Name: Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו כיצד לבודד ולכסות תאי שריר לב ניאונטליים של עכברושים בהידרוג'ל פיברין לצורך הנדסת רקמות לב. השיטה מאפשרת הערכת כוח התכווצות ויכולת הישרדות התאים במודל מלאכותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים - הלאומי ללב, ריאות ודם המכון (פרס # R00HL093358 כדי LDB).

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנקפסולציה של עכברוש cardiomyocytes בילוד בתוצאות הפיברין ג&#39;לים ב עקבית ובת קיימא תלת מימדי במודל מבחנה של מערכת שריר הלב. הפיברין הוא ביולוגי העדיפו כי כאשר תאים בפח, הם פעילים מבחינה מטבולית ומסוגלים הדחיסה, שיפוץ מחדש תאי מטריקס העולה בקנה אחד עם רקמת לב יליד 12. מכיוון שאנו מאפשרים cardiomyocytes כדי ליישר את עצמם בסביבה זו, הפונקציונליות שלהם אופיינית יותר של שריר הלב וכתוצאה מכך צמצום כוח גדול יותר בהשוואה לרקמות איזוטרופיים 6. עבור לפוטנציאל הריפוי, יש צורך לתמצת תאים בתוך חומר שמקדם הן כדאיות ופונקציונליות. הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים אמצעי יעיל ומדויק ליצירת רשת הפיברין לשלוט בהתנהגות התא לב ב microenvironment תלת ממדי. כמה בעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר במהלך היצירה והתרבות של המבנים הללו. נושא אחד הוא פוטנציאל החזקת כדאיות התא לפני אנקפסולציה, אשר השפיעו באופן משמעותי על הפונקציונליות של לבנות. מאמץ צריך להיעשות כדי להגביל מוות של תאים בעקבות הבידוד ידי צמצום הזמן בין בידוד לבין אנקפסולציה של תאים בתוך הג&#39;ל הפיברין. בונה יש לספק תקשורת בכל יום אחר בלוח זמנים קפדני. בנוסף, חשוב לוודא הומוגניות בתוך כל הפתרונות בשימוש. אם תערובת של פיברינוגן, תרומבין ותאי מייצרת בסביבה הטרוגנית, היכולת של התאים לשפץ את ECM, מכנית הזוג חוזה חסום פוטנציאלי. חשוב גם כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר במהלך הזריקה של מבנים על מנת למנוע הפרעות ברצף של הרקמה מהונדסים. אחת הדרכים להקל על בעיה זו היא למשוך ג&#39;ל יותר נדרש כדי להפוך את לבנות לתוך המזרק ולהזריק לאט. לבסוף, לאחר מטריקס הפיברין קבע ומאז בינוני התרבות במשך 24 שעות, חיוני לנתק את לבנות מן הצדדים של עובש את הטבעת על מנת לקדם את הדחיסה מבוססי תאים של הג&#39;ל הפיברין. שמירה על מבנה באמצע התבנית מקלה גז חילופי מזין. דבקות הצדדים של עובש את הטבעת עשויה גם לשבש את מערך הסלולר הרצוי. חשוב לציין כי עריפת ראש מודע משמש שיטת euthanization בפרוטוקול זה, אשר מהווה שיטה מקובלת לפי הנחיות משני המכונים הלאומיים לבריאות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית. עם זאת, מוסדות מסוימים ממליצים להשתמש הרדמה ואחריו עריפת ראש לחולדות הילוד. בחרנו עריפת ראש מודע כי זה מבטיח את כמות מזערית של זמן, בתנאים של חוסר חמצן ברקמות הלב / תאים נכרת. כמויות קטנות יחסית של חוסר חמצן עלולה להוביל myocyte איסכמיה ומוות myocyte פוטנציאל, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות של פרוטוקול זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> אשלגן כלורי </td><td> סיגמא </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> סודיום פוספט dibasic </td><td> סיגמא </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> אשלגן זרחתי monobasic </td><td> סיגמא </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G5400 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91308-12 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> קנס פינצטה </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11251-20 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> מספריים גדול </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91401-14 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> מיקרו מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 91501-09 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> אזמל לטפל </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 10008-13 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> אזמל להב </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 08-918-5A </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> הספסל סופגים underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> סטרילי וילון </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> GM42526 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> החיטוי שקית </td><td> דיג </td><td> 01-812-54 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> גזה כרית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-761-52 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> בבטאדין </td><td> פרדו מוצרים </td><td> 67618-150-01 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> כפפות סטריליות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 19-020 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> להעביר פיפטה סטרילית </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 9962 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> collagenase </td><td> וורטינגטון </td><td> CLS2 </td><td> בדידות </td></tr><tr><td> מוט טפלון 1 / 4 אינץ&#39; קוטר </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 8546K11 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> טפלון מזהה צינור 1 / 4 אינץ&#39;, OD 1 / 2 אינץ </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 8547K31 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> סיליקון O-Ring 1 / 4 אינץ&#39; מזהה, OD 1 / 2 אינץ </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 9396K204 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> צינור טפלון 1 / 4 מזהה אינץ&#39;, 5 / 16 אינץ&#39; OD </td><td> מקמאסטר-קאר </td><td> 52355K14 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> קנדל מזרקים monoject 6cc </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-561-41 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> BD מזרק 3cc </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 309585 </td><td> עובש חלק </td></tr><tr><td> שור פיברינוגן </td><td> סיגמא </td><td> F8630 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> שור טרומבין </td><td> סיגמא </td><td> T7513 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H0887 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> סיגמא </td><td> P2443 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> 383147 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> 0.2 מיקרון המסנן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SCGVT05RE </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> תא strainers 40 מיקרון </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 22-363-547 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> 0.45 מיקרון גבי הבקבוק מסנן </td><td> קורנינג </td><td> 430627 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> זכוכית מראש מסנן </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 אינץ מחט ארוכה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-826-5D </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> 21G 1 אינטש מחט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-826C </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> לבנות צנצנות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 2116 </td><td> לבנות </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> סוס בסרום </td><td> סיגמא </td><td> H1138 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> aminocaproic חומצה </td><td> Acros אורגניקס </td><td> 103305000 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A5960 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I9278 </td><td> מדיה </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 16% </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 15710 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר) </td><td> טד פלה </td><td> 27050 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> 2-methylbutane </td><td> דיג </td><td> 03551-4 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> עכבר MYH1/2/4/6 העיקרי נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטכנולוגיה </td><td> SC-32732 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> הארנב Connexin 43 נוגדן ראשוני </td><td> תא האיתות טכנולוגיה </td><td> 3512 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> Dylight 549-מצומדות אנטי עכבר חמור משני הנוגדנים </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות </td><td> 715-505-151 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> Dylight 488-מצומדות Donke נגד ארנב משני הנוגדנים </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות </td><td> 711-485-152 </td><td> היסטולוגיה </td></tr><tr><td> חי / מת assay </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> אנליזה </td></tr></tbody></table>

