יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם
9 ביולי 2012
העיצוב של התוכנית של יום אחד פשוט העבודה עבור אבחון פתוגן חיידקי מאפשרת זיהוי מהיר של זיהומים בדם. הכללת שמונה מטרות חיידקים רלוונטיות קלינית ופרופילים אנטיביוטיות ההתנגדות שלהם מציע תובנה המטפל הראשוני באותו יום, מה שעלול להוביל טיפול הולם יותר.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולהעריך את הרגישות לאנטיביוטיקה של בידודים מתרביות דם בזמן קצר יותר מאשר בשיטות קונבנציונליות. דבר זה מושג תחילה על ידי זיהוי הבידוד מתרבית הדם, באמצעות בדיקת MultiPro PCR חדשנית ל-16 s ribosomal DNA.
לאחר מכן, מדגריים את הבידוד עם פאנל של אנטיביוטיקה למשך שש שעות. השלב הבא הוא קביעת הצמיחה או עיכוב הצמיחה של הבידוד בנוכחות האנטיביוטיקה באמצעות בדיקת 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R כמותית. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן להגיע לזיהוי ולבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של בידוד מתרבית דם במהירות רבה יותר באמצעות שילוב זה של תרבית ו-PCR.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו המשתמשות במערכות phoenix או IIC אוטומטיות, הוא שאין צורך במצב תרבית מוקדם, ותוצאות הזיהוי ובדיקת הרגישות לאנטיביוטיקה יכולות להיות זמינות בתוך אותו היום. את ההליך יעמידו Vandy Hanson ו-GID, סטודנטים לדוקטורט מהמעבדה שלנו. דללו 100 µL של תרבית דם חיובית לצמיחה מיקרוביאלית בתוך מבחנה המכילה 900 µL של 0.9% sodium chloride. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,400 ×g למשך חמש דקות כדי לשקיע את החיידקים לאחר הסבוב.
ריס, השעה את המשקע ב-100 µL של מים דמינרליים סטריליים. שמור את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש הבא. לאחר שכל הדגימות יהיו מוכנות, הכן את תערובות התגובה של real-time PCR להגברה של DNA ריבוסומלי 16s ספציפי מהחיידקים הרלוונטיים.
השתמשו במים דמינרליים כדי להביא את הנפחים ל-20 µL לכל תגובה. חלקו 20 µL מתערובת ה-PCR לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של דגימה לכל באער ואטמו את לוח ה-PCR.
בשלב הבא, הרץ את ה-PCR במערכת ה-A BI Prism 7, 900 HT real-time PCR. כדי לנתח את התוצאות עם סיום ה-PCR, השתמש תחילה בלשונית הגדרות הניתוח (analysis settings) כדי להתאים את ניתוח ה-CT ל-0.1. לאחר מכן, צמצם את הגדרות קו הבסיס (baseline) כך שיתחילו במחזור 6 ויסתיימו במחזור 15. רשום את ערך ה-CT עבור כל דגימה.
ניתן להגדיר בדרך כלל את ערך הסף שמעליו תחשב תוצאת PCR כחיובית כערך CT של 35. בדוגמה זו, מוצג פרופיל הזיהוי של תרבית דם נגועה ב-e coli בשתי תערובות תגובה. נעשה שימוש בפריימרים אוניברסליים ל-16 s ribosomal DNA, אשר הניבו שתי עקומות הגברה של CT 25.2 ו-25.95.
עקומת ההגברה השלישית נגזרת מהגשש הספציפי ל-Coli. גששים ספציפיים אחרים לא יצרו אותות שניתן לזהותם. לאחר זיהוי הפתוגן, ניתן לבצע בדיקת אנטיביוטיקה.
התחילו בהעברה של חמישה מיליליטר של מצע נוזלי מתרבית דם חיובית אל מבחנה עם ג'ל מפריד סרום. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 2000×g למשך 10 דקות; לאחר הסבוב, השליכו את הנוזל העליון מהמבחנה. לאחר מכן, באמצעות מקלון צמר סטרילי, העבירו את החיידקים משכבת הג'ל של המבחנה אל 0.9% sodium chloride עד לקבלת תמיסה בעכירות של תמיס McDonald 0.5.
ערך זה מקביל לכ-1.5 × 10⁸ יחידות יוצרות מושבות (colony forming units) למיליליטר. לאחר מכן, דללו את התרחופיה במצע Muller Hinton Two broth בריכוז כפול כדי להגיע לריכוז של כ-5 × 10⁵ יחידות יוצרות מושבות למיליליטר.
העבירו מזיקה (Aliquot) של 50 µL לבערך לכל באר של התרחיף לפלטת מיקרוטיטר (microtiter plate) המכילה כבר 50 µL לבערך לכל באר של מבחר אנטיביוטיקה. הקפידו לכלול בקרות צמיחה חיוביות לכל דגימה באמצעות בארים עם מים במקום אנטיביוטיקה. כסו את הפלטה בסיום הפעולה.
לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות כדי לאפשר צמיחה בקטריאלית. הקפידו לשמור מנה (aliquot) מהסספנסיה הבקטריאלית בטמפרטורה של 4 °C כביקורת לצמיחה שלילית. לאחר דגירה של שש שעות, העבירו את התוכן של כל באר ואת דגימת הביקורת השלילית לשפופרות סטריליות נפרדות.
לאחר צנטריפוגציה של חמש דקות ב-16,000 ×g, הסירו 80 µL מהנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקעים (pellets) ב-80 µL של מים דמינרליזים סטריליים. דללו את הדגימות ביחס של 1:10 במים לפני השימוש בהן עבור real-time PCR של 16s ribosomal DNA.
הכינו את תערובת ה-PCR באמצעות IQ cyber green super mix ופריימרים ל-16 s ribosomal DNA, וחלקו 20 µL לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL מכל דגימה לבאערים ואטמו את הלוח.
בשלב הבא, בצעו את ה-PCR כדי לנתח את התוצאות. ראשית, חשבו את ערך ה-CT של נקודת החיתוך (cutoff). באופן כללי, ה-cutoff CT שווה ל-CT של בקרת הצמיחה החיובית פלוס 0.5 כפול ה-CT של בקרת הצמיחה השלילית פחות ה-CT של בקרת הצמיחה.
עם זאת, עבור piperacillin עם tazobactam ו-CEF dazadi במקלות גרם-שליליים, כמו גם עבור amoxicillin, oxacillin, ו-trimethoprim עם sulfamethoxazole ב-staphylococcus aureus או עבור amoxicillin ב-enterococcus SPP, יש להפחית את מקדם הכפלה של 0.5 ל-0.25. ניתן לקבוע את הרגישות או העמידות של הזנים בכל דגימה על ידי השוואת ה-CT של הדגימה ל-cutoff ct.
ערך CT מעל סף הגזירה מעיד על רגישות, בעוד שערך CT מתחת לסף הגזירה מעיד על עמידות. להלן דוגמה לגרף הגברה של רגישות לאנטיביוטיקה. זן ה-e coli שזוהה קודם לכן נבדק לרגישות למספר אנטיביוטיקות, שכל אחת מהן מיוצגת על ידי עקומה נפרדת.
דגימות עם ערך CT נמוך הן דגימות שבהן התרחשה צמיחה בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמעיד על עמידות לאנטיביוטיקה שנבדקה. לעומת זאת, ערך CT גבוה מייצג דגימה שבה לא התרחשה צמיחה, מה שמעיד על רגישות לאנטיביוטיקה שנבדקה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג זרימת עבודה של יום אחד לאבחון פתוגנים חיידקיים בזיהומי זרימת דם. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של שמונה מטרות חיידקיות רלוונטיות מבחינה קלינית ואת פרופילי העמידות לאנטיביוטיקה שלהן, ובכך מסייעת בקבלת החלטות טיפוליות בעיתים הנכונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- דיאגנוסטיקה קלינית
- עמידות לאנטיביוטיקה
רקע
- זיהומים בזרם הדם מהווים סיכונים בריאותיים משמעותיים ומחייבים אבחנה מהירה.
- שיטות קונבנציונליות לזיהוי פתוגנים עשויות להיות גוזלות זמן.
- זיהוי מהיר ובדיקת רגישות הם קריטיים לטיפול יעיל.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית המבוססת על PCR כדי לייעל את תהליך האבחנה.
מטרת המחקר
- פיתוח זרימת עבודה מהירה לזיהוי פתוגנים חיידקיים בתרביתו דם.
- הערכת הרגישות לאנטיביוטיקה של הבידודים באותו היום.
- השוואת היעילות של שיטה זו אל מול טכניקות אבחוניות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בבדיקת MultiPro PCR של DNA ריבוסומלי 16S לזיהוי פתוגנים.
- דגירה של איזולאטים עם פאנל של אנטיביוטיקה לבדיקת רגישות.
- qPCR קוונטיטיבי לקביעת עיכוב גדילה בנוכחות אנטיביוטיקה.
- ניתוח תוצאות באמצעות ספי ערכי CT ספציפיים להערכת רגישות.
תוצאות עיקריות
- תהליך העבודה מאפשר זיהוי של פתוגנים ובדיקת רגישות תוך מספר שעות.
- התוצאות מעידות כי השיטה מהירה יותר ממערכות אוטומטיות קונבנציונליות.
- הודגם זיהוי מוצלח של E. coli ושל פרופיל העמידות שלו לאנטיביוטיקה.
- ניתן לבצע את הטכניקה ביעילות עם דרישות מינימליות לתרבית מוקדמת.
מסקנות
- תהליך אבחנה מהיר זה יכול לשפר משמעותית את הניהול הטיפולי במקרים של זיהומי זרימת דם.
- שילוב של טכניקות תרבית ו-PCR משפר את מהירות האבחון והטיפול.
