Name: שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למד אפיון אינטראקציות ארוכות טווח בין חיידקי NTHI לרקמות אפיתל נשימתיות אנושיות באמצעות מודל EpiAirway. שיטה זו מאפשרת הערכת שרידות חיידקים ומאפיינים זניים בתוך רקמה ביולוגית רלוונטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות פטריק היידן (MatTek) לדיונים מועיל, ורוברט סמית ליבי פרי של גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטת מיומנויות EM שלהם. מחקר זה מומן על ידי מענק NIDCD DC010187 לאבא

1. הכנת ארון biosafety עבור הרקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבוש בחלוק מעבדה ייעודי, עם שיער אסוף וכפפות על, להתחיל את הזרימה למינרית. אחרי 5 דקות, להעביר כל הכלים בארון (pipettors, טיפים, מבחנות צנטריפוגה וכו ') לצד אחד, לרסס את פנים ארון biosafety ואת האבנט עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס לניקוי הפנים שוב עם אתנול 70% ולהשאיר לייבוש. הזזת כלים לצד נקי לחזור על התהליך אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו בתרסיס פיפטה מחסום טיפים pipettors ייעודי בממשלה. כדי להשתמש בנפרד עטופה pipettes סרולוגיות סטרילי, להעביר את סוף מחובר דרך הזרימה למינרית, לפרוץ, והחלק את פיפטה לתוך ארון, משיל מחוץ לאריזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף EpiAirway חייבים להיות מטופלים עם מלקחיים סטרילית. מקום 6 אינץ' קצה עדין מעוקל לנתח מלקחיים לתוך עצמית איטום שקיות העיקור החיטוי. הכינו מספיק כדי לקבל לפחות שישה ליום מוכן לשימוש. </li></ol> 2. לפרוק את הרקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס משטח עבודה הקבינט biosafety עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס שוב לאפשר למשטח להתייבש לפני השימוש. פתח את תיבת EpiAirway ולהיפטר קלקר וחומרי אריזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיביוטיקה ללא EpiAirway תחזוקה התקשורת, AIR-100-MM ABF (MM), היא קניינית MatTek ונשלח בערכה עם מוסיף את. בשנת הקבינט biosafety, תווית six סטרילי 50 צנטריפוגות צינורות מ"ל עם סוג התקשורת התאריך, לשחרר את כובעי. תרסיס בבקבוק התקשורת עם 70% אתנול ו פתוח בתוך הממשלה. Aliquot 25 מ"ל של MM לתוך צינור אחד בעזרת פיפטה חדש סרולוגיות סטרילי עבור כל צינור, להדק את כובעי, ולאחסן ב 4 ° C. השתמש aliquot טריים של MM בכל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.2 לעיל באמצעות בקבוק חדש של 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) עם סידן ומגנזיום. חזור שוב באמצעות D-PBS ללא סידן ומגנזיום. אחסן את כל aliquots ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף EpiAirway AIR-100 מגיעה צלחת 24 גם בבית 4 ° C על התקשורת המכילים מוצק agarose, ויש להציב לתוך 6 צלחות טוב לשימוש. לייבל כל צלחת עם התאריך ותיאור באמצעות סמן אתנול עמידים. מקום 1 למיליליטר של MM 4 מעלות צלזיוס EpiAirway לבאר כל אחד. הסר את צלחת תחבורה מאריזתו, תרסיס עם אתנול 70%, ואת המקום בממשלה biosafety. הסר את הסרט ולפתוח את הצלחת. בעזרת מלקחיים autoclaved, להסיר את גזה לח במשך מוסיף EpiAirway. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי להכניס עם מלקחיים autoclaved בתנועות פיתול לסייע בשחרור זה מן agarose, ואת המקום לבאר צלחת 6 באר. Agarose חלקם עשויים לדבוק להכניס את, במיוחד את הטמפרטורה של צלחת התחבורה מגביר את הסביבה. השתמש צמר גפן סטרילי עד בזהירות להסיר את agarose מ להכניס את. הימנע מנגיעה הממברנה, ולבדוק שאין בועות אוויר לכודות מתחת מוסיף את. מניחים את הצלחת לתוך humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפחות 24 שעות הרקמות לאזן בחממה לפני תחילת שיתוף תרבויות. </li></ol> 3. תחזוקה של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים autoclaved, להרים בעדינות להכניס פיפטה 200 מיקרוליטר של טרום חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום על רקמות ועל הסלע להוסיף. הטה את הכנס בזווית ומקום קצה פיפטה סטרילית שלך P1000 נגד טבעת הפלסטיק שמחזיק את קרום בתחתית להכניס את. אל תיגע רקמות. לשאוב D-PBS לשטוף את המקום cryovial סטרילית שכותרתו. דוגמאות אפשר להקפיא ב -20 ° C ו assayed עבור mucin ו / או ביטוי ציטוקינים במועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי יומי על ידי MM הבסיס aspirating והחלפת עם למיליליטר 1 של MM צח. השתמש טיפ חדש פיפטה מכשול גם עבור כל אחד. פנקו את התקשורת בשימוש עם אקונומיקה 10% לילה וזורקים. </li></ol> 4. הרכבה של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את תרבות חדשה של nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) ממלאי גליצרול קפוא על אגר שוקולד. לגדול לילה humidified 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, resuspend מושבות אחת NTHi מראש חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום כדי OD (600 ננומטר) של כ 0.7. וורטקס במרץ לפני מדידת צפיפות אופטית. מערכת היחסים של צפיפות אופטית למושבה יוצרי יחידות מ"ל (CFU / ml) של NTHi היא OD (600 ננומטר) של כ 0.2 שווה 1.0 x 10 8 CFU / ml. לכן, OD (600 ננומטר) של 0.7 כ 3.5 x 10 8 CFU / ml. אלגוריתם זה אמור להיות מאומת עבור כל זן NTHi לפני חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות EpiAirway AIR-100 מגדלים על מוסיף עם פני שטח של 0.6 ס"מ 2 ו קרום 0.4 מיקרון. רקמות מורכבות ~ 8.0 x 10 -5 ~ 1.0 x 10 6 &lt;/ Sup התאים&gt;. לכן, הרכבה של 1.0 x 10 7 CFU מתאים ריבוי של זיהום של כ - 10-12. כדי לחסן, ולשטוף כל להכניס EpiAirway כמו 3.1, ולאחר מכן להוסיף 28 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי שהוכנו 4.2 אל פני השטח של apical להכניס כל EpiAirway בממשלה biosafety. אין לחסן MM הבסיס. חזור לכל צלחת אל האינקובטור. </li></ol> 5. כימות של inoculum NTHi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בופר פוספט (PBS) פתרון עם 0.1% החיטוי ג'לטין, (PBS-G) לעקר. סטרילי לייבל 1.5 מ"ל Eppendorf צינורות עם דילולים 1:10 הרצויה על בסיס OD (600 ננומטר) של inoculum ו aliquot 900 מיקרוליטר של סטרילית PBS-G לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד נדרש למנות את NTHi מחוסן. מקום אלו הצלחות באינקובטור באוויר במהופך עם בתחתית הצלחת מונחת על חצי העליון במשך שעה אחת. זה יאפשר את הצלחת לשני חמים 37 ° C ו משטח יבש, להקל את הירידה-ציפוי של NTHi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את דילולים 1:10 הסידורי של inoculum על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי מ -4.2 ל הצינור הראשון. וורטקס דילול כל נמרצות במשך 5 שניות לפני ביצוע הבא. Drop 10 aliquots microliter על גבי צלחות אגר מראש חימם משטח יבש שוקולד, תוך שימוש במחצית צלחת עבור כל דילול. חמישה עד שישה 10 aliquots microliter יכול להתאים על חצי אחד של כל צלחת 100 מ"מ בלי לרוץ יחד. כאשר המקום יבש, במהופך humidified 37 ° C-CO 2 באינקובטור במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לקבוע את CFU / ml על ידי ספירת דילולים כי יש 15-30 מושבות נפרדות טיפה כל חישוב חזרה inoculum קיימא בפועל של NTHi. </li></ol> 6. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל 24 שעות, לשטוף את מוסיף כמו 3.1, אז הבריכה כביסות של כל רקמות כי כבר מחוסן עם זן זהה של חיידקים להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס cryovial שכותרתה לצורך ניתוח עתידי. דגימות אלה יכולים להיות assayed נוכחות של mucin ידי כתמים נקודה או ביטוי של ציטוקינים על ידי ELISA. לחלופין, רקמות ניתן לקצור את ה-mRNA ו qPCR יכול להתבצע על הגנים של עניין. שינוי יומי MM הבסיס כמו 3.2. המשך למשך התרבות המשותפת. </li></ol> 7. קציר של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% טרי saponin ב D-PBS ללא סידן ומגנזיום, מסנן לעקר וחם עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם שפופרת 50 מ"ל של MM ועוד של D-PBS ללא סידן ומגנזיום עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות דילול כמו 5.1, כמו גם אחד ריק סטרילי 1.5 מ"ל צינור Eppendorf לכל הכנס, שכותרתו עם מספר להוסיף מתח NTHi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EpiAirways ניתן לקצור גם עבור תאים הקשורים חיידקים הכולל, הכולל הן אורגניזמים חסיד והפנימו, או חיידקים הפנימו בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד צריך טיפה צלחת התא הקשורים או פלשו NTHi, תווית ויבש למשך שעה אחת באינקובטור אוויר כמו 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור הכולל תאים הקשורים חיידקים, לשטוף את פני השטח של apical EpiAirways שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום, ואז להטות את הכנס ולשטוף MM כל שנותר קרום הבסיס. לרחוץ את הראשון אפשר להקפיא לניתוח מאוחר יותר; להשליך שוטף הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנס לרחוץ צלחת 6-היטב טריים ללא מ"מ, פיפטה 250 מיקרוליטר של פתרון סטרילי saponin 1% לעומת 7.1 apical על פני השטח של כל רקמות. חזור אל בחממה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מן האינקובטור, ושימוש טיפ סטרילי P1000 פיפטה, לשפשף את הרקמות של הממברנה באמצעות גב ו-תנועה קדימה, ואחריו בתנועה מעגלית כדי להסיר את הרקמות מקצות להכניס את. שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000, המקום ההשעיה לתוך הצינור שכותרתו ריק שהוכנו 7.3. הוסף 250 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום על פני השטח של apical להכניס את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הכנס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה שלב בניגוד לקבוע אם יש רקמה הנותרים להיות שנקטפו. במידת הצורך, לשפשף שוב עם טיפ נוסף P1000 פיפטה סטרילית, ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה על הצינור של 7.8 שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000. תביאו את הנפח הכולל של הצינור אל למיליליטר 1 באמצעות D-PBS ללא סידן או מגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת במרץ ההשעיה התא במהירות שיא במשך דקה אחת. באמצעות מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד במחט 26 מד, לשאוב את ההשעיה לתוך המזרק דרך המחט. לאט לאט להעביר את ההשעיה דרך 3 פעמים מחט, נזהרת שלא ליצור בועות. וורטקס במרץ שוב למשך דקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפ גדול נשא פיפטה, במקום 100 מיקרוליטר של ההשעיה לתוך הצינור דילול הראשון הכין ב -7.3. וורטקס בתוקף למשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע דילולים 1:10 סדרתי. Drop-הצלחת דילולים הרצוי על גבי משטח יבש צלחות אגר שוקולד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור חיידקים הפנימו בלבד, לשטוף את כל להכניס 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום. לשמר להקפיא את לשטוף הראשון. הוסף סולפט גנטמיצין מ"מ מראש חימם לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. הכן 1.5 מ"ל של התקשורת לכל להכניס להיות שנקטפו. החלף את הבסיס עם MM MM גנטמיצין המכילים, ולהוסיף 300 מיקרוליטר של MM גנטמיצין המכילים על פני השטח apical. מניחים את הצלחת בחזרה CO 2 באינקובטור במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את MM גנטמיצין המכילים מפני השטח apical לשטוף את פני השטח apical ואת קרום הבסיס של להכניס את נרחב עם טרום חימם D-PBS ללא סידן ומגנזיום. המשך כמו 7.7-7.11. </li></ol> 8. נציג התוצאות: סריקה micrographs אלקטרונים של רקמות (א ') EpiAirway נגוע ו (ב) רקמות אחרי תרבות משותפת של 5 ימים עם NTHi מוצגים באיור 1. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi לא לגרום נזק משמעותי apical ברקמות, דבר המלמד על התועלת של המודל EpiAirway. גרף המתאר את מספר החיידקים הפנימו לכמת לאורך זמן בתוך רקמות מוצג באיור 2. התוצאות שניהם לשחזור למדי, מה שהופך את הרקמות EpiAirway עקבי ורלוונטי ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית שבה ללמוד NTHi מארח הפתוגן אינטראקציות. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים של רקמות EpiAirway. א בקרה רקמות נגוע. ב רקמות לאחר חמישה ימים של תרבות משותפת עם NTHi. נזק לא משמעותי על פני השטח apical הוא ציין ברקמות נגועות. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מספר NTHi הפנימו לאורך זמן במהלך התרבות שיתוף EpiAirway. מסננים R2866 היה מחוסן על כ 1.0 x 10 7 CFU / להוסיף (יום 0), שנקטפו ואז לחיידקים הפנימו בכל נקודת זמן המצוין. ברים לייצג n = 3 משכפל לפחות כפולים. ברים שגיאה הם SD.

