Name: שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: חקור שיטת תיוג כלי דם בעוברי עכברים באמצעות הזרקת צבע פלואורסצנטי לוריד הפנים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של מבנה כלי הדם ומסייעת בחקר השפעת מוטציות גנטיות על התפתחות מערכת הדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מספרים מענק R01AI055001 ו R01AI082127 מ NIAID כדי NRM ואת אחוות SREB בפרס על עבודת JLB.

1. והעמסת שכותרתו dextran ו-GSL אני isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים לתייג vasculature עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן FITC-dextran (50ug/mL) ב בופר פוספט (PBS) או GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) ב-PBS בצינור Eppendorf 1.5mL וחם עד 37 ° C. הוסף 100uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS לפתרון FITC-dextran (הנפח הכולל 1mL) ו 180uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS עד 1 GSL - isolectin B 4 (200uL הנפח הכולל), ולכן הפתרון הוא כחול בעליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח E14.5-E18.5 עוברים שק החלמון יחד, עוזב את גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים לצלחת פטרי חדש (60 X 15 מ"מ) לטבול אותם PBS בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר כדי לספק מבט sagittal הראש / פנים. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו בעדינות לתפוס את העובר בראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30G, להזריק 50uL FITC-dextran (50ug/mL) או GSL 1 - isolectin B 4 (ב 20ug 200uL PBS) לווריד הפנים מכוון את המחט לכיוון החלק האחורי של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צבע גלוי בווריד הטבור, להוציא את המחט ולהפריד את העובר מן גבעול allantoic (עורק הטבור וריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זריקות, לאפשר לעובר להישאר PBS בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות כדי לצבוע זורם לאורך העובר. </li></ol> 2. Whole-Mount ניתוח בכלי הדם בעור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המאפשר לצבוע לזרום לאורך העובר, להסיר דגימות עור מאזורים של הגפיים, הגב, הבטן וכו '8,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מדגם העור בקור PBS, ולתקן 4% PFA / PBS למשך 2 שעות 8,9. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל בקבוקון ברור 4mL עם 2ml קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על עור מדגם מיקרוסקופ שקופיות ולהוסיף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שלב בסעיף "רכישת תמונות" 2. </li></ol> 3. רב צבע תיוג של התימוס ועל vasculature לב ותאי perivascular עבור cryosections (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר כולו "פלאש להקפיא" בחנקן נוזלי. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב -80 ° C עד הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לנתח את בלוטת התימוס, לשטוף ב 4 ° C PBS, ולתקן ב Paraformaldehyde 2ml 4% (PFA) / PBS למשך 2 שעות. שטוף 3 פעמים למשך 10 דקות בקור PBS, מקום thymi ב אוקטובר, ולהקפיא ולאחסן עד השימוש ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור cryosectioning, להפיץ אוקטובר על "הבלוק" קטע והר את העובר או באיברים גזור / רקמות עבור חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור הרקמה הקפואה אל תוך 10 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף בשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון הסעיפים אצטון למשך 5-10 דקות. לשטוף 3 פעמים TBS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום חמור בדם 10% / כפות בתא לחות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על סעיפים 1 שעה לילה עם 100 μl של נוגדנים העיקרי בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס: בדוגמה זו, אנו משתמשים עכברוש אנטי עכבר CD31 (1:100) על האנדותל, תווית עז אנטי עכבר PDGFR-β (1:100) לתייג תאים perivascular. כדאי לכסות שקופיות עם לחתוך בנפרד רצועות Parafilm כדי להבטיח את הנוגדן היא התפשטה באופן אחיד על פני הקטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם נוגדן ראשוני, לשטוף סעיפים 3 פעמים TBS קר. דגירה עם 100 μl של נוגדנים משני מתאים במשך 30 דקות מינימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים TBS קר. הוסף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף "ייבוא ​​תמונות". </li></ol> 4. רב צבע תיוג של התימוס בכלי הדם ותאי perivascular עבור חלקים vibratome (המשך של סעיף 1, שלב 7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אונות התימוס מעובר ולשטוף בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התימוס ב 4% PFA / PBS בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב-PBS טריטון X (0.15%) 3 פעמים, 10 דקות thymi מקום מחסנית פלסטיק לצלול קטן ב -4% נמוך להמיס agarose / PBS (~ 4 ° C). התימוס צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose לבסס על הקרח (3-5 דקות). השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך agarose עודף. הוסף דבק כדי לחסום את vibratome לדבוק מדגם לחסום את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קר PBS לאמבטיה מים vibratome עד המדגם להב שקועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מהירות משרעת (אמפליטודה גבוהה נמוכה בינונית מהירות הוא אידיאלי עבור חלקים התימוס רך). משרעת צריך להיות מופחת אם חלקים להתפרק עקב תסיסה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 50 מקטעים אממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול, לאסוף מקטעים microplate 24 באר בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הסעיפים 500 μl של נסיוב חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה עבור 8 שעות לילה עם נוגדן ראשוני, כגון