שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות
2 בספטמבר 2011
שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית במבחנה מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע תרבית משותפת ארוכת טווח של המופילוס אינפלואנזה או NTHI עם רקמות אפיתל נשימה אנושיות ראשוניות באמצעות מודל דרכי הנשימה של אפי. זה מושג על ידי חיסון המשטח האפיקלי ב-NTHI כדי לאפשר לחיידקים להיצמד לרקמות ולהיכנס אליהן כשלב שני. התוספות נשטפות כל 24 שעות עם DPBS מחומם מראש כדי לחקות זרימת ריר רגילה ולהסיר פסולת מוצין וכל פסולת סלולרית.
לאחר מכן, הרקמות נקצרות בנקודת הזמן הרצויה ונקבעת ההישרדות של NTHI הכולל הקשור לתאים או מופנם. לבסוף, בשיטה זו, ניתן להעריך מאפיינים ספציפיים של הישרדות NTHI בתוך הרקמות לאורך זמן על סמך ספירת חיידקים בת קיימא. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהומים ארוכי טווח עם המופילוס אינפלואנזה שאינה ניתנת לסוג.
זה יכול לשמש גם במחקר של פתוגנים אנושיים אחרים כמו מורקסלה אליס, מה שמדגים את ההליך הזה יהיה ד"ר דוין, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. הסר את לוחית ההובלה מאריזתה והתכונן להתחיל בניסוי. רססו את לוחית ההובלה באתנול 70% והניחו את הצלחת בארון הבטיחות הביולוגית.
יש ליטר אחד של ארבע מעלות צלזיוס, דרכי נשימה אפי, אמצעי תחזוקה לכל באר של צלחת שש בארות. לאחר מכן, לאחר הסרת הסרט, פתח את הצלחת והסר את הגזה המכסה את מוסיף דרכי הנשימה. בעזרת תנועת פיתול, השתמש בפינצטה כדי לשחרר תוספת מהארוס.
מניחים את התוספת לאחת הבארות של צלחת שש הבארות במידת הצורך. השתמש בצמר גפן סטרילי כדי להסיר בזהירות את הארוס מהתבנית, הימנע מלגעת בקרום. ודא שאין בועות אוויר כלואות מתחת לתוספות.
ואז מניחים את צלחת שש הבארות בחממה. שטפו את התוספות מדי יום באופן הבא, חממו מראש DPBS בסידן ומגנזיום ומלאו קצה ב-DPBS. לאחר מכן בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם פיפטה בעדינות 200 מיקרוליטר מה-DPBS המחומם מראש על הרקמה.
לאחר מכן נדנד את התוספת כדי לפזר את ה-DPBS באופן שווה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הטה את התוספת בזווית והנח קצה פיפטה P 1000 כנגד טבעת הפלסטיק המחזיקה את הממברנה בתחתית התוספת. לאחר מכן שאפו בזהירות את תמיסת החיץ והניחו את התמיסה לתוך שפופרת קריו למחקר מאוחר יותר.
לבסוף, שאפו את אמצעי התחזוקה הבסיסי והחליפו אותו במיליליטר אחד של מדיה טרייה. מחממים יותר DPBS עם סידן ומגנזיום. הוסף שלושה מיליליטר של ה-DPBS המחומם מראש לצינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן השהה מחדש מושבות בודדות של שפעת או NTHI שגדלו בן לילה על אגר שוקולד לתוך הצינור.
כעת מערבל את הצינור במרץ למשך 10 שניות לפחות, ולאחר מכן מדוד את הצפיפות האופטית. המשך להוסיף מושבות בודדות של NTHI עד שריכוז החיידקים מגיע ל-OD 600 ננומטר של כ-0.7. לאחר מכן, שטפו כל תוספת דרכי נשימה של EPI עם DPBS חם מראש כמו קודם, ולאחר מכן הוסיפו 28 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים למשטח האפיקלי של כל תוספת.
הימנעות מחיסון אמצעי התחזוקה הבסיסי. לאחר מכן החזירו את הצלחת לחממה כדי לכמת את ה- NTHI תחילה לחמם מראש, ולאחר מכן לשטח צלחות אגר שוקולד יבשות. לאחר מכן יש לדלל באופן סדרתי את חיסון NTHI באמצעות PBS סטרילי עם 0.1% ג'לטין או PBSG.