- מומלץ לבצע תיקוף נוסף במסגרות קליניות כדי לאשר את היעילות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר של פתוגנים ובדיקת רגישות לאנטימיקרוביאליים בתוך יום עבודה אחד נותנים מענה לבקבוק קריטי בניהול זיהומי זרם הדם, ומאפשרים קבלת החלטות בזמן אמת לגבי טיפול אנטיביוטי. זרימת עבודה זו מפחיתה את ההסתמכות על שיטות מבוססות תרבית ממושכות, ותומכת בהאצה של תהליכי דה-אסקלציה (הפחתת רמות הטיפול) או אסקלציה של משטרי טיפול אמפיריים. על ידי אספקת נתונים מיקרוביולוגיים ברי-יישום תוך שעות במקום ימים, היא מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת טיפול אנטימיקרוביאלי בשלב מוקדם ומפחיתה את הסיכון לטיפול שאינו הולם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות אנטימיקרוביאליות על ידי קישור זיהוי הפתוגן לפרופילי רגישות פנוטיפיים תחת תנאים מבוקרים.
- ערך תפעולי: תומך בהסרת סיכונים מנגנונית של מועמדים לאנטיביוטיקה באמצעות קורלציה מהירה בין זיהוי גנטי לתוצאות עיכוב גדילה.
- ערך ניבוי: יוצר נתוני רגישות כמותיים מבוססי סף המנחים את תיעדוף תרכובות מובילות בתוכניות לגילוי חומרים אנטיבקטריאליים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק קריאה כמותית וסטנדרטית (ערכי CT) להערכת עיכוב צמיחה בקטריאלית, מה שמאפשר סריקת תרכובים הניתנת לשחזור מול בידודים קליניים.
- ערך תפעולי: מקל על מוכנות הבדיקה באמצעות שימוש בחומר מתרבית דם שעבר עיבוד ישיר, ובכך מצמצם שונות פרה-אנליטית ומשפר את התפוקה.
- יכולת הרחבה: תואם לפלטפורמות PCR של 96 בארות, מה שמאפשר בדיקה מקבילה של מספר אנטיביוטיקות ובידודים לצורך אופטימיזציה יעילה של תרכובים מובילים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי להערכה פרה-קלינית באמצעות שימוש בפתוגנים בעלי רלוונטיות קלינית שבודדו מתרביות דם, ובכך משפרת את הרלוונטיות של מודל המחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת הערכה מוקדמת של יעילות האנטיביוטיקה נגד זנים עמידים, ובכך מפחיתה את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים של תהליכי הפיתוח.
- התאמת ביומרקרים: תומכת בזיהוי חתימות גנטיות הקשורות לרגישות, באמצעות פרופיל גנוטי ופנוטי משולב.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי של תרופות אנטי-בקטריאליות, החל מאימות יעדים מוקדם ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, ומספקת אפיון מהיר של פתוגנים ופרופיל רגישות כדי לסייע בקבלת החלטות לגבי קידומו של התרכובת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לזיהוי מהיר של מיני פתוגנים והערכה של עיכוב גדילה המושרה על ידי אנטיביוטיקה.
- סריקה: מספקת תוצאות רגישות כמותיות וסטנדרטיות המאפשרות השוואה של יעילות תרכובות על פני מספר בידודים קליניים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני עיכוב גדילה מבוססי CT המשמשים כנקודות קצה מדידות להערכת פעילות אנטיבקטריאלית ומנגנוני עמידות.
- מחקר טרנסלציונלי: משתמש בפתוגנים ישירות מתרביות דם חיוביות, מה שמעלה את הרלוונטיות למודלים של זיהום בבני אדם ואת התוקף הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת אבחונית ניתנת לשימוש חוזר עבור תוכניות אנטיבקטריאליות, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול ומסמי רק במיזמים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת מועמדים למולקולות מובילות אנטי-בקטריאליות על ידי אספקת נתונים מהירים של קורלציה בין פנוטיפ לגנוטיפ.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות זמני דגירה מוגדרים, ספי סף של CT ובקרות גידול מנוטרות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי צמצום זמן קבלת נתוני הרגישות מימים לשעות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאנטיביוטיקה על בסיס פרופילי רגישות מוקדמים מול פתוגנים רלוונטיים מבחינה קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה מולקולרית ובתכנון ופירוש של בדיקות real-time PCR.
- תלוי בגישה למכשור qPCR עם יכולות multiplexing וניתוח עקומות המסה (melt curve).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לעיבוד תרביות דם, הכנת פנל אנטיביוטיקה ובקרות זיהום.
- דורש התאמה של ריכוזי האנטיביוטיקה וזמני הדגירה עבור שילובים שונים של פתוגנים ותרופות.
- מוגבל לפתוגנים אירוביים ואנאירוביים פקולטטיביים; אנאירובים קפדניים עשויים לדרוש תהליכי עבודה חלופיים.
