את מערכי הנתונים באטלס מבוסס אינטרנט ותוכנת הדמיה תלת מימדית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את רמת המוח השלם, הארגון העצבי וכלי הדם ברזולוציה תת-מיקרומטרית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני Mesos קיימים, כגון אלקטרומיקרוסקופיה סורקת בסיס בלוק טורי, הוא שהיא יכולה לצלם נפחים גדולים בהרבה, אם כי ברזולוציה נמוכה יותר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הקונקטומיקה ומדעי המוח בכלל. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הארגון המבני של המוח, וניתן ליישם אותה גם על מערכות איברים אחרות כמו הריאות והכליות.

כדי להתחיל בהליך הזה, מוח העכבר המנותח מונח בצנצנת זכוכית שמכילה תמיסת גולגי קוקס. הניחו את צנצנת הזכוכית בקופסה אטומה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 16 שבועות. אין צורך בשלב קיבוע נפרד מכיוון שפתרון גולגי קוקס פועל כקיבוע.

לאחר 10 עד 16 שבועות, שטפו את המוח במים נטולי יונים למשך הלילה בחושך למחרת, טבלו את המוח השטוף בתמיסת אמוניום הידרוקסיד 5% במים נטולי יונים במשך שבעה עד 10 ימים בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר שבעה עד 10 ימים, שטפו את המוח שוב במים נטולי יונים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. לאחר מכן ייבשו את המוח באמצעות סדרה מדורגת של אלכוהולים אתיליים, והשאירו אותו בכל תמיסה למשך 24 שעות, 50% אתנול ו-70% אתנול בארבע מעלות צלזיוס ו-85% אתנול.

שלושה שינויים של 95% אתנול וארבעה עד חמישה שינויים של 100% אתנול בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכניסו את המוח המיובש לאצטון ובצעו שלושה עד ארבעה שינויים כל אחד למשך יום אחד. לאחר מכן, הכניסו את המוח למשך הלילה למקרר בכל אחת מתערובות האצטון הללו עם יחס aite לאצטון של אחד לשניים, אחד לאחד ושניים לאחד.

לבסוף הכניסו את המוח למקרר ב-100%, בצעו שלושה שינויים בכל פעם בלילה. לאחר מכן המוח המטופל מוטמע ב-100% אט ומחומם ל-60 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. לבסוף, גוש הדגימה הנרפא מותקן על טבעת דגימת המתכת, תוך שימוש באפוקסי וצידי הבלוק גזומים לפי הצורך כדי להתחיל בהליך זה.

ודא שהעכבר מורדם עמוק ואינו מגיב לצביטה בבוהן. לאחר מכן העבר את העכבר בלבביות באמצעות מלח פוספט חוצץ בטמפרטורת החדר, ואחריו 4% פוספט קר פרה-פורמלדהיד. לאחר מכן, יש לחלחל את העכבר בתמיסה של 0.1%thi ולצבוע במים נטולי יונים.

לאחר מכן, הכניסו את הגופה למקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הוציאו את המוח מהשוק והניחו בתמיסה טרייה של 0.1% תיונין. השאירו את המוח בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.

לאחר שבעה ימים, עצרו וייבשו את המוח באמצעות סדרה מדורגת של אלכוהולים אתיליים. במשך תקופה של שישה שבועות, שלושה עד חמישה ימים ב-50% אתנול, שבעה עד 10 ימים ב-70% אתנול כשבועיים כל אחד ב-85% ו-95% אתנול, ובשאר הזמן ב-100% אתנול. לאחר שלושה שינויים של אצטון בטמפרטורת החדר, המוח מוטבע בפלסטיק מלומד בתנור של 60 מעלות צלזיוס.

כדי להתחיל בהליך צביעת רשת כלי הדם בדיו הודי, ודא על ידי היעדר רפלקס נסיגת הבוהן שהעכבר מורדם עמוק. לאחר מכן העבר את העכבר בלבביות באמצעות מלח פוספט חוצץ בטמפרטורת החדר, ואחריו טמפרטורת החדר, פורמין ניטרלי של 10%. זלוף כל הגוף עם מי מלח וקיבוע נחוץ כדי לנקות את הדם ממערכת הלב וכלי הדם ולתקן את הרקמות.

לאחר מכן, הפעילו את העכבר עם 3.0 סמ"ק של זילוף דיו הודי לא מדולל. עם דיו בהודו יש צורך למלא לחלוטין את כלי הדם של מערכת הלב וכלי הדם. לאחר הסרתו מהעכבר, המוח שנוצר מיובש באמצעות סדרה של אלכוהולים אתיליים מדורגים ולאחר מכן מוטמע בפלסטיק מלומד.