encapsulation של cardiomyocytes ב hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

תאים culturing בסביבה תלת מימדית הידרוג&#39;ל היא טכניקה חשובה לפיתוח בונה עבור הנדסת רקמות, כמו גם ללמוד התגובות הסלולר בתנאים תרבות שונים במבחנה. סביבת תלת מימדי יותר מקרוב מחקה את מה התאים להתבונן in vivo בשל היישום של גירויים מכניים וכימיים בכל הממדים 1. תלת ממדי הידרוג יכול להיות עשוי פולימרים סינתטיים כמו PEG-DA 2 ו 3 PLGA או מספר המתרחשים באופן טבעי חלבונים כגון קולגן 4, חומצה היאלורונית 5 או 6,7 הפיברין. הידרוג שנוצרו פיברין, חלבון טבעי קרישת דם, יכול לפלמר להקים רשת שהיא חלק ריפוי הפצע הטבעית של הגוף תהליכים 8. הפיברין הוא תא מתכלה ו עצמיים פוטנציאל 9, מה שהופך אותו פיגום זמני אידיאלי עבור הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הבידוד של cardiomyocytes בילוד משלושה הישן יום גורים עכברוש והכנת התאים אנקפסולציה ב בונה הפיברין הידרוג&#39;ל של הנדסת רקמות. Myocytes ילודים הם מקור התא הנפוצות עבור במבחנה להיווצרות רקמת לב והנדסה 4. הפיברין ג&#39;ל נוצר על ידי ערבוב עם פיברינוגן האנזים תרומבין. טרומבין cleaves fibrinopeptides FPA ו FpB של פיברינוגן, חושפים אתרי הקישור כי אינטראקציה עם מונומרים אחרים 10. אינטראקציות אלה גורמים מונומרים כדי עצמית להרכיב לתוך הסיבים היוצרים את רשת הידרוג&#39;ל. בגלל העיתוי של תגובה אנזימטית זה יכול להיות מותאם על ידי שינוי יחס של תרומבין כדי פיברינוגן, או היחס בין סידן תרומבין, זריקה אחת יכולה לעצב את המבנים עם מספר גאומטריות שונות 11,12. יתר על כן אנו יכולים ליצור מערך של הרקמה וכתוצאה מכך על ידי האופן שבו אנו להגביל את הג&#39;ל במהלך התרבות 13. לאחר culturing המבנים מהונדסים ברקמת הלב במשך שבועיים בתנאים סטטי, התאים לב החלו לשפץ לבנות יכול ליצור כוח התכווצות בתנאים צעדה חשמליים 6. במסגרת פרוטוקול זה, אנו גם מתארים את שיטות לניתוח רקמות מהונדסות שריר הלב לאחר תקופת התרבות כולל ניתוח פונקציונלי של הכוח שנוצר על ידי פעילות שריר הלב לבנות על גירוי חשמלי, כמו גם שיטות לקביעת כדאיות התא הסופי (Live-המלח assay) ו מכתים immunohistological לבחון את הביטוי של חלבונים מורפולוגיה טיפוסית חשוב התכווצות (שרשרת כבדה שרירן או MHC) ו צימוד הסלולר (Connexin 43 או Cx43) בין myocytes.

אנו מתארים את הבידוד של cardiomyocytes בילוד והכנת התאים אנקפסולציה ב בונה הפיברין הידרוג&#39;ל של הנדסת רקמות. אנו מתארים שיטות לניתוח רקמות מהונדסות שריר הלב לאחר תקופת התרבות כולל כוח פעיל שנוצר על גירוי חשמלי ואת הכדאיות התא מכתים immunohistological.

