שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את השפעותיהן של מוטציות גנטיות ספציפיות על התפתחות ומבנה כלי הדם. דבר זה מושג על ידי נתיחה משותפת של העובר ושל רקמות חוץ-עובריות כדי לספק דגימה מתאימה להזרקה. לאחר מכן, מזריקים צבע פלואורסצנטי לווריד הפנים כדי לסמן את מערכת כלי הדם השלמה.

לאחר מכן, העובר מוכן לניתוח. לבסוף, דגימות שלם (hole mounts) או חתכים של כלי דם מסומנים מדגימים את המבנה התלת-ממדי של כלי הדם התקינים, על בסיס מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה (immunofluorescence) של דגימות שלם או חתכי רקמה. הרעיון לשיטה זו עלה בראשי לראשונה כאשר התעניינתי בקביעת נקודת הזמן ההתפתחותית שבה כלי הדם הפריפריים מתחברים לטימוס באמצעות אנגיוגנזה.

כדי להתחיל, הכינו FXI dextran או GS L one I selectin B four ב-PBS בתוך פרוביטת אפנדורף של 1.5 מיליליטר. הוסיפו 100 µL של תמיסת מרוכז 1.25 mM fast green PBS ל-FTSE dextran, או 180 µL ל-GS L one I select B four, כך שהתמיסות יהיו כחולות באופן גלוי. לאחר מכן, חממו את הפרוביטה ל-37 °C.

בצעו דיסקציה לעוברים בשלבים E 14.5 עד E 18.5 יחד עם שקיי החלמון, תוך השארת ה-Allen Toic stalk שלם. העבירו את העוברים לצלחית פטרי חדשה והטבילו אותם ב-PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מקמו עובר כך שיתקבל מבט סגיטלי של הפנים.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה למיקרו-דיסקציה, אחזו בעדינות בעובר באזור הראש. בעזרת מחט בכיל 30, הזריקו 50 µL של FXI dextran או GS L one I selectin B four לווריד הפציאלי (facial vein), כאשר קצה המחט מופנה לכיוון אחורי הראש. כאשר הצבע נראה בווריד הטבילי, הוציאו את המחט והפרידו את העובר מהלאן (lan).

שטיפה. השארו את העובר ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך שתי עד שלוש דקות כדי שהצבע יסבב בכל רחבי העובר. לאחר שהצבע סבב בכל רחבי העובר, הסירו דגימות עור מאזורי הגפיים, הגב והבטן.

שטפו את דגימות העור ב-PBS קר וקבעו אותן ב-4% paraldehyde PBS למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו אותן שלוש פעמים, 10 דקות בכל פעם, בבקבוקוני זכוכית שקופים בנפח ארבעה מיליליטר המכילים שני מיליליטר של PBS קר. הניחו את דגימות העור על זכוכיות מיקרוסקופ והוסיפו לכל זכוכית 100 µL של מדיום קיבוע (mounting medium) וכיסוי זכוכית.

יש להניח לשקופיות להתייבש בחושך לפני כן; ניתן לבצע הבהרה ב-BABB ולאחריה הדמיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של כלי הדם בעור. כדי להכין רקמות לחיתוך קריוגני, יש להקפיא במהירות עוברים שלמים בחנקן נוזלי. מרחו OCT על בלוק חיתוך והניחו עליו את העובר.

חתכו את הרקמה הקפואה לשכבות בעובי 10 micron ואספו אותן על עלויות. קבעו את השכבות באצטון למשך חמש עד 10 דקות, ולאחר מכן שטפו אותן שלוש פעמים ב-TBS קר בבלוק, ב-10% Donkey serum ב-TBS בתוך תא לחות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 100 microliters של נוגדן ראשוני לכל שכבה.

בדוגמה זו אנו משתמשים ב-rat anti-US CD 31 לסומן האנדותלום וב-goat anti-US P-D-G-F-R beta לסומן תאים פרי-וסקולריים, כדי להבטיח שהנוגדן יתפשט באופן אחיד על פני החיתוך. כסו את השקופיות ברצועות Parafilm שנגזרו בנפרד. דגרו את השקופיות למשך שעה אחת עד ללילה בתא לחות בטמפרטורה של 4 °C.

בשלב הבא, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-TBS קר. דגרו עם 100 µL של הנוגדנים המשניים המתאימים למשך 30 דקות לפחות. לבסוף, שטפו שלוש פעמים ב-TBS קר. הוסיפו 100 µL של תוכה לקיבוע (mounting medium) וזכוכית כיסוי לכל שקופית.

הניחו לשקיפות להתייבש בחושך. עבור חיתוך ב-vibram, הוציאו את אונוני התימוס מעוברים ושטפו ב-PBS קר. קבעו את הרקמה ב-4% paraldehyde PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר שטיפת הדגימות ב-PBS Triton X, מלאו מחסנית פלסטיק קטנה ב-4% low melt agarose PBS. טבלו את הדגימות ב-agarose PBS, תוך וידוא שהרקמה נמצאת במגע עם תחתית המחסנית. המתינו להתקשות ה-agarose על קרח.

לאחר מכן, השתמשו בסנאפר (להב תער) כדי להסיר את שאריות ה-agros. מרחו דבק על בלוק ה-VIBRAM והדביקו את הדגימה לבלוק. מזגו PBS קר למכאם המים של ה-Vibram עד שהדגימה והלהב יהיו טבולים.

הגדירו את המהירות והאמפליטודה. יש להפחית את האמפליטודה. אם חתכים נשברים עקב ערבוב מופרז, חתכו 50 חתכי רקמה.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את החתכים ל-PBS קר בפלטת מיקרו של 24 בארות; חסמו את החתכים ב-500 µL של סרום חמור 10% ב-PBS Triton X