יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם
July 9th, 2012
העיצוב של התוכנית של יום אחד פשוט העבודה עבור אבחון פתוגן חיידקי מאפשרת זיהוי מהיר של זיהומים בדם. הכללת שמונה מטרות חיידקים רלוונטיות קלינית ופרופילים אנטיביוטיות ההתנגדות שלהם מציע תובנה המטפל הראשוני באותו יום, מה שעלול להוביל טיפול הולם יותר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולהעריך את הרגישות לאנטיביוטיקה של מבודדי תרבית דם בפחות זמן מאשר בשיטות קונבנציונליות. זה מושג על ידי זיהוי תחילה של תרבית הדם המבודדת. באמצעות בדיקת DNA MultiPro PCR חדשה של 16 שניות.
לאחר מכן מודגר המבודד עם פאנל אנטיביוטיקה למשך שש שעות. השלב הבא הוא קביעת צמיחה או צמיחה בעיכוב של המבודד בנוכחות האנטיביוטיקה באמצעות בדיקת D-N-A-P-C-R ריבוזומלית כמותית של 16 שניות. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן להשיג זיהוי ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של תרבית דם מבודדת מהר יותר באמצעות שילוב זה של תרבית ו-PCR.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון אלה המשתמשות במערכות אוטומטיות של פניקס או IIC, הוא שאין צורך בסטטוס תרבית קודם, וכי תוצאות מזיהוי ובדיקות רגישות לאנטיביוטיקה יכולות להיות זמינות באותו יום. ידגימו את ההליך סטודנטים לדוקטורט של ונדי הנסון ו-GID מהמעבדה שלנו לדלל 100 מיקרוליטר של תרבית דם חיובית לצמיחה מיקרוביאלית בצינור תגובה המכיל 900 מיקרוליטר של 0.9% נתרן כלורי. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-13, 400 פעמים G למשך חמש דקות כדי לגלול את החיידקים בעקבות הצנטריפוגה.
ריס, השעו את הגלולה ב -100 מיקרוליטר מים דה-מינרליים סטריליים. התקן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר שכל הדגימות מוכנות, הכינו את תערובות תגובת ה-PCR בזמן אמת כדי להגביר DNA ריבוזומלי ספציפי של 16 שניות מהחיידקים המעניינים.
השתמש במים דה-מינרליים כדי להתאים את הנפחים ל-20 מיקרוליטר לתגובה. Aliquot 20 מיקרוליטר של תערובת PCR לבאר בצלחת PCR של 96 בארות. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר דגימה לכל באר ואטום את צלחת ה-PCR.
לאחר מכן, הפעל את ה-PCR במערכת ה-PCR בזמן אמת A BI Prism 7, 900 HT כדי לנתח את התוצאות לאחר השלמת ה-PCR, השתמש תחילה בלשונית הגדרות הניתוח כדי להתאים את ניתוח ה-CT ל-0.1. לאחר מכן צמצם את תצורות הבסיס כדי להתחיל את המחזור השישי ולסיים את המחזור ה-15. רשום את ערך ה-CT עבור כל דגימה.
בדרך כלל ניתן להגדיר את ערך החיתוך כדי להתייחס לתוצאת PCR כחיובית לערך CT של 35. בדוגמה זו, פרופיל הזיהוי של תרבית דם נגועה באי קולי מוצג בשתי תערובות תגובה. פריימרים של DNA ריבוזומלי אוניברסלי 16 s נכללו ויצרו שתי עקומות הגברה של CT 25.2 ו-25.95.
עקומת ההגברה השלישית נגזרת מהגשושית הספציפית לקולי. בדיקות ספציפיות אחרות לא יצרו אותות הניתנים לזיהוי. לאחר זיהוי הפתוגן, ניתן לבצע בדיקות אנטיביוטיות.
התחל בהעברת חמישה מיליליטר מרק מתרבית דם חיובית לצינור מפריד סרום. צנטריפוגה את הדגימה ב-2000 פעמים G למשך 10 דקות לאחר הצנטריפוגה, השליכו את חומר הסופאן מהצינור. לאחר מכן בעזרת צמר גפן סטרילי, העבירו את החיידקים משכבת הג'ל של הצינור ל-0.9% נתרן כלורי עד לקבלת תמיסה עם עכירות בתקן 0.5 מקפרלנד.