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

גידול תאים בסביבת הידרוג'ל תלת-ממדית הוא טכניקה חשובה לפיתוח מבנים להנדסת רקמות וכן לחקר...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לכלוף קרדיומיוציטים של חולדות רכוש neonatal בתוך הידרוג'ל FI לצורך הנדסת רקמת לב. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד הלבבות של גורי חולדה בני יומיים עד שלושה. לאחר מכן, הלבבות מעובדים בעיכול באמצעות collagenase.כדי להפריד את תאי הלב מהמטריקס החוץ-תאי, תאי הלב מוקפסים לאחר מכן בהידרוג'ל פיברין. לבסוף, המבנים גודלים בתרבית למשך שבועיים. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי למבנים יש את היכולת להפיק כוח התכווצות (twitch force) של כ-1.3 milli Newtons בתגובה לגירוי חשמלי.בנוסף, ניתן לצפות במבנה המיושר של המבנה ההנדסי באמצעות צביעה היסטולוגית של חלבוני מיוציטים. מבנים שריריים הנדסיים יכולים לשמש כטיפול פוטנציאלי לאוטם בשריר הלב (myocardial infarction) על ידי מתן אפשרות לתיקון או החלפה של רקמה צלקתית ברקמה הנדסית, ובכך להביא לשיפור בתפקוד הלב לאחר פגיעה או מחלה. מבנים אלו יכולים לשמש כמערכת מודל in vitro בעלת ערך למחקר של השפעות גירויים שונים על כוחות התכווצות ועל התפתחות לבבית תקינה ופתולוגית.לאחר הכנת המצע והסטריליזציה של המכשירים הכירורגיים עבור כל אדם, הניחו משטח ספיגה על פני השטח של המכסה (hood) וכסו אותו בסדין סטרילי. הניחו את המכשירים הכירורגיים הסטריליים ופד גזה בגודל ארבע על ארבע על הסדין הסטרילי. ללא מגע במכשירים, פתחו להב סכין מנתחים סטרילי מספר 20 והניחו אותו על הסדין.לאחר עקירת ראשו של הגור, נגב את החזה באמצעות גזה ספוגה ב-Betadine. קיבע את הגור על ידי לחיצת השכמות יחד. בצע תורקוטומיה חלקית כדי לחשוף את הלב; הגבר את הלחץ המופעל על השכמות, דבר שידחף את הלב מעבר לצלעות.עבור נתיחה של השכמה, העבירו את להב הסכין מאחורי הלב כדי לכרות את כלי הדם הגדולים ולהוציא את האיבר. הניחו את הלב על קרח בתוך צלחת פטרי המכילה PBS glucose. לאחר בידוד הלבבות, הסירו שאריות דם ורקמה חיבורית על ידי שטיפתם ב-PBS glucose קר מאוד.הססירה את השליש העליון של כל לב, כך שיישאר השלישים התחתונים. זאת כדי לבודד את מרבית רקמת הפרוקיים בלבד, והעבר את הרקמה לצחנת פטרי נקייה עם PBS גלוקוז קר מאוד. באמצעות פינצטה ומספרי מיקרו סטריליים, קצץ בזהירות את הלבבות לחתיכות בגודל של כ-מילימטר מעוקב אחד.העבירו את הרקמה למבחנה קונית של 50 מיליליטר והסִירו את כל הבאפר למעט 10 מיליליטר. הוסיפו שבעה מיליליטר של תמיסת קולגנאז. נערערו את תערובת הרקמה והקולגנאז בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שבע דקות.בצעו פיפטינג עדין 10 פעמים כדי לפרק את חלקי הרקמה. המתינו עד שהחלקיקים ישקעו, ולאחר מכן שאבו את הנוזל והשליכו אותו. הוסיפו שבעה מיליליטרים של collagenase לחלקי הרקמה ועבדו שוב בעיכול למשך שבע דקות.