בהתאם לפרוטוקול שהוצג קודם לכן כדי להגדיר את ה-KESM להדמיה, הפעל את המצלמה, התאורה והבמה, הרם את הסכין והמטרה. לאחר מכן, התקן את טבעת הדגימה. ואז הורד את המטרה והסכין.

מדוד את מידות הדגימה. לאחר מכן צור קובץ תצורה עבור בקר השלב של KESM. שני יישומים, הרם את הסכין ואת מטרת ה-KESM לפני אתחול השלב.

הפעל את בקר השלב של KESM שניים ואתחל את השלב. לאחר מכן הורד את הסכין והמטרה והפעל את המשאבה. מקד את המטרה והמצלמה על ידי סיבוב כפתור המיקוד על הרכבת האופטית והתאמת שדה המצלמה view ביחס לקצה הסכין.

לחץ צעד אחר צעד כדי לבדוק את השלבים הראשונים של ההדמיה והחיתוך. לאחר מכן לחץ על go. ליזום הדמיה וחתך לעיבוד תמונה.

הפעל את מעבד המחסנית של KESM כדי להסיר חפץ תאורה ולנרמל את עוצמת הרקע בכל התמונות. חזור על הפעולה עבור כל תיקיות המשנה של הנתונים. כדי להמחיש נתונים באמצעות אטלס המוח של KESM, עבור לאתר זה ובחר את האטלס המתאים כדי להגיע לעומק אחר.

בחר מהתפריט הנפתח, כמה עמוק ללכת בכל שלב, ולאחר מכן לחץ על פלוס כדי להגדיל או מינוס כדי להקטין את עומק Z. אפשרויות אחרות כוללות התקרבות או ניווט באמצעות אטלס המוח של KESM. השתמש בתפריט הנפתח כדי לכוונן את מספר שכבת-העל ואת מרווח הזמן של שכבת-העל כדי להציג נתונים באופן חזותי באמצעות מעבדת VIS.

הפעל את היישום, צור פרויקט חדש. הפרויקט צריך לכלול חיבור תלת מימד מקבצי דו-ממד, הגדרת מטריצת עולם, אריתמטיקה אחת וצפייה בתלת מימד מחוברת. בסדר זה, יש להגדיר פרמטרים מתאימים כפי שמוצג בתצוגה תלת מימדית תוך לחיצה על לחצן העכבר הימני.

הזז את העכבר כדי להתאים את אזורי הסף שניתן לחתוך. הכיוון השתנה, התאורה השתנתה, או שהרקע נדלק או כבוי. תוצאות מייצגות של KESM מומחשות על ידי קטעי הווידאו הבאים המוצגים תחילה הם הדמיות נפח של KESM, ערימות נתוני דיו שלמות של Brain India עבור מערך הנתונים של כלי הדם, החל מקרוב של נתוני כלי הדם ברוחב של כ-100 מיקרון.

הסרטון השני הזה של KESM, נתוני דיו שלמים של Brain India מציג שלוש תצוגות סטנדרטיות של כל כלי הדם במוח העכבר, צוללות שנדגמו מנתונים ברזולוציה גבוהה ברוחב של כ-10 מילימטרים. הנוף הסגיטלי, הנוף העטרתי והנוף האופקי, כמו גם זבוב של החלק העטרתי. קזם. נתוני גולג'י של עכבר מוח שלם מומחשים בסרטון וידאו זה המציג זבוב לאורך שלושת מישורי החיתוך השונים, החל מתצוגת הבלוק, ואחריה התצוגה הסגיטלית, המבט העטרתי והתצוגה האופקית.

הפרטים הבאים של נתוני GoGy של עכבר המוח השלם של KESM מוצגים. סרטון הווידיאו הראשון הזה הוא של תאי המוח הקטן והפורקינג'ה. הסרטון השני הזה מראה את קליפת המוח ותאי הפרה-מתכת.

לבסוף, KESM. נתוני nle של המוח כולו מומחשים בשני קטעי הווידיאו הללו. תחילה מוצג תקריב של נתוני NLE.

הסרטון השני הזה מציג שלוש תצוגות סטנדרטיות של כל תת-הנתונים של Nle במוח העכבר שנדגמו מנתונים ברזולוציה גבוהה. חתך מוצג גם לתצוגה ברורה של המבנים הפנימיים לאחר התפתחות זו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור רשתות עצביות וכלי דם במוח העכבר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה של הכנת דגימות, הדמיה וניתוח נתונים עבור מיקרוסקופ סריקת קצה הסכין.