אנטי CD31 ואנטי PDGFR-β, ב microplate 24-מכוסה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק סעיפים בסרום חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חלקים עבור 8 שעות הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים משני המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לתקן דגימות 4% PFA / PBS במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) מעל 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים דגימות דרך מדורגת MeOH / PBS-טריטון X סדרה: 25% MeOH, MeOH 50%, MeOH 75% ו 100% MeOH ב 10 דקות לכל שלב. החלף MeOH 100% עם MeOH טרי אחרי 10 דקות לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל זכוכית, לערבב באב (בנזיל אלכוהול: בנזיל בנזואט) ביחס 1:02. שלב באב עם MeOH ריכוז סופי של 50% ו באב MeOH 50%. דגירה המדגם באב: MeOH במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת למיכל זכוכית עם 100% ו באב דגירה במשך 10-15 דקות או עד פינה, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שקופיות דיכאון (0.7mm עומק) עם באב 100% טרי מדגם להעביר לצד. מוסיפים כיסוי זכוכית (מס '1.5) ואת החותם עם 2-3 שכבות של לק. אפשר לק להקשיח בחושך בטמפרטורת החדר, ואז לאחסן מדגם ב 4 ° C. הערה: שקופיות חייב להיות אטום לחלוטין לפני רכישת התמונה confocal. תמונות צריך להירכש בתוך 12-24 שעות, כמו צבעי ניאון יכול להמוג באב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לסעיף "ייבוא ​​תמונות". </li></ol> 5. תמונה הרכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 10 מיקרומטר חלקים קפואים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות תכנית-Apochromat 20X/0.8 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב '4), 543 -, ו - 633 ננומטר קווי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת confocal Z-קטעים של העור הר שלם 50 מיקרומטר agarose-משובצים קטעים באמצעות תכנית-Apochromat 10X/0.4 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב '4), 543 -, ו 633 ננומטר קווי לייזר. Serial-Z קטעי יש לאסוף באופן רציף עבור כל ערוץ בהתאמה ב 1 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר סדרתי Z-קטעים באמצעות Zeiss AxioVision 4.6 או תוכנות אחרות ניתוח התמונה. </li></ol> 6. נציג תוצאות: תיוג יעיל של כלי הדם העוברי היא קריטית להערכת פגמים כלי דם בעכברים עובריים. איור 1 מציג תוויות ספציפיים של כלי הדם E16.5 התימוס (1A-B) ושיתוף עם תיוג CD31 (1B), בנוסף מכתים של החדרים, ימין ושמאל (1E-F), בהתאמה. I-GSL isolectin B 4 פרוטוקול cryosections כמתואר בסעיפים 1, 3 ו 5 שימש בניסויים אלו. Whole-Mount תיוג של רשת כלי דם בעור E16.5 על עכברים, באמצעות פרוטוקולים המתוארים בסעיפים 1, 2, ו -5 מוצג באיור 1C-D. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> איור 1 מקרא. FITC GSL אני - isolectin ב 4 זריקות לתוך וריד הפנים E16.5 עוברי עכברים. Cryosection א של התימוס עובריים לאחר ההזרקה. b. מיזוג של CD31 במשותף עם תיוג B isolectin 4. ג ו - ד Whole-mount של הזרקת vasculature עובריים העור הבאה. e. ו Cryosection ו עובריים של הלב ה (מימין החדר) ו (משמאל החדר) הזריקה הבאה.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Whole-mount ו PECAM-1 (CD31) מכתים על הסעיפים הם בשיטות המקובלות על תיוג vasculature בעכברים עובריים. שיטות אלו דורשים שימוש immunofluorescence ישיר ו / או עקיף, דטרגנטים כדי permeabilize רקמות העכבר. זה מוכיח להיות תהליך עדכני למדי. הנה, יש לנו עובדים FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים ישירות התווית vasculature עובריים, ובכך למנוע את הדרישה צעדים תיוג נוגדן. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת הערכה של המצב התפקודי של כלי הדם, כמו &quot;דולף&quot; פנוטיפים יתגלה בשי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> FITC-dextran </td><td> סיגמא </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> והעמסת שכותרתו GSL 1 - ב 4 isolectin </td><td> וקטור מעבדות </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> מהיר גרין </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> מתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> אצטון </td><td> JT בייקר </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> חמור סרום </td><td> ג&#39;קסון </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי עכבר CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר עז PDGFR-β </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> חמור נגד חולדה CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> חמור נגד עז Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> טריטון X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> נמוכה להמיס agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25 גרם </td></tr><tr><td> מתנול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> בנזיל אלכוהול </td><td> Acros מדעי </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> בנזיל בנזואט </td><td> Acros מדעי </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> דיכאון שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית (22X22) -1.5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 מיקרוסקופ Meta Confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים לנתח Micro </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm מס &#39;OM992 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 ו 24 microplates היטב </td><td> אוורגרין מדעי </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / פלוס מיקרוסקופ שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL צלוחיות ברור </td><td> לאומית מדעי </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