זרוק 10 מיקרוליטר של החיסון על הצלחות, ולאחר מכן דגר על הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. למחרת, קבע את ה-CFUs למיליליטר על ידי ספירת הדילול שיש לו 15 עד 30 מושבות נפרדות בכל טיפה, וחישוב לאחור לחיסון הבר-קיימא שלך בפועל של NTHI כדי לקצור את סך החיידקים הקשורים לתאים. שטפו את המשטח האפיקלי של דרכי הנשימה שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר DPBS ללא סידן או מגנזיום.
לאחר מכן הטה את התוספת ושטוף את כל אמצעי התחזוקה שנותר מהממברנה הבסיסית. מניחים את התוספת השטופה בצלחת טרייה של שש בארות ומוסיפים 250 מיקרוליטר של תמיסת ספונין סטרילית של 1% על פני השטח האפיקליים של כל רקמה. מחזירים את הצלחת לחממה למשך 10 דקות בזמן שהצלחת דוגרת.
הגדר צינורות לדילול סדרתי וממלא כל צינור דילול ב-900 מיקרוליטר PBSG. לאחר מכן, שפשפו את הרקמה מהממברנה עם קצה פיפטה P 1000 בתנועה קדימה ואחורה, ואחריה תנועה סיבובית כדי להסיר את הרקמה מקצוות התוספת. לאחר מכן בעזרת קצה פיפטה P 1000 סטרילי עם קדח גדול, הנח את המתלה לתוך צינור אינור ריק של 1.5 מיליליטר.
כעת הוסף 250 מיקרוליטר של DPBS על המשטח האפיקלי של התוספת, ולאחר מכן בדוק את התוספת באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך כדי לקבוע אם נותרה רקמה כלשהי לקציר. הוסף את המתלה לצינור ה-einor ומעליו 500 מיקרוליטר DPBS במרץ. מערבולת את תרחיף התאים למשך דקה אחת.
לאחר מכן השתמש במזרק סטרילי של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26. שאפו את המתלה למזרק דרך המחט. העבירו לאט את המתלה דרך המחט שלוש פעמים, והקפידו לא ליצור בועות.
ואז מערבב את המתלה במרץ למשך דקה נוספת. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה גדול כדי להעביר 100 מיקרוליטר את המתלה לצינור הדילול הראשון. מערבלים את הצינור במרץ למשך חמש שניות, ואז גורמים לדילול סדרתי אחד עד 10 לטפטף את הדילול על צלחות אגר שוקולד.
לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני לספירת חיידקים בת קיימא לקצירת חיידקים מופנמים. שטפו כל תוספת רק שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר DPBS. החלף את אמצעי התחזוקה הבסיסי במדיה המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין סולפט, ולאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של הגנטמיצין המכיל אמצעי תחזוקה על המשטח האפיקלי.
החזירו את התוספות לחממה למשך שעה בזמן שהתוספות מדגרות מחממות מראש כמה DPBS. לאחר מכן הסר את אמצעי התחזוקה המכיל Gentamycin מהמשטח האפיקלי. לאחר מכן, שטפו את המשטח האפיקלי ואת הממברנה הבסיסית של התוספות בהרחבה עם ה-DPBS המחמם מראש.
לבסוף, חזור על הליך הקרצוף והקציר שהודגם זה עתה לפני ביצוע דילול סדרתי וציפוי של החיידקים המופנמים באיור זה. השוואת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של רקמות דרכי נשימה epi לא נגועות משמאל עם רקמות דרכי נשימה epi נגועות בחמישה ימים מימין. ניתן לראות כי תרבית משותפת ארוכת טווח עם NTHI אינה גורמת לנזק משמעותי לרקמות האפיקליות, מה שמדגיש את התועלת של מודל דרכי הנשימה epi.
כאן מוצג גרף המתאר את מספר ה-NTHI שהופנמו לאורך זמן במהלך תרבות משותפת של נתיב הנשימה. הזן R 2 8 6 6 חוסן בערך פי 10 מה-CFU השביעי לכל תוספת. לאחר מכן נאספו חיידקים מופנמים ונמנו בכל נקודת זמן שצוינה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע תרבית משותפת ארוכת טווח של NTHI עם רקמות הנשימה ההורמונליות העיקריות באמצעות מודל A PRE.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
שיטה זו מאפשרת אפיון של תרביות משותפות חיידקיות מורחבות עם EpiAirways, מודל in vitro רלוונטי ביולוגית המשתמש ברקמת אפיתל נשימתי אנושית ראשונית. הגישה יכולה לשמש עם כל מיקרוב מתאים לתרבות משותפת לטווח ארוך.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה נשימתית
- מודלים in Vitro
רקע
- Hemophilus influenza שאינם ניתנים לטיפוס (NTHI) הם פתוגן משמעותי בזיהומים נשימתיים.
- הבנת האינטראקציות החיידקיות עם רקמות אפיתל נשימתיות חיונית לפיתוח טיפולים.
- מודל EpiAirways מחקה את סביבת הדרכים האוויריות האנושיות.
- מחקרי תרבות משותפת לטווח ארוך יכולים לספק תובנות לגבי הישרדות החיידקים והתנהגותם.
מטרת המחקר
- לבצע תרבות משותפת לטווח ארוך של NTHI עם רקמות אפיתל נשימתיות אנושיות ראשוניות.
- להעריך את הישרדות NTHI בתוך הרקמות לאורך זמן.
- להעריך מאפיינים ספציפיים לזן של הישרדות NTHI.
שיטות בשימוש
- חידור משטח האפיקלי של רקמות האפיתל ב-NTHI.
- שטיפת המאספים כל 24 שעות עם DPBS מחומם מראש כדי לחקות זרימת ריר.
- קצירת רקמות בנקודות זמן רצויות לצורך ניתוח.
- קביעת הישרדות של NTHI הקשורים לתאים או פנימיים.
תוצאות עיקריות
- הושגו תובנות לגבי זיהומים ארוכי טווח ב-NTHI.
- נעשה שימוש בספירת חיידקים חיים להערכת מאפייני הישרדות NTHI.
- השיטה הוכיחה את היכולת להעריך התנהגות חיידקית במודל רלוונטי.
- הממצאים יכולים להוות בסיס למחקר עתידי על זיהומים נשימתיים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי חשוב לחקר תרבות משותפת של חיידקים עם רקמות נשימתיות אנושיות.
- היא משפרת את ההבנה של אינטראקציות NTHI עם תאים אפיתליים.
- הגישה יכולה להתאים למיקרובים אחרים במחקרים דומים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The EpiAirway model enables long-term co-culture of respiratory pathogens with primary human epithelial tissues, addressing a critical gap in preclinical infection modeling. This approach supports mechanistic de-risking of host-pathogen interactions and improves predictive confidence in early-stage antimicrobial target validation. By maintaining tissue integrity and physiological relevance over extended periods, it enhances translational continuity from discovery to preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of cell-associated and internalized bacteria over time.
- Operational Value: Supports functional target validation by assessing strain-specific survival characteristics in a human-relevant system.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by modeling chronic infection phenotypes not supported by submerged cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative dependent variable measurements (CFU counts) for evaluating antimicrobial efficacy and bacterial persistence.
- Operational Value: Enables assay standardization through daily washing with pre-warmed DPBS to mimic mucociliary clearance and reduce variability.
- Scientific Value: Supports screening readiness by allowing mucin production and cytokine profiling as secondary readouts for host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant system (normal human tracheo-bronchial cells) to improve translational biomarker alignment for respiratory infections.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by maintaining tissue structure and function during long-term co-culture.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by characterizing long-term host-pathogen interactions without significant apical tissue damage.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal tracking of bacterial adherence, invasion, and survival.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility via standardized inoculum preparation (OD 600 nm ~0.7) and serial dilution plating for viable bacterial counts.
- Analytics: Generates quantitative readouts (CFU/mL) that allow comparison of strain-specific survival and evaluation of intervention effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of primary human tissues that retain cytokine production and mucin secretion capabilities.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform adaptable to other respiratory pathogens (e.g., Moraxella catarrhalis) beyond NTHi.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in chronic infection models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via antibiotic-free conditions and defined washing protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying compounds that reduce bacterial internalization or persistence over time.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal infection dynamics rather than acute cytotoxicity endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue handling and biosafety level 2 practices for co-culture of bacteria and human cells.
- Dependent on specialized inserts and air-liquid interface culture systems (e.g., MatTek EpiAirway).
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation, washing frequency, and harvesting procedures.
- Adaptation considerations include validation of pathogen compatibility with mucociliary clearance mimicry and tissue integrity over time.
- Practical limitation: Extended co-culture increases contamination risk, requiring strict aseptic technique in shared biosafety cabinets.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Unpacking and Maintenance of EpiAirways
2:45
Inoculation of EpiAirways
3:37
NTHi Inoculum Quantification
4:16
Harvesting of EpiAirways
7:05
Scanning Electron Microscopy and Bacterial Inoculum Quantification of EpiAirway Co-Cultures
7:47
Conclusion
