Name: Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: למדו את מבחן הפעלת הבזופילים (BAT) לאבחון רגישות יתר לתרופות מסוג IgE באמצעות קוניוגטים של תרופות עם אלבומין. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנונים אימונולוגיים בתגובות אלרגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF) מענק P18820-B13. אתיקה הצהרה: המחקר אושר (PLUS_Ethik_090514) על ידי ועדת האתיקה לניסויים עירוב בני אדם ו / או בעלי חיים באוניברסיטת זלצבורג ציות Declaraction הלסינקי כמו מתוקנת בשנת 1983, כל החולים שהשתתפו נתן הסכמה מדעת בכתב שלהם.

1. הכנת conjugates סמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 10 מ"ג DF ב 1 מ"ל DH 2 O ב צינור 1.5 תגובה מ"ל. בהליך נוסף להשתמש 95 μl של פתרון זה DF. כדי המצומד PP כדי לפזר HSA 30.4 מ"ג נגזרות PP (304 g / mol) ב 500 μl הידרוקסיד M 0.3 נתרן (NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 430.6 DH 2 O ו - 100 μl 0.5 מ '2 - (N-morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) pH חיץ 6.5-95 μl של DF מומס. הוסף μl 33.1 DH 2 O ו - 140 μl של 2 M MES חיץ pH 2.9 המדגם PP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl של 57.5 שהוכן זה עתה N-ethyl-N "- (3-dimethylaminopropyl) hydrochloride carbodiimide (EDC) מניות פתרון מומס DH 2 O עם ריכוז של 100 מ"ג / מ"ל מדגם DF, או 10 μl פתרון EDC אל המדגם PP. וורטקס דגימות דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 16.9 μl של פתרון HSA עם ריכוז של 118 מ"ג / מ"ל ​​ל מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הדגימות למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר תוך רועד ב 300 סיבובים / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze DF דגימות PP 3 פעמים נגד 2 ליטרים של בופר פוספט pH (PBS) מלוחים 7.4 במשך כמה שעות כל אחד. ביצוע כל הצעדים dialyzing ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם 10 דקות XG 14,000 לאסוף את DF המכיל supernatant או PP מצומדות כדי HSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק supernatant עבור חלבונים ידי ביצוע SDS-PAGE, באמצעות ג'לים 12%. עומס על 12 מיקרוגרם של HSA המצומד לתוך משבצת ריקה באחת ג'ל. </li></ol> 2. קביעת שיעור צימוד של conjugates התרופה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של שיעור צימוד של DF ו PP conjugates ידי HPSEC להשתמש נתרן 100 mM פוספט pH 6.5 חיץ המכיל 150 mM NaCl ו אזיד הנתרן 0.05%. השתמש 7.8 x 300 מ"מ טפו-Gel-G2000 טור SWXL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהוי של אותות באמצעות RI באינטרנט מצמידים ו גלאי מערכת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם HSA סטנדרטי עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ב DH 2 O. עבור כיול גלאי להזריק 50 μl פתרון HSA סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את k קבוע RI RI ואת UV UV k קבוע הגלאי. השתמש בנוסחאות שטח = RI RI k * [(dn / DC) HSA * ג (HSA)] אזור UV UV = k * [(DA / DC) HSA * ג (HSA)] עם (dn / DC) = HSA 0.185 ו (DA / DC) HSA = 0.518 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DF סטנדרטים PP נגזרת עבור HPSEC כי 5, 10 ו 30 nmol כמויות של סטנדרטים שניהם ניתן