הקמתה של רשת כלי דם תפקודית הוא חלק חיוני של organogenesis, והוא נחוץ לצורך תפקוד האיבר אופטימלית. לדוגמה, במבנה vasculature התימוס נכונה דפוסים חיונית כניסה thymocyte לתוך איבר ויציאה בוגרת T-cell לפריפריה. הסידור המרחבי של כלי הדם התימוס תלוי אותות microenvironment המקומית, כלומר בתאי אפיתל הרתי (TEC). הדיווחים האחרונים מצביעים על כך מספר שיבוש תוצאות אלו אותות כלי דם התימוס 1,2 פגמים. מחקרים קודמים תיארו טכניקות המשמשים התווית התימוס ילודים ומבוגרים 1,2 vasculature. אנו מדגימים כאן טכניקה תיוג כלי הדם התימוס עובריים. שיטה זו משלבת את השימוש FITC-dextran או Griffonia (Bandeiraea) לקטינים Simplicifolia אני (GSL 1 - isolectin B 4) זריקות וריד הפנים CD31 מכתים נוגדן לזהות מבנים וסקולרית התימוס ועל PDGFR-β לתייג הרתי perivascular mesenchyme 3-5. האפשרות של שימוש cryosections או חלקים vibratome הוא גם סיפק. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מומים בכלי הדם התימוס, שהוא קריטי עבור הגדרת התפקידים של TEC-derived מולקולות היווצרות כלי דם התימוס. כפי שיטת התוויות vasculature כולו, זה יכול לשמש גם כדי לנתח את רשתות כלי דם באיברים ורקמות רבות ברחבי העובר כולל העור לב 6-10.