זה מתאים בערך 1.5 כפול 10 לשמונה יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את המתלה בריכוז כפול מולר הינטון. שני מרקים כדי להשיג ריכוז של בערך פי חמש פעמים 10 לחמש יחידות היוצרות מושבה למיליליטר.
50 מיקרוליטר לבאר של התרחיף בצלחת מיקרוטיטר שכבר מכילה 50 מיקרוליטר לבאר של מבחר אנטיביוטיקה. הקפד לכלול בקרות גדילה חיוביות עבור כל דגימה באמצעות בארות עם מים במקום אנטיביוטיקה. מכסים את הצלחת בסיום.
לאחר מכן דגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות כדי לאפשר צמיחת חיידקים. הקפד לאחסן כמות גדולה של תרחיף החיידקים בארבע מעלות צלזיוס כבקרת צמיחה שלילית. לאחר הדגירה של שש שעות, העבירו את התוכן של כל באר ואת דגימת הבקרה השלילית לצינורות סטריליים נפרדים.
לאחר צנטריפוגה של חמש דקות ב-16,000 פעמים. G, הסר 80 מיקרוליטר של סופרנטנט והשהה מחדש את הכדורים ב-80 מיקרוליטר של מים סטריליים דה-מינרליים. לדלל את הדגימות ב-1 עד 10 במים לפני השימוש בהן ל-16 שניות ריבוזומלי, DNA בזמן אמת PCR.
הכן את תערובת ה-PCR באמצעות תערובת העל הירוקה של IQ סייבר ופריימרים של DNA ריבוזומלי 16 שניות ו-aliquot. 20 מיקרוליטר לבאר בצלחת PCR של 96 בארות. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר מכל דגימה לבארות ואוטם את הצלחת.
לאחר מכן, הפעל את ה-PCR כדי לנתח את התוצאות. ראשית, חשב את ערך ה-CT החתוך. באופן כללי, ה-CT החותך שווה ל-CT של בקרת הגדילה החיובית בתוספת פי 0.5 מה-CT של בקרת הגדילה השלילית פחות ה-CT של בקרת הגדילה.
עם זאת, עבור piperacillin piperacillin עם tazobactam ו-CEF dazadi במוטות גרם שליליים וכן עבור amoxicillin, oxacillin ו-trimethoprim עם sulfamethoxazole ב-staphylococcus aureus או מ-amoxicillin. באנטרוקוקוס SPP, יש להפחית את מקדם הכפל של 0.5 ל-0.25. ניתן לקבוע את הרגישות או ההתנגדות של הזנים בכל דגימה על ידי השוואת ה-CT של הדגימה ל-CT החתוך.
ערך CT מעל החתך מצביע על רגישות ואילו CT מתחת לחתך מצביע על התנגדות. הנה דוגמה לתרשים הגברת רגישות לאנטיביוטיקה. זן האי קולי שזוהה קודם לכן נבדק לרגישות למספר אנטיביוטיקות שכל אחת מהן מיוצגת על ידי עקומה נפרדת.
דגימות בעלות ערך CT נמוך הן דגימות שבהן התרחש גידול בנוכחות אנטיביוטיקה המעידה על עמידות לאנטיביוטיקה שנבדקה. נהפוך הוא, ערך CT גבוה מייצג דגימה שבה לא התרחש גידול המעיד על רגישות לאנטיביוטיקה שנבדקה לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.
סקירה
מאמר זה מציג תהליך עבודה ליום אחד לאבחון פתוגנים חיידקיים בזיהומי דם. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של שמונה מטרות חיידקיות רלוונטיות קלינית ופרופילי התנגדות לתרופות אנטיביוטיות שלהן, ומאפשרת החלטות טיפוליות בזמן.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- אבחון קליני
- התנגדות לאנטיביוטיקה
רקע
- זיהומי דם מהווים סיכונים בריאותיים משמעותיים ודורשים אבחון מהיר.
- שיטות קונבנציונליות לזיהוי פתוגנים יכולות להיות ארוכות זמן.
- זיהוי מהיר ובדיקת רגישות הם קריטיים לטיפול יעיל.
- מחקר זה מציג גישה חדשנית מבוססת PCR לייעל את תהליך האבחון.