בכל שלב שנותר, בצעו פיפוט עדין 10 פעמים כדי לפרק את חתיכות הרקמה. לאחר ששקעו, שאבו את העל-נוזל (supernatant) ואספו אותו. למבחנה קונית נפרדת בנפח 50 milliliter, הוסיפו שבעה milliliters של collagenase לחתיכות הרקמה ובצעו עיכול נוסף במשך שבע דקות. לכל מבחנת על-נוזל, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת עצירה (stop solution) באמצעות פיפט סרולוגי שונה לאחר כל הוספה של על-נוזל מהעיכול.להכנה של יציקות למבני ג'ל פיברין, אנא עיינו בחלק הכתוב של הפרוטוקול. הכניסו את המנדרלים שהוכנו קודם לכן לתוך מעטפות המזרקים של 6 cc, תוך שימוש במזרק של 3 cc כבוכנה כדי להשיג איטום הדוק בין טבעות ה-O לשייבות הטפלון. להכנת מיליליטר אחד של ג'ל פיברין, הכינו תמיסת F בפסולה קונית על ידי הוספה של 112 µL ממרכז הפיברינוגן ל-558 µL של HEPES בריכוז 20 mM.בופר בתמיסת סלין 0.9% בשפופרת קונית נפרדת. הכין תמיסת T על ידי הוספת 17 µL של תמיסת אם של thrombin ו-1.3 µL של תמיסת סידן נורמלית כפולה ל-135 µL של DMEM. בשפופרת קונית שלישית, סובב את התאים למטה ותing סספנד אותם לריכוז של 29.4 מיליון תאים למילליליטר, או פי שישה מהריכוז הסופי הרצוי של התאים במבנה.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בשלב ייצור המבנה. לאחר ערבוב תמיסות הפיברינוגן והתרומבין, הפולימריזציה של הפיברין מתרחשת במהירות. לכן, יש לעבוד במהירות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית תוך מניעת הכללה של בועות אוויר בתוך ההידרוג'ל בעת ההזרקה לתבנית היציקה.בעת ההגעה לשלב יציקת מבנה ג'ל הפיברין, הכינו מזרק של 1 ml עם מחט במידה 18 gauge ובאורך של 1.5 אינץ'. הכינו בנוסף מחט במידה 21 gauge ובאורך של 1 אינץ'. להכנת 1 ml של תמיסת ג'ל פיברין, הוסיפו 667 µL של תמיסת F לתוך מבחנה לצנטריפוגה של 50 ml, ולאחריה 167 µL של תמיסת תאים.ולסיום, 167 µL מתמיסת T. יש להעביר את התערובת בפיפט בזהירות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. בשלב זה התגובה כבר החלה, ויש לבצע את הזרקת הקונסטרוקט באופן מיידי.השתמש במזרק ובמחט בכי মাপ 18 ושאב את תמיסת הפיברין. הקפד לא להפוך את המזרק כדי למנוע חדירת בועות אוויר למחט. החלף את המחט בכי মাপ 18 במחט בכי মাপ 21.הקישו בעדינות על המזרק כדי להוציא בועות אוויר. לאחר מכן, הכניסו את המזרק לתבנית בין הפקקים, תוך מעקב אחר החריץ בטבעת ה-Teflon O-ring, והזריקו את התמיסה אל התבנית. הטו את התבנית כדי להבטיח מילוי מלא.לאחר מכן מלאו את שאר התבניות. עטפו את התבניות ב-para film בקבוצות של שלוש, והניחו אותן באינקובטור או בתנור בטמפרטורה של 37 °C. דגרו את הג'לים למשך 20 דקות כדי לאפשר לפיברין מספיק זמן להבמיא (polymerize) באופן מלא.