להזריק בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ממוצע ערכי (dn / DC) סמים (DA / DC) תרופה סטנדרטים שניהם. עבור DF, (dn / DC) של 0.235 ± 0.010 ו (DA / DC) של 39.000 ± 0.493 נקבע. עבור PP, (dn / DC) של 0.328 ± 0.016 ו (DA / DC) של 53.155 ± 2.464 נקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Conjugates להזריק סמים על HPSEC ולקבוע RI שלהם באזורים שיא UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של DF, נגזרת PP, ו HSA על ידי פתרון שתי המשוואות RI RI = שטח k * [(dn / DC) סמים * ג (תרופה) + (dn / DC) HSA * ג (HSA)] ו-UV שטח UV = k * [(DA / DC) סמים * ג (תרופה) + (DA / DC) HSA * ג (HSA)] עבור נעלמים. </li></ol> 3. BAT conjugates שימוש בסמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן seven cytometry צלוחיות זרימה תווית אותם, בהתאם לתוכן שלהם: שליטה בלא כתם, שליטה שלילית, שליטה חיובית, conjugates סמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של חיץ B-CCR-STB גירוי (Flow2 יצוק, Bühlmann מעבדות, Schönenbuch, CH) לתוך צלוחיות שמורות לשלוט בלא כתם ושליליים. כביקורת חיובית, להשתמש 50 μl של פתרון אנטי FcεRI המסופקים על ידי ערכת Flow2 יצוק. הוסף את הסכומים המתאימים לפתרון המצומד של צלוחיות שמורה conjugates התרופה על ידי יצירת סדרה דילול 1:10 מ -20 מיקרוגרם 0.02 / ml DF המצומד ו PP המצומד (ריכוז סופי בנפח assay של μl 200). ניסויים אלה טיטרציה יש לבצע כדי לקבוע את הריכוז של הפעלת basophil אופטימלית למדגם לכל מטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl חיץ גירוי אל צינור כל EDTA 50 החולה μl הדם כולו. מערבבים את דגימות בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 מכתים μl Flow2 שחקנים מגיב המכיל נוגדנים נגד CCR3 שכותרתו עם phycoerythrin (PE) ואנטי CD63 נוגדנים שכותרתו עם isothiocyanate והעמסת (FITC) על צינור אחד ומערבבים שוב. אל פיפטה מגיב מכתים לתוך המדגם בלא כתם! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות במשך 45 דקות בתוך אמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובה על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse אריתרוציטים ידי הוספת 2.0 מ"ל ריאגנט Flow2 שחקנים lysing אל הבקבוקון כל מערבולת בעדינות. דגירה דגימות בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות על XG 500 ו supernatant למזוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים 500 μl חיץ Flow2 שחקנים לשטוף ולאחסן על הקרח עד cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם של מתח cytometer של זרימהettings עבור פיזור קדימה לוואי (FSC, SSC) בזמן רכישת מדגם בלא כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער התאים כצפוי לימפוציטים מתוך העלילה SSC-FSC אל חלקת SSC-PE. בזופילים מזוהים על ידי נוגדן אנטי CCR3 PE-שכותרתו CCR3 היי SSC והפלא השער אותם לתוך עלילה FITC-PE. נוגדן נגד CD63 גילוי בזופילים מופעל התווית FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את חתוכים למקסימום 2.5% בזופילים כמו CD63 היי בבקרה שלילית. מדגם נחשבת חיובית עבור הפעלת basophil אם&gt; בזופילים 5% הם CD63 היי ומדד הקרינה אומר (MFI) של המדגם מחולק MFI שליטה השלילית עולה על 2 (איור 3). </li></ol> 4. נציג תוצאות: ניסוי זה מעריכה