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

הקמת רשת כלי דם תפקודית היא חלק חיוני מאורגנוגנזה (היווצרות איברים), והיא נדרשת לתפקוד אופטימלי של האיבר. לדוגמה, ב...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את השפעותיהן של מוטציות גנטיות ספציפיות על התפתחות ומבנה כלי הדם. דבר זה מושג על ידי נתיחה משותפת של העובר ושל רקמות חוץ-עובריות כדי לספק דגימה מתאימה להזרקה. לאחר מכן, מזריקים צבע פלואורסצנטי לווריד הפנים כדי לסמן את מערכת כלי הדם השלמה.לאחר מכן, העובר מוכן לניתוח. לבסוף, דגימות שלם (hole mounts) או חתכים של כלי דם מסומנים מדגימים את המבנה התלת-ממדי של כלי הדם התקינים, על בסיס מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה (immunofluorescence) של דגימות שלם או חתכי רקמה. הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר התעניינתי בקביעת נקודת הזמן ההתפתחותית שבה כלי הדם הפריפריים מתחברים לטימוס באמצעות אנגיוגנזה.כדי להתחיל, הכינו FXI dextran או GS L one I selectin B four ב-PBS בתוך פרוביטת אפנדורף של 1.5 מיליליטר. הוסיפו 100 µL של תמיסת מרוכז 1.25 mM fast green PBS ל-FTSE dextran, או 180 µL ל-GS L one I select B four, כך שהתמיסות יהיו כחולות באופן גלוי. לאחר מכן, חממו את הפרוביטה ל-37 °C.בצעו דיסקציה לעוברים בשלבים E 14.5 עד E 18.5 יחד עם שקיי החלמון, תוך השארת ה-Allen Toic stalk שלם. העבירו את העוברים לצלחית פטרי חדשה והטבילו אותם ב-PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מקמו עובר כך שיתקבל מבט סגיטלי של הפנים.לאחר מכן, בעזרת פינצטה למיקרו-דיסקציה, אחזו בעדינות בעובר באזור הראש. בעזרת מחט בכיל 30, הזריקו 50 µL של FXI dextran או GS L one I selectin B four לווריד הפציאלי (facial vein), כאשר קצה המחט מופנה לכיוון אחורי הראש. כאשר הצבע נראה בווריד הטבילי, הוציאו את המחט והפרידו את העובר מהלאן (lan).שטיפה. השארו את העובר ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי עד שלוש דקות כדי שהצבע יסבב בכל רחבי העובר. לאחר שהצבע סבב בכל רחבי העובר, הסירו דגימות עור מאזורי הגפיים, הגב והבטן.שטפו את דגימות העור ב-PBS קר וקבעו אותן ב-4% paraldehyde PBS למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו אותן שלוש פעמים, 10 דקות בכל פעם, בבקבוקוני זכוכית שקופים בנפח ארבעה מיליליטר המכילים שני מיליליטר של PBS קר. הניחו את דגימות העור על זכוכיות מיקרוסקופ והוסיפו לכל זכוכית 100 µL של מדיום קיבוע (mounting medium) וכיסוי זכוכית.יש להניח לשקופיות להתייבש בחושך לפני כן; ניתן לבצע הבהרה ב-BABB ולאחריה הדמיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של כלי הדם בעור. כדי להכין רקמות לחיתוך קריוגני, יש להקפיא במהירות עוברים שלמים בחנקן נוזלי. מרחו OCT על בלוק חיתוך והניחו עליו את העובר.חתכו את הרקמה הקפואה לשכבות בעובי 10 micron ואספו אותן על עלויות. קבעו את השכבות באצטון למשך חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן שטפו אותן שלוש פעמים ב-TBS קר בבלוק, ב-10% Donkey serum ב-TBS בתוך תא לחות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 100 microliters של נוגדן ראשוני לכל שכבה.בדוגמה זו אנו משתמשים ב-rat anti-US CD 31 לסומן האנדותלום וב-goat anti-US P-D-G-F-R beta לסומן תאים פרי-וסקולריים, כדי להבטיח שהנוגדן יתפשט באופן אחיד על פני החיתוך. כסו את השקופיות ברצועות Parafilm שנגזרו בנפרד. דגרו את השקופיות למשך שעה אחת עד ללילה בתא לחות בטמפרטורה של 4 °C.בשלב הבא, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-TBS קר. דגרו עם 100 µL של הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 30 דקות לפחות. לבסוף, שטפו שלוש פעמים ב-TBS קר. הוסיפו 100 µL של תוכה לקיבוע (mounting medium) וזכוכית כיסוי לכל שקופית.הניחו לשקיפות להתייבש בחושך. עבור חיתוך ב-vibram, הוציאו את אונוני התימוס מעוברים ושטפו ב-PBS קר. קבעו את הרקמה ב-4% paraldehyde PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר שטיפת הדגימות ב-PBS Triton X, מלאו מחסנית פלסטיק קטנה ב-4% low melt agarose PBS. טבלו את הדגימות ב-agarose PBS, תוך וידוא שהרקמה נמצאת במגע עם תחתית המחסנית. המתינו להתקשות ה-agarose על קרח.