מלאו כל צנצנת תרבית ב-21 milliliters של מצע לבניית שריר לב (myocardial construct medium) עבור כל בנייה. השתמשו במעטפת מזרק סטרילית של 3 cc כבוכנה כדי לדחוף את המנדרל עם הבנייה אל תוך צלחת פטרי גדולה עם DMEM. לאחר מכן, העבירו את הבנייה אל צנצנת הדגימה.דגרו את הצנצנות בטמפרטורה של 37 °C למשך שבועיים. כדי להתחיל בניתוח של תסבך פיברין, חברו את תליבכי התנימים מהכבל המגיע מהמעורר אל החוטים של האלקטרודות באמבטיה. הפעילו את לוח רכישת הנתונים, מחולל הפולסים ומתמר הכוח.הגדירו את חיישן הכוח להגדרה של 5G ואפסו אותו. פתחו תוכנת LabVIEW מותאמת אישית המציגה ושומרת את הנתונים מחיישן הכוח. צרו קובץ טקסט ריק חדש בתיקיית הנתונים עבור כל דגימה. באמצעות פינצטה, הסירו את המבנה מתמיכת המנדריל על ידי החלקה עדינה של טבעת המבנה מהתמיכת טפלון והנחתה על העמוד המתכתי הקבוע במערכת למדידת כוח.אמבט מדיום. השתמשו בפינצטה כדי לדחוף ולהרים את המבנה (construct) מסביב למוט של מתמר הכוח. הניחו את הקצה השני של המבנה על זרוע המתמר והדקו עד לקבלת קריאה במתמר.כוח G של 1.0 על המעורר הלבבי. הגדר את מתח הפולס ל-20 volts, את משך הזמן ל-six milliseconds ואת הקצב ל-one hertz. התחל את הקצביות החשמלית על ידי לחיצה על כפתור הפסקה/הפעלה של הפלט (output on off).התחילו בהקלטה עד שצורת הגל תהיה סדירה. נתחו את צורת הגל ב-MATLAB כדי לקבוע את קצב כוח הכיווץ וקצב ההרפיה. מבנה הפיברין של התאי השריריים של הלב (cardiomyocyte) מכסה בתחילה את כל רוחב התבנית.לאחר שבועיים של תרבית, המבנה מתכווץ לכחומש בקירוב מרוחבו הראשוני. קצב חשמלי של המבנה מייצר נתוני כוח התכווצות (twitch force) כפי שמוצג כאן. צפויים כוחות התכווצות של כ-1.3 millinewtons.חיוניות התאים של המבנה תלויה במרחק התאים מהשטח של המבנה שבא במגע עם מדיום התרבית, וזאת בשל מגבלות הדיפוזיה של חמצן אל תוך המבנה. על פני השטח של המבנה, נצפתה חיוניות תאים גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. המבנה המסודר של המבנה נצפה על ידי צביעה של myosin heavy chain באדום; Connexion 43, הנחוץ לצימוד תאים בין מיוציטים, מופיע בירוק.לאחר רכישת המיומנות, הפרוטוקול המלא אמור לארוך כחמישה שעות. חלק הבידוד יארך כשלוש שעות, בעוד שחלק בניית המבנה יארך כשעתיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד שהמחט תופנה תמיד כלפי מטה כדי למנוע חדירת בועות אוויר אל רשת הפיברין.בנוסף, הטיית התבנית תבטיח שחור המחט יישאר תמיד בנקודה הגבוהה ביותר במהלך ההזרקה, מה שיבטיח שכיבוב התבנית יתמלא באופן מלא בתמיסת הפיברין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע להבנה טובה של אופן הכליאה של קרדיומיוציטים בתוך הידרוג'לים של פיברין בצורת טבעת, על ידי בידוד ראשוני של הקרדיומיוציטים מחולדות רטאיים רצופות, ולאחר מכן הזרקת תמיסת הפיברין לתוך תבניות גליליות בעלות הרכבה פשוטה.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