BAT ככלי מועיל לזהות IgE תלויי רגישות יתר בסמים. Conjugates חלבון של NSAIDs משמשים ההפעלה של בזופילים. עד HPSEC עם RI וזיהוי UV צבירה המדינה, תואר צימוד, ואת התשואה האפקטיבית של conjugates נקבעים. כמו איור 4 מראה, 43.5% מכלל conjugates DF נשאר monomeric עם תואר צימוד של 5.0 DF / HSA. עבור אגרגטים מידת צימוד של 9.5 נקבע. המצומד propyphenazone הוצגה מורכב מונומרים 68.5% עם תואר צימוד של 21.2. מידת הצימוד של אגרגטים היה 27.9. בסך הכל, מידת צימוד נחוש של conjugates DF היה 7.6 DF ושל conjugates PP היה 23.2. BAT הופיע עם conjugates בתנאים אופטימיזציה (הריכוז של conjugates, זמן גירוי) אפשרה חקירה של IgE תלויי ותגובות רגישות יתר NSAID. כפי שניתן לראות בתרשים 5, רק המצומד PP מסוגל להפעיל הפעלה basophil דמיינו ידי upregulation בביטוי CD63 פני השטח: 20.6% של בזופילים הופעלו מאופיין Shift-יומן בעוצמת הקרינה. MFI גדל בפקטור של 4.9 מתוך 386 (בקרה שלילית) ל 1893. לעומת זאת, באמצעות המצומד DF רק 3.1% מכלל בזופילים הופעלו שהיה מתחת 5% חתוכים. גם MFI גדל רק פי 1.1 (גבול 2.0) מתוך 197 (בקרה שלילית) עד 210. תוקף Assay ניתנת על ידי (i) &lt;הפעלה basophil 5% שליטה שלילי, (ii) log-שינוי עוצמת הקרינה של subpopulation basophil, וכן (iii)&gt; בזופילים מופעל 50% (בקרה חיובית). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. צימוד של נגזרות DF ו PP כדי HSA. לאחר המסת התרופות, המים, MES חיץ, ו EDC (מגיב צימוד) מתווספים. דגימות הן vortexed לרגע לפני 1 HSA הוא pipetted לפתרונות סמים. תוך 2 שעות בטמפרטורת החדר רעד התרופות להיקשר קוולנטית HSA. מונומרים כמו גם אגרגטים עלול לגרום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. חישוב מעלות צימוד. ראשית, קבועים k RI ו UV k נחושים. לכן, HSA רגיל עם ריכוז ידוע מוזרק לתוך מערכת HPSEC. (Dn / DC) ו (DA / DC) של HSA מקבלים ערכים של 0.185 ו - 0.518, בהתאמה 5. אזורים השיא משמשים לחישוב קבועים. שנית, לכל תרופה שלושה תקנים מוזרקים לקבוע סמים וריכוז ספציפי RI ושטחים UV. מאז RI k ו-UV קבועים k ידועים מן השלבים שלעיל, נגזרים התרופה הספציפית (dn / DC) ו (DA / DC) ניתן לחשב. שלישית, סמים HSA conjugates מוזרקים HPSEC. אזורי שיא וכתוצאה מכך משמשים כדי לחשב את ריכוזי התרופה HSA לכל שיא על ידי פתרון שתי משוואות עם שני משתנים בלתי ידועים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Gating Basophil. תאים כצפוי לימפוציטים הם מתפזרים בצד מגודרת לעומת פיזור קדימה (SSC-FSC העלילה). בזופילים מזוהים CCR3 היי SSC והנה מן לימפוציטים מגודרת (SSC-CCR3-PE העלילה). בזופילים הם ניתחו עבור הפעלה (CD63 היי) בעלילה CD63-FITC-CCR3-PE. בקרה שלילית משמש כדי להגדיר את חתך של בזופילים 2.5% לכל היותר שנותרו CD63 היי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. מעלות צימוד נחושה של conjugates סמים. RI אותות UV להראות שתי פסגות המייצג אגרגטים (משחררי בווליום נמוך השמירה) ו מונומרים (משחררי בהיקף שימור גבוהה) של סמים HSA conjugates. אחוזי מונומרים אגרגטים (נקבע אותות RI) ותואר צימוד שלהם מתוארים (n = 1). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. Basophil activatiעל הבדיקה. תוצאות המצומד המופעל דגימות סמים, שולטת שלילי, חיובי שולטת מוצגים CD63-FITC-CCR3-PE חלקות (n = 1).