לאחר מכן, השתמשו בסנאפר (להב תער) כדי להסיר את שאריות ה-agros. מרחו דבק על בלוק ה-VIBRAM והדביקו את הדגימה לבלוק. מזגו PBS קר למכאם המים של ה-Vibram עד שהדגימה והלהב יהיו טבולים.הגדירו את המהירות והאמפליטודה. יש להפחית את האמפליטודה. אם חתכים נשברים עקב ערבוב מופרז, חתכו 50 חתכי רקמה.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את החתכים ל-PBS קר בפלטת מיקרו של 24 בארות; חסמו את החתכים ב-500 µL של סרום חמור 10% ב-PBS Triton X למשך 30 דקות. לאחר הוספת נוגדנים ראשוניים, כגון anti CD 31 ו-anti P-D-G-F-R beta, דגרו למשך שמונה שעות או למשך הלילה בפלטת מיקרו מכוסה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, שטפו שלוש פעמים ב-PBS Triton X לאורך זמן כולל של שמונה שעות ב-4 °C.לאחר חסימה חוזרת של החתכים ודגירה בנוכחות נוגדנים משניים, שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS Triton X לאורך שמונה שעות בסך הכל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, קבעו מחדש את הדגימות ב-4%paraldehyde PBS למשך 30 דקות על קרח, ושטפו שלוש פעמים נוספות ב-PBS Triton X למשך 30 דקות על קרח. ייבשו את הדגימות באמצעות סדרת ריכוזים עולים של methanol PBS Triton X למשך 10 דקות בכל שלב.לאחר מכן, החליפו את ה-100% methanol במתנול טרי והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הניחו את הדגימה על זכוכית כיסויה עם שקע (depression slide) וכסו את הדגימה בתמיסה של 1:1 של BABB ומתנול. הדגירו את הדגימות למשך 10 עד 15 דקות.בשלב הבא, החליפו את התמיסה ב-100% BABB והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות או עד להשקיפות. הוסיפו זכוכית כיס ואטמו באמצעות שתי עד שלוש שכבות של לק ציפורניים. המתינו לייבוש לק הציפורניים בחושך ובטמפרטורת החדר.ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C, אך יש לצלם את התמונות בתוך 12 עד 24 שעות. צלם חתכים קפואים בעובי 10 micron באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם עדשת plan A per chromat 20x 0.8 וקווי לייזר של 633, 543 ו-488 nanometer. רכוש חתכי Z קונפוקאליים בעובי one micron של חתכים טמיעים ב-aros בעובי 50 micron באמצעות עדשת plan A per chromat 10x 0.4 עם קווי לייזר של 488, 543 ו-633 nanometer. שחזר חתכי Z סדרתיים באמצעות תוכנת Zeiss AIA vision 4.6 או תוכנת ניתוח תמונות דומה. סימון יעיל של כלי הדם העובריים הוא קריטי להערכת פגמים בכלי דם בעכברים עובריים. איורים אלה מראים סימון ספציפי של כלי דם בטימוס ב-E 16.5 וסימון משותף של a GS L one I selectin.עוברים שמוזרקו ב-B four עם CD 31 וכן צביעה של החדר הימני והשמאלי. בניסויים אלה נעשה שימוש בפרוטוקול B four לבתיקי קריו עבור GSL one I selectin. כאן מוצגת סימון במלואו (hole mount) של רשת כלי הדם בעור בעכברים בשלב E 16.5 בעקבות הליך זה.ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון סימון משותף (co-labeling) של תאי הסייסטמה ותאי דם יחד עם כלי הדם, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד תאי דם ותאי סייסטמה מקיימים אינטראקציה עם כלי הדם בעובר העכבר, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים?

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להערכת שינויים בכלי הדם האימהיים במהלך ההריון בעכברים. באמצעות שיטות סטריאולוגיות, שיפוץ העורקים הספירליים העשרוניים מוערך כמותית והתוצאות מאושרות איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

בדיקה echocardiographic משמש לעתים קרובות בעכברים. מכשירי אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יקר פותחו למטרה זו. פרוטוקול זה מתאר הליך echocardiographic סבירים בשילוב עם morphometric היסטולוגית ניתוחים כדי לקבוע מורפולוגיה לב.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

גישה חזותית לגרימת דוליכואקטזיה בעכברים כדי למדל תפקוד לקוי של כלי דם גדולים בתיווך כלי דם במוח

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

חקור שיטת תיוג כלי דם בעוברי עכברים באמצעות הזרקת צבע פלואורסצנטי לוריד הפנים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של מבנה כלי הדם ומסייעת בחקר השפעת מוטציות גנטיות על התפתחות מערכת הדם.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

גלה סרטונים נוספים