שיטות להכנת ג'ל מטריצה ​​בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב...

ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

פרוטוקול זה נועד להקל על המגבלה של השתלת תאים לקויה לטיפול בתאי גזע באוטם שריר הלב באמצעות שימוש במערכת הידרוג'ל ודבק מבוסס פיברין. בגישה זו, ניתן לשמור על מגע בין תא לרקמה לאחר אוטם, מה שמגדיל את הפוטנציאל הטיפולי של גורמים מועילים באתר הפציעה.

Hydrogel לבנות והפיברין מבוסס גישת דבק כדי לספק Therapeutics באוטם שריר הלב דגם Murine.

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

במסמך זה אנו מציגים שיטה מהירה, נתיישב ועלות נמוכה בדיית בתבניות polydimethylsiloxane מותאם אישית יכול לשמש לייצור המבוסס על הידרוג רקמות מהונדסים עם לסימולציה. בנוסף, אנו מתארים תוצאות הערכות מכני, היסטולוגית שנערכו על רקמות הלב מהונדסים המיוצר בעזרת טכניקה זו.

מותאם אישית מהונדסים תרביות רקמה בתבניות של מאסטרים נחרטו לייזר

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

טיפול מבוסס תאי גזע התפתח כאסטרטגיה יעילה לתיקון רקמות לב פגועות לאחר אוטם שריר הלב. אנו מספקים יישום vivo אופטימלי להשתלת תאי גזע באמצעות הידרוג'לים ג'לטין המסוגלים להיות מקושרים אנזימטית.

השתלה תוך-שרירית של הידרוג'ל להזרקה בטעינת MSC לאחר אוטם שריר הלב במודל מורין

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למדו כיצד לבודד ולכסות תאי שריר לב ניאונטליים של עכברושים בהידרוג'ל פיברין לצורך הנדסת רקמות לב. השיטה מאפשרת הערכת כוח התכווצות ויכולת הישרדות התאים במודל מלאכותי.

Encapsulation של cardiomyocytes ב Hydrogel הפיברין עבור הנדסת רקמות לב

גלה סרטונים נוספים