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils%2C+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li>
<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

BAT היא מבוססת היטב אף שעדיין לא בשימוש שגרתי שיטה לאבחון של מחלות אלרגיות בתיווך IgE 6,7. עבור רגישות יתר בסמים, עם זאת, ישימותה נפגעת כמו תרכובות משקל מולקולרי נמוך אינם מסוגלים קולטנים crosslink IgE, תנאי מוקדם להפעלת basophil 8. לכן, תרופות תחת חקירה צריך להיות יחד קוולנטית לחלבונים מנשא מתאים (למשל HSA). חשוב לציין, מידת צימוד (כלומר מספר של מולקולות התרופה לכל חלבון המוביל) צריך להיות בשליטה כדי להבטיח את פעילות מערכת החיסון (כלומר, הקולטן IgE cross-linking) של conjugates. באופן תיאורטי, שני haptens לכל מולקולה הספק צריך להיות מספיק עבור קולטן IgE cross-linking ומעטים כמו חמש מולקולות DF לכל HSA הוכחו ההדק לשחרר המתווך assay מבוססי תאים 4. Conjugates שני, PP-HSA ו DF-HSA, נקבעו כדי להציג תואר צימוד גבוה מספיק (HPSEC) ולהיות פעיל immunologically שהופך אותם ריאגנטים מתאים לשימוש BAT. בעיה נוספת עשויה להיות כי מטבוליטים התרופה עשויה לשחק תפקיד, כמו המטבוליט במקום סמים ההורה עלול לגרום תגובת רגישות יתר. במקרה של DF, אפשרות זו נבדקה בהרחבה בעבר באמצעות five שלב חשוב אני מטבוליטים ואחד גרסה הצמדה 4. גורמים חשובים עבור Mastering את הטכניקה המתוארת כוללים איכות דגימת דם (&lt;12 שעות מאז איסוף דם, מספר בזופילים זוהה&gt; 500) ואופטימיזציה של תנאים גירוי (מנה זמן). בנוסף, מה שנקרא לא מגיבים שאפילו לא מגיבים עם שליטה חיובית (נוגדנים כנגד הקולטן IgE) צריך להיות מזוהה. לכן, קריטריון האימות חייב לכלול נוגדן אנטי FcεRI כביקורת חיובית. יתרון חשוב של השימוש בסמים conjugates היא העובדה שהן מופיעות רעיל בניגוד סמים טהור, כפי שמוצג על ידי גירוי בשיתוף עם נוגדן אנטי FcεRI בבת 4 עבור DF-HSA המצומד. Pure DF, לעומת זאת, מציגה השפעות ציטוטוקסיות בריכוז של 1.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל גורם לבעיות עם interpretability של בת 9. בדרך כלל, בדיקות רעילות פוטנציאלית מומלץ מאוד עבור המצומד כל סם הפיק החדש. הנה, הראינו את הפוטנציאל של PP-HSA המצומד בשימוש BAT לחשוף IgE בתיווך רגישות יתר. לעומת זאת, DF רגישות יתר אינה קשורה IgE שמפגינים חוסר הפעלת basophil בתגובה DF-HSA המצומד. חשוב לציין, במקרה של חוסר ודאות לגבי מנגנון IgE בתיווך, conjugates צריך להיות מוערך על פעילות מערכת החיסון על ידי במערכות assay במבחנה מבוססי תאים כפי שהוכח על DF 4. באמצעות התקנה של תיאר conjugating תרופות משקל מולקולרי נמוך קוולנטית למוביל מולקולות חלבון מתאים מספר של תגובות רגישות יתר כנגד תרופות כולל אנטיביוטיקה, NSAIDs אחרים, radiocontrast התקשורת, מרפי שרירים, הרדמה וכו &#39;עלול להיחקר על מעורבותם של IgE בתיווך מנגנון. לפיכך, BAT עשוי לשמש בנוסף את השיטות הקיימות לאבחון (מבחן עור, פרובוקציה אוראלי בדיקות).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / מכשיר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7.8 x 300 מ&quot;מ טפו ג&#39;ל -G2000SWXL עמודה </td><td> Bioscience Tosoh </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> ספסל העליון צנטריפוגות </td><td> סיגמא </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> דיקלופנק מלח נתרן </td><td> סיגמא </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 שחקנים Kit </td><td> Bühlmann מעבדות </td><td> FK-CCR </td><td> הערכה אפקטיבית 14 יוני 2011 Flow2 שחקנים עכשיו שחקנים Flow </td></tr><tr><td> מערכת HPLC HP1100 </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> האדם סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> מעבדה צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-אתיל-N&#39;-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) </td><td> סיגמא </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS טבליות </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone נגזרת </td><td> המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת זלצבורג, אוסטריה </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> מטרף </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן כלורי (NaCl) </td><td> סיגמא </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> מימן סודיום קרבונט </td><td> סיגמא </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> נתרן hydroxid </td><td> סיגמא </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> סיגמא </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> גלאי טריפל מערך </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex אישי V-1 פלוס </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> המים באמבט 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil מבחן הפעלה לחקירות ige בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