<ol><li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae%3A+a+review+of+clinical+aspects%2C+surface+antigens%2C+and+the+human+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li>
<li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li>
<li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li>
<li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+tracheal%2Fbronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li>
<li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother.+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li>
<li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li>
<li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו מאפשרת את חקירת לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות רקע רלוונטי מבחינה ביולוגית העיקרי של רקמות הנשימה האנושית ממשק אוויר הנוזל. כאן השתמשנו NTHi כמו הדבקה של האורגניזם, אבל האינטראקציה של חיידק כלשהו שאינו מקובל להציג cytotoxicity לאורך זמן ניתן לכמת בשיטה זו. המודל EpiAirway יכול לשמש גם למחקר של וירוסים, תרופות, או חומרים כימיים המשפיעים על דרכי הנשימה העליונות האנושית 5, 6, 7, 8. שמרנו רקמות נגוע במשך יותר מ 40 ימים, רקמות נגועים NTHi במשך לפחות 10 ימים. אנו ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% ב D-PBS ללא סידן או מגנזיום, מסנן לעקר </td></tr><tr><td> 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים או בלי סידן ומגנזיום </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway אנטיביוטי ללא רקמות </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway אנטיביוטי ללא תחזוקה התקשורת </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> מסופק עם ערכת </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו 10X תמיסת מלח </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> מדולל ל 1X לפני השימוש </td></tr><tr><td> לטין </td><td> JT בייקר </td><td> 2124-01 </td><td> הוסף בריכוז סופי של 0.1% ב 1 X PBS ו החיטוי </td></tr><tr><td> Difco GC מאגר בינוני (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> החיטוי 36 גרם ב 500 מ&quot;ל DDH 2 O קריר עד 60 ° צלזיוס </td></tr><tr><td> BBL המוגלובין (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> החיטוי 10 גרם ב 500 מ&quot;ל DDH 2 O, קריר עד 60 ° צלזיוס ומערבבים עם בסיס בינוני GC לעיל </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX העשרה (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> מצננים את התערובת על בסיס בינוני GC ו המוגלובין עד 55 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 מ&quot;ל של IsoVitaleX rehydrated, יוצקים שוקולד צלחות אגר </td></tr><tr><td> מלקחיים הביתור, עצה טובה, מעוקל </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> עצמית איטום עיקור שקיות </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט גנטמיצין, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> הוסף 10 מיקרוליטר / ml כדי MM EpiAirway עבור להרוג גנטמיצין </td></tr></tbody></table>

שימוש במודל epiairway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) הם המדביקה בני אדם, חיידקים גראם שליליים, שעלולים לגרום לזיהומים חוזרים כרונית של רירית דרכי הנשימה 1, 2. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים אלה לשרוד על ובתוך הרקמות בדרכי הנשימה, מודל שבו מוצלח לטווח ארוך שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אדם יכול להתבצע נדרשת. אנו משתמשים העיקרי ברקמות אנושיות אפיתל הנשימה העלה לממשק אוויר נוזלי, מודל EpiAirway (MatTek, אשלנד, MA). אלה שאינם מונצחים היטב הבדיל, 3 מימדי רקמות שמכילות צמתים הדוקים, תאים ריסי ו nonciliated, תאים המייצרים הגביע mucin, ולשמר את היכולת לייצר ציטוקינים בתגובה לזיהום. זה רלוונטי מבחינה ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית ניתן להשתמש במספר דרכים: המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לבצע לטווח ארוך ושיתוף תרבות של רקמות EpiAirway עם NTHi ו לכמת תא הקשורים חיידקים הפנימו לאורך זמן . כמו כן, הייצור mucin את הפרופיל של ציטוקינים הנגוע שיתוף תרבויות ניתן לקבוע. גישה זו משפר עם השיטות הקיימות כי פרוטוקולים רבים כיום להשתמש שקוע monolayer או Transwell תרבויות של תאים אנושיים, אשר אינם מסוגלים לתמוך זיהומים חיידקיים לאורך תקופות ממושכות 3. לדוגמה, אם אורגניזם יכול לשכפל בתקשורת שמעליה, זה יכול לגרום לרמות מקובלות של cytotoxicity ואובדן של תאים המארח, לעצור את הניסוי. המודל EpiAirway מאפשר אפיון של לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות. יתר על כן, מאז המקור EpiAirway הוא אדם נורמלי tracheo-הסימפונות תאים ולא קו הנציח, כל אחד הוא ייצוג מעולה של רקמה אנושית בפועל בדרכי הנשימה העליונות, הן במבנה והן פונקציה 4. בשיטה זו, הרקמות EpiAirway הם להיגמל של תרכובות אנטי מיקרוביאליים ואנטי פטרייתי עבור 2 ימים לפני הלידה, וכל ההליכים מתבצעים תחת אנטיביוטיקה ללא תנאים. זה מחייב שיקולים מיוחדים, שכן הן חיידקים ברקמות אנושיות העיקרי משמשים בממשלה biosafety אותו דבר, הם שיתוף תרבותי במשך תקופות ממושכות.

שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

*Haemophilus influenzae* שאינם ניתנים לסיווג סרולוגי (NTHi) הם חיידקים גרם-שליליים המותאמים לבני אדם, אשר עלולים לגרום לזיהומים חוזרים וכרוניים של מערכת הנשימה...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע תרבית משותפת (co-culture) ארוכת טווח של Nontypeable Hemophilus influenza או NTHI עם רקמות אפיתליאליות נשימתיות ראשוניות של בני אדם באמצעות מודל epi airway. מטרה זו מושגת על ידיe חדרת NTHI למשטח האפיקלי, כדי לאפשר לחיידקים להיצמד לרקמות ולהחדיר עצמן אליהן כשלב שני. את הסבבים (inserts) שוטפים מדי 24 שעות ב-DPBS מחומם מראש כדי לדמות זרימת ריר רגילה ולהסיר תוצרי פסולת של מוצין ושאריות תאיות.בשלב הבא, הרקמות נאספות בנקודת הזמן הרצויה ונמדדת ההישרדות של NTHI, בין אם בתאים המקושרים באופן כולל ובין אם בתוך התאים. לבסוף, באמצעות שיטה זו, ניתן להעריך מאפיינים ספציפיים לזן של הישרדות NTHI בתוך הרקמות לאורך זמן, בהתבסס על ספירת חיידקים חיים. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי זיהומים ארוכי טווח של nontypeable hemophilus influenza.ניתן להשתמש בשיטה זו גם בחקר פתוגנים אנושיים אחרים כגון Moraxella Alis. הפרוצדורה המוצגת בווידאו בוצעה על ידי ד"ר Doin, עמית פוסט-דוקטורט במעבדתי. הוצא את פלטת ההובלה מאריזתה והכן את הציוד לתחילת הניסוי. רסס את פלטת ההובלה ב-70% ethanol והנח את הפלטה בתוך תא הבטיחות הביולוגית.העבירו מנה של 1 mL של מצע תחזוקה עבור epi airways, בטמפרטורה של 4 °C, לכל באר בלוחית בעלת שישה בארות. לאחר מכן, הסירו את הסרט, פתחו את הלוחית והסירו את הגזה המכסה את תבתי ה-epi airway. באמצעות תנועת סיבוב, השתמשו בפינצטה כדי לשחרר תבת מה-aros.מקמו את המדף (insert) באחת מבארות הפלטה בעלת שש הבארות במידת הצורך. השתמשו במקלון צמר סטרילי כדי להסיר בזהירות את השאריות מהמדף, תוך הימנעות ממגע עם הממברנה. ודאו שאין בועות אוויר כלואות מתחת למדפים.לאחר מכן, מקמי את הפלטה בעלת ששת הבארים באינקובטור. שטפי את התבתי ההכנסה (inserts) מדי יום באופן הבא: חממי מראש DPBS עם סידן ומגנזיום, ומלאי פיפטה ב-DPBS. לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית, הרימי בעדינות תבת הכנסה וטפטפי 200 µL של ה-DPBS המחומם על הרקמה.לאחר מכן, נערו את המבנית (insert) כדי להפיץ את ה-DPBS באופן שווה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הטו את המבנית בזווית והניחו קצה של פיפט P 1000 כנגד טבעת הפלסטיק המחזיקה את הממברנה בתחתית המבנית. לאחר מכן, שאבו בזהירות את תמיסת הבאפר והעבירו את התמיסה למבחנת קריו (cryo tube) לצורך מחקר בהמשך.לבסוף, שאבו את מצע התחזוקה הבסיסי והחליפו אותו ב-1 mL של מצע טרי. חממו מראש כמות נוספת של DPBS עם סידן ומגנזיום. הוסיפו 3 mL של DPBS המחומם מראש לשפופרת של 15 mL, ולאחר מכן השעו לשפופרת מושבות בודדות של nontypeable influenza או NTHI שגודלו במהלך הלילה על אגר שוקולד.כעת ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס (vortex) בעוצמה למשך 10 שניות לפחות, ולאחר מכן מדדו את הצפיפות האופטית. המשיכו להוסיף מושבות בודדות של NTHI עד שריכוז החיידקים יגיע ל-OD 600 nanometers של כ-0.7. לאחר מכן, שטפו כל סרט EPI airway ב-DPBS שחומם מראש כפי שנעשה קודם לכן, והוסיפו 28 µL של תמיסת החיידקים למשטח האפיקלי של כל סרט.הימנעו מהחדרת החיידקים למצע התחזוקה הבסיסי. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור כדי לכמת את ה-NTHI; ראשית חממו מראש, ולאחר מכן ייבשו את פני השטח של צלחות אגר שוקולד. לאחר מכן, בצעו דילול סדרתי של תמיסת ההחדרה של ה-NTHI באמצעות PBS סטרילי עם 0.1% ג'לטין או PBSG.טפטפו מנות של 10 µL מהאינוקולום (tinoculum) על הצלחות, ולאחר מכן דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, קבעו את ה-CFUs למילליטר על ידי ספירת הדילול שבו יש 15 עד 30 מושבות נפרדות בכל טיפה, וחשבו חזרה אל האינוקולום החי בפועל של NTHI כדי לקצור את כל החיידקים הקשורים לתאים. שטפו את המשטח האפיקלי של ה-epi airways שלוש פעמים עם 200 µL של DPBS ללא סידן או מגנזיום.לאחר מכן, הטו את המקורן (insert) ושטפו את שאריות מצע התחזוקה מהממברנה הבזאלית. הניחו את המקורן השטוף בפלטת שש בארות חדשה והוסיפו 250 µL של תמיסת saponin סטרילית בריכוז 1% על פני השטח האפיקליים של כל רקמה. החזירו את הפלטה לאינקובטור למשך 10 דקות לצורך דגירה.הכינו מבחנות לדילול סדרתי על ידי מילוי כל מבחנת דילול ב-900 µL של PBSG. לאחר מכן, גרדו את הרקמה מהממברנה באמצעות טיפ של פפטת P 1000 בתנועות הלוך וחזור, ולאחר מכן בתנועות סיבוביות כדי להסיר את הרקמה מקצות האינסרט. לאחר מכן, באמצעות טיפ סטרילי בעל קוטר רחב של פפטת P 1000, העבירו את התרחוף למבחנת einor ריקה בנפח 1.5 mL.כעת הוסיפו 250 µL של DPBS למשטח האפיקלי של המאסרט (insert), ולאחר מכן בחנו את המאסרט באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך כדי לקבוע אם נותר רקמה לקציר. העבירו את התרחוף לפקתה (einor tube) והשלימו ל-500 µL של DPBS בערבוב נמרץ. ערבבו את תרחוף התאים בורטקס למשך דקה אחת.לאחר מכן, באמצעות מזרק סטרילי של 1 mL המצויד במחט בקוטר 26 gauge, שאבו את התו сусפנזיה אל תוך המזרק דרך המחט. העבירו את הסספנזיה לאט דרך המחט שלוש פעמים, תוך הקפדה על אי-יצירת בועות.לאחר מכן, ערבבו את התרחיף במיקסר (vortex) בעוצמה למשך דקה נוספת. בשלב הבא, השתמשו בטיפ פפטה בעל פתח רחב כדי להעביר 100 microliters מהתרחיף לנבובת הדילול הראשונה. ערבבו את הנבובת במיקסר בעוצמה למשך חמש שניות, ולאחר מכן בצעו דילול סדרתי של 1:10 והטילו את הדילול על צלחות אגר שוקולד.לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לצורך ספירת חיידקים חיוניים כדי לקצור חיידקים שהפנימו לתאים. שטפו כל insert שלוש פעמים עם 200 µL של DPBS. החליפו את מצע התחזוקה הבזאלי במצע המכיל 100 µg/mL של gentamycin sulfate, ולאחר מכן הוסיפו 300 µL של מצע התחזוקה המכיל Gentamycin על פני השטח האפיקליים.החזירו את המinserts למדגרה למשך שעה אחת, ובזמן שהם מדגרים חממו מראש DPBS. לאחר מכן, הסירו את מצע התחזוקה המכיל Gentamycin מהמשטח האפיקלי. בשלב הבא, שטפו היטב את המשטח האפיקלי ואת הממברנה הבסאלית של ה-inserts באמצעות ה-DPBS שחומם מראש.לבסוף, חזרו על הליך הקרצוף והאיסוף שהודגם זה עתה לפני ביצוע דילולות סדרתיות וזריעה של החיידקים שהפנימו בתמונה זו. השוואת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של רקמות דרכי נשימה epi שאינן נגועות משמאל, מול רקמות דרכי נשימה epi שנגעו ב-NTHI במשך חמישה ימים מימין. ניתן לראות שתיבית ארוכה עם NTHI אינה גורמת לנזק משמעותי לרקמות האפיקליות, מה שמדגיש את התועלת של מודל דרכי הנשימה epi.כאן מוצג גרף המתאר את מספר חיידגיי ה-NTHI שהופנמו לאורך זמן במהלך תרבית משותפת (Co-culture) של דרכי נשימה אפיתליאליות. זן R 2 8 6 6 הוחדר בריכוז של כמעט one times 10 of the seventh CFU לכל סרט (insert). לאחר מכן, חיידקים שהופנמו נאספו ונספרו בכל נקודת זמן מצוינת.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע תרבית משותפת (co-culture) ארוכת טווח של NTHI עם רקמות נשימה הורמונליות ראשוניות באמצעות מודל A PRE.