מטרת המחקר
- לפתח תהליך עבודה מהיר לזיהוי פתוגנים חיידקיים בתרבויות דם.
- להעריך את הרגישות לאנטיביוטיקה של מבודדים באותו יום.
- להשוות את יעילות השיטה מול טכניקות אבחון מסורתיות.
שיטות בשימוש
- שימוש בבדיקת PCR MultiPro של DNA ריבוזומלי 16S לזיהוי פתוגנים.
- דגירה של מבודדים עם פאנל של אנטיביוטיקה לבדיקת רגישות.
- PCR כמותי לקביעת עיכוב צמיחה בנוכחות אנטיביוטיקה.
- ניתוח תוצאות באמצעות סף ערכי CT ספציפיים להערכת רגישות.
תוצאות עיקריות
- התהליך מאפשר זיהוי פתוגנים ובדיקת רגישות תוך שעות.
- התוצאות מצביעות על כך שהשיטה מהירה יותר ממערכות אוטומטיות מסורתיות.
- הוכחה לזיהוי מוצלח של E. coli ופרופיל ההתנגדות האנטיביוטי שלו.
- הטכניקה יכולה להתבצע ביעילות עם דרישות תרבות מועטות.
מסקנות
- תהליך אבחון מהיר זה יכול לשפר משמעותית את ניהול הטיפול בחולים במקרי זיהומי דם.
- שילוב טכניקות תרבית ו-PCR משפר את מהירות האבחון והטיפול.
- מומלץ לבצע אימות נוסף בסביבות קליניות כדי לאשר את היעילות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen identification and antimicrobial susceptibility testing within a single workday addresses a critical bottleneck in bloodstream infection management, enabling timely antibiotic therapy decisions. This workflow reduces reliance on prolonged culture-based methods, supporting faster de-escalation or escalation of empiric regimens. By delivering actionable microbiological data in hours rather than days, it enhances predictive confidence in early-stage antimicrobial selection and reduces the risk of inappropriate therapy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of antimicrobial targets by linking pathogen identification with phenotypic susceptibility profiles under controlled conditions.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking of antibiotic candidates through rapid correlation of genetic identification with growth inhibition outcomes.
- Predictive Value: Generates quantitative, threshold-based susceptibility data that inform lead compound prioritization in antibacterial discovery programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, quantitative readout (CT values) for assessing bacterial growth inhibition, enabling reproducible compound screening against clinical isolates.
- Operational Value: Facilitates assay readiness by using directly processed blood culture material, minimizing pre-analytical variability and enhancing throughput.
- Scalability: Compatible with 96-well PCR platforms, allowing parallel testing of multiple antibiotics and isolates for efficient lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical evaluation by using clinically relevant pathogens isolated from blood cultures, improving disease model relevance.
- Mechanistic De-risking: Enables early assessment of antibiotic efficacy against resistant strains, reducing late-stage failure risk in development pipelines.
- Biomarker Alignment: Supports identification of susceptibility-associated genetic signatures through paired genotypic and phenotypic profiling.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the antibacterial discovery continuum from early target validation through lead optimization, providing rapid pathogen characterization and susceptibility profiling to inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid identification of pathogen species and assessment of antibiotic-induced growth inhibition.
- Screening: Delivers standardized, quantitative susceptibility outputs that allow comparison of compound efficacy across multiple clinical isolates.
- Analytics: Generates CT-based growth inhibition data that serve as measurable endpoints for evaluating antibacterial activity and resistance mechanisms.
- Translational Research: Uses pathogens directly from positive blood cultures, enhancing relevance to human infection models and preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable diagnostic capability for antibacterial programs, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibacterial lead selection by providing rapid, phenotype-genotype correlation data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined incubation times, CT thresholds, and controlled growth controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by reducing time-to-susceptibility data from days to hours.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibiotic candidates based on early susceptibility profiles against clinically relevant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular microbiology and real-time PCR assay design and interpretation.
- Dependent on access to quantitative PCR instrumentation with multiplexing and melt curve capabilities.
- Necessitates standardized protocols for blood culture processing, antibiotic panel preparation, and contamination controls.
- Requires adaptation of antibiotic concentrations and incubation times for different pathogen-drug combinations.
- Limited to aerobic and facultative anaerobic pathogens; strict anaerobes may require alternative workflows.