תגובות רגישות יתר כנגד סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) כמו propyphenazone (PP) ו - diclofenac (DF) יכול להתבטא סוג אני כמו תגובות אלרגיות 1. בפועל קליני, אבחון של רגישות יתר בסמים מתבצע בעיקר על ידי ההיסטוריה המטופל, כמו בדיקות העור אינו אמין בדיקות פרובוקציה אוראלי דובים מסכני חיים סיכונים עבור 2 המטופל. לפיכך, עדות pathomechanism IgE בתיווך הבסיסית קשה להשיג. כאן, אנו מציגים שיטה חוץ גופית מבוסס על שימוש של בזופילים האדם הנגזרות סמים רגישות יתר המטופלים המחקה את התגובה האלרגית מפעיל in vivo. כפי בזופילים של סמים אלרגית חולים לשאת מולקולות IgE ספציפי לתרופה האשם, הם הופכים להיות מופעל על crosslinking קולטן IgE ולשחרר מולקולות מפעיל אלרגית. הפעלה של בזופילים יכול להיות פיקוח על ידי קביעת upregulation הביטוי CD63 פני השטח באמצעות זרימת cytometry 3. במקרה של תרופות נמוך משקל מולקולרי, conjugates נועדו לאפשר crosslinking IgE קולטן על בזופילים. כמתואר באיור 1, שני נציגים של NSAIDs, PP ו DF, מחויבים קוולנטית אל אלבומין בסרום אדם (HSA) באמצעות קבוצת carboxyl מגיבים עם קבוצת אמינו ראשונית של שאריות ליזין. DF נושאת קבוצה carboxyl מהותי, ולכן ניתן להשתמש ישירות 4, בעוד קבוצה המכילים carboxyl נגזרת של PP חייב להיות מסונתז organochemically לפני המחקר 1. מידת הצימוד של תרכובות נמוך משקל מולקולרי על מולקולת חלבון המוביל הפריסה המרחבית שלהם חשוב להבטיח crosslinking של שתי מולקולות IgE הקולטן. פרוטוקול המתואר כאן חל כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים בגודל הרחקה (HPSEC) מצויד עם מקדם שבירה רציפים (RI) אולטרה סגול (UV) מערכת זיהוי לקביעת מידת צימוד. כפי המתודולוגיה המתוארת ניתן להחיל על תרופות אחרות, המבחן ההפעלה basophil (BAT) נושא את פוטנציאל לשמש לקביעת IgE בתיווך מנגנונים רגישות יתר בסמים. כאן, אנו קובעים PP רגישות כמו בתיווך IgE ו רגישות יתר DF כלא IgE מתווכת על ידי BAT.

מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי אלרגיות<em&gt; במבחנה</em&gt;. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור מבחן ההפעלה basophil משמש לחקור רגישות יתר בסמים. שיטה לייצור יעיל של סמים חלבון conjugates קוולנטיים ואפיון physicochemical שלהם מתואר.

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

תגובות רגישות יתר לתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (NSAIDs), כגון פרופיפנזון (propyphenazone - PP) ודיקלופנאק (diclofenac - DF), עשויות להתבטא כתגובות דמויות סוג I...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות רגישות יתר לתרופות המתווכת על ידי IgE באמצעות מבחן הפעלת בסיפילים, תוך שימוש בצמידים של נשא חלבוני תרופה עם HAP המאופיינים היטב. דבר זה מושג תחילה על ידי קישור כימי של תרופה, באמצעות קבוצת קרבוקסיל פנימית או כזו שהוכנסה כימית-אורגנית, לשאריות ליזין של אלבומין בסרום אנושי. שנית, הצמידים מאופיינים פיזית-כימית כדי לקבוע את דרגת הצימוד המדויקת על ידי ביצוע כרומטוגרפיית הפרדה גודלית בעלת ביצועים גבוהים (HPSEC), עם גילוי סדרתי של מדד שבירה וקרינה אולטרה-סגולה.בשלב הבא, משתמשים בתשמיות התרופות המאופיינות היטב כדי לעורר בזופילים מתורמים עם רגישות יתר לתרופות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במבחן הפעלת בזופילים, או BAT, כדי להעריך מנגנונים המתווכים על ידי IgE ברגישות יתר לתרופות. שמי מייקל שטיינר מקבוצת חקר האלרגיות באוניברסיטת זלצבורג באוסטריה.היום נרצה להציג בפניכם טכניקה המאפשרת למדוד את מעורבותם של נוגדני IgE ספציפיים לתרופה בתגובות של רגישות יתר לתרופות. כאן אנו מראים את הפרוצדורה באמצעות שני נציגים נפוצים של תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות, כלומר propone ו-diclofenac. עם זאת, לשיטה זו יש פוטנציאל לשמש לאבחון שגרתי של אלרגיות לתרופות מסוג מיידי.באופן כללי, הוסף 10 µL של תמיסת סטוק טריה של N-ethyl-N'-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, או EDC, לדגימת ה-propafenone או ה-PP. ערבב את הדגימה במכשיר וורטקס במשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף לדגימה 16.9 µL של תמיסת human serum albumin או HSA בריכוז של 118 mg/mL, ולאחר מכן דגור את הדגימה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר תוךما ניעור במהירות של 300 rpm.לאחר השלמת הנענוע, בצעו דיאליזה לדגימות שלוש פעמים כנגד שני ליטרים של PBS למשך מספר שעות בכל פעם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ב-14,000 ×g, ואספו את העליון (S supernatant) המכיל את ה-NSAIDs המצומדים ל-HSA. בדקו את נוכחות החלבונים בעליון על ידי ביצוע SDS page באמצעות ג'לים בריכוז 12%.טעינה של כ-12 micrograms של HSA conjugate למשבצת ג'ל אחת לצורך ניתוח קצב ההסנפקה של NSAID conjugates באמצעות כרומטוגרפיית גודל-מסין בעלת ביצועים גבוהים או H-P-S-E-C. ראשית, דללו את דגימת תקן ה-HSA לריכוז של 1 milligram per milliliter במים דמינרליזים. לכיול הגלאי, הזרקו 50 microliters של תמיסת תקן HSA.לאחר מכן, השתמש בעמודת G 2000 SSW XL מסוג TSK gel בגודל 7.8 על ידי 300 מילימטר, ובמערכת גלאי מקוப்பி RUT (מדד שבירה) ו-UV. חשב את קבוע ה-RI, המסומן כ-case sub RI, ואת קבוע ה-UV, המסומן כ-K sub UV, עבור הגלאי. בהתבסס על שתי נוסחאות אלו, דלל תמיסות סטנדרט של נגזרת PP עבור H-P-S-E-C במים דמינרליזים בריכוזים של 5, 10 ו-30 בכמויות המתאימות להזרקה, ולאחר מכן חשב את ערכי הממוצע של DN by DC של התרופה ושל DA by DC של התרופה עבור שני הסטנדרטים.באמצעות שתי נוסחאות אלו, הזרק כעת את תמציתי התרופות המצומדים ל-H-P-S-E-C וקבע את שטחי הפסגות של ה-RI וה-UV שלהם. לאחר מכן, באמצעות אותן שתי משוואות, חשב את הריכוז של נגזרות ה-PP וה-HSA עבור הדגימות הבלתי ידועות. ראשית, סמן שבעה מבחנות לציטומטריית זרימה בהתאם לתוכנן: בקרת ללא צבע, בקרת שלילה, בקרת חיובית ותמציתי תרופות מצומדים.בשלב הבא, העבירו בפיפט 50 µL של בופר להפעלת בסיפילים למבחנות המיועדות לביקורת ללא צביעה ולביקורת השלילית. הוסיפו 50 µL של תמיסת anti FC epsilon R one מהערכת flow two cast למבחנת ביקורת החיובית. כעת, הוסיפו 0.02 עד 20 µg/mL של ה-PP conjugate למבחנות ה-drug conjugate בסדרת דילול של 1 ל-10, ולאחר מכן הוסיפו 100 µL של בופר להפעלה ו-50 µL של דם שלם עם EDTA מהמטופל לכל מבחנה.ערבבו את הדגימות בזהירות. לאחר מכן, העבירו בפיפטה 20 µL מהזרימה של ריאגנט צביעה המכיל נוגדנים anti-CCR3 המסומנים ב-PE ונוגדנים anti-CD63 המסומנים ב-ZI לכל אחד מהמבחנות של תסמיכי התרופה והביקורות החיוביות והשליליות, וערבבו.שוב, הדגרירו את הדגימות למשך 45 דקות במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, כדי לעצור את התגובה, הניחו את הדגימות על קרח למשך חמש דקות. בשלב הבא, בקעו את האריתרוציטים על ידי הוספה של 2 mL של נוזל ליזיס Flow-2 לכל מבחנה.דגרו את הדגימות בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השקיעו את הדגימות למשך חמש דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר. שפכו בזהירות את הנוזל העליון, השעיקו מחדש את התאים ב-500 µL של בופר שטיפה לזרימה ציטומטרית (flow cytometry), ואחסנו את הדגימות על קרח עד לביצוע הזרימה הציטומטרית.השתמשו בדגימה שאינה צבועה כדי לכוון את הגדרות המתח של ציטומטר הזרימה. לאחר מכן, בצעו gating לתאים שזוהו כלימפוציטים בתוך גרף ה-side scatter forward scatter. בדומה לאיור דגימה זה, בסינפילים מזוהים תחילה כ-CCR3 high side scatter low.בדומה לתרשים פיזור זה. לאחר מיון התאים בגרף ה-fit EPE, ניתן לזהות בסופילים מופעלים על פי ביטוי חיובי של CD 63 המסומן ב-FIT E. לאחר קביעת ערך סף מקסימלי של 2.5% מהבסופילים כ-CD 63 high בביקורת השלילית, מדגם ייחשב כחיובי להפעלת בסופילים אם יותר מ-5% מהבסופילים הם CD 63 high וה-MFI של המדגם חלקי ה-MFI של הביקורת השלילית עולה על שניים.שיטה זו מעריכה את הבדיקה ככלי יעיל לזיהוי חלבון בעל רגישות לתרופות התלויה ב-IgE. קונג'וגטים של NSAIDs משמשים להפעלת בזופילים על ידי H-P-S-E-C עם גילוי אגרגציה באמצעות RI ו-UV. דרגת הצימוד והניצולת האפקטיבית של הקונג'וגטים נקבעות כפי שמוצג באיור זה.43.5% מהצמידים של DF נותרו כמונומרים, כאשר דרגת הצימוד עבור האגרגטים הייתה 5.0 DF ל-HSA. דרגת צימוד של 9.5 נקבעה כפי שמתואר כאן. נמצא כי הצמיד של PPP מורכב מ-68.5% מונומרים עם דרגת צימוד של 21.2.דרגת הצימוד של המצברים הייתה 27.9. בסך הכל, דרגת הצימוד שנקבעה עבור נשאי DF הייתה 7.6 df, ועבור נשאי PPP הייתה 23.2. ביצוע BAT עם נשאים תחת תנאים אופטימליים מאפשר בדיקה של תגובות התלויות ב-IgE ברגישות יתר ל-NSAID.כפי שמוצג כאן, רק הצמיד PP היה מסוגל להפעיל את הבזופילים, דבר שנצפה על ידי עלייה בביטוי של CD 63 על פני השטח. 20.6% מהבזופילים הופעלו, כפי שאופיין על ידי עלייה בעוצמת הפלואורסצנציה, וה-MFI עלה פי 4.9, מ-386 עבור ביקורת השלילית ל-1893.בניגוד לכך, בשימוש בצמידה של DF, רק 3.1% מהבזופילים הופעלו, נתון שהיה נמוך מסף ה-5%. כמו כן, ה-MFI עלה רק פי 1.1, מ-197 עבור הביקורת השלילית ל-210. תקינות הבדיקה מוכחת על ידי הפעלה של פחות מ-5% מהבזופילים בביקורת השלילית.שנית, תזוזה של סדר גודל (log shift) בעוצמת הפלואורסצנציה של תת-אוכלוסיית בזופילים, ושלישית, יותר מ-50% בזופילים מופעלים עבור ביקורת חיובית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע בדיקות הפעלת בזופילים, והחשוב ביותר, כיצד להבדיל בין תגובות רגישות לתרופות המתווכות על ידי IgE לבין תגובות שאינן מתווכות על ידי IgE. יתרה מכך, תבינו כיצד להרחיב את היישום של בדיקת הפעלת בזופילים לאלרגיות לתרופות, מעבר לשימושה המבוסס כבר באלרגיות לפולן, למזון ולחרקים.

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מודלים העכבר ניסיוני של אסטמה אלרגית להציע אפשרויות חדשות ללימוד בהיווצרות המחלה ופיתוח ותרופות חדשות. דגמים אלה מתאימים גם לגורמים השולטים מדידה תגובה חיסונית אלרגית, דלקת בדרכי הנשימה, ו פתופיזיולוגיה ריאתי.

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

בסרטון זה אנו מתארים שיטה חוץ גופית להערכת הפוטנציאל האלרגי של אנטיגן לגרימת גרגירת בזופילים. β-הקסוזמינידז משמש כאינדקס לשחרור מתווך כימי, ופעילות האנזים של β-הקסוזמינידז נמדדת באמצעות מצע פלואורוגני.

Humanized Mediator Enzyme Release Assay: שיטה אימונוכימית לסינון פוטנציאל אלרגי של אנטיגן בדיקה על ידי ניטור תגובת בזופיל degranulation במבחנה

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבדיקה להערכת הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה.

ניתוח הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי אימונוגלובולין E ספציפי לסרום באמצעות מערכת כימילומינסנציה מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות. סרום IgEs אינטראקציה עם אלרגנים שונים משותקים באזור התגובה של המחסנית, אשר מזוהים לאחר מכן עם נוגדנים מצומדים peroxidase anti-IgE ומצע chemiluminescent, המאפשר זיהוי בו זמנית של IgEs ספציפיים לאלרגנים מרובים.

מערכת זיהוי מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות עבור אימונוגלובולין E ספציפי לאלרגן

תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

ניתוח במבחנה של רקומבינציה של מתג מחלקה בעכברים הוא מאתגר עקב מולקולות IgE ציטופיליות הקשורות לקולטני Fc על פני תאי B.  אנו מתארים שיטה לזיהוי IgE באמצעות מחשוף בתיווך טריפסין של IgE קשור לפני השטח לפני קיבוע וחדירות לצביעה פלואורסצנטית ציטופלזמית.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול המשתמש בגישה המוטמעת ברכיבים לחישוב רגישות לאלרגנים של אבקת דשא, בקרב קבוצה של מטופלים מדרום סין עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה.

גישה מאבחנת של רכיבים לחקר על אלרגנים של אבקת דשא בדרומים סיניים עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

מבחן ההפעלה הבזופילי הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE המבוסס על זיהוי הפעלת בזופיל בנוכחות גירוי מסוים באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה.

בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

כאן אנו מציגים את מבחנת שחרור המתווך, באמצעות קו תאי לוקמיה בוסופילי חולדה transfected עם קולטן IgE האנושי, כדי לדמות degranulation של תאים אפקטים שנצפו בדרך כלל בתגובות אלרגיות מסוג 1. שיטה זו חוקרת את הפעילות הביולוגית של אלרגנים באופן רגיש מאוד, ניתן לשחזור וניתן להתאמה אישית.

מגשר אנושי לשחרר את אסאי כהקראה עבור עוצמה אלרגן

למדו את מבחן הפעלת הבזופילים (BAT) לאבחון רגישות יתר לתרופות מסוג IgE באמצעות קוניוגטים של תרופות עם אלבומין. שיטה זו מאפשרת זיהוי מנגנונים אימונולוגיים בתגובות אלרגיות.

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

גלה סרטונים נוספים