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

אנו מתארים פרוטוקול חיסונים מושהה ליצירת זיהומים כרוניים הפצע בעכברים המוסמכים.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

מאמר זה מתאר מודל עכברי חדשני למעבר של פנאומוקוק ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן הגורם למחלה במהלך זיהום ויראלי. מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות ומארח-פתוגן במהלך השלבים השונים של התקדמות המחלה ועל פני מארחים שונים.

מודל עכברי למעבר של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מקולונייזר לפתוגן עם זיהום משותף ויראלי מחזיר מחלה המחמירה בגיל

אנטרואידים מתגלים כמודל חדשני לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של רקמות, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבית דו-ממדית ממקור אנטרואידים של תאים ראשוניים בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאי רקמה רלוונטיים. מודל זה מציע יתרון תרגומי למודלים של מחקר במערכת העיכול.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

פרוטוקול זה מתאר מודל ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לארבעה מינים של סיסטיק פיברוזיס (CF), שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים.

גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי החשוף למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילמים (רובד שיניים) בהקשר של בריאות הפה לעומת מחלות.

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

כיום חסרים מודלים in vivo המתאימים לבדיקת תרופות נגד זיהומים חיידקיים כרוניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהום פצע על ידי מבודד קליני של Pseudomonas aeruginosa כדי ליצור זיהום מתמשך בזחלי דג הזברה.

מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

למד אפיון אינטראקציות ארוכות טווח בין חיידקי NTHI לרקמות אפיתל נשימתיות אנושיות באמצעות מודל EpiAirway. שיטה זו מאפשרת הערכת שרידות חיידקים ומאפיינים זניים בתוך רקמה ביולוגית רלוונטית.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

גלה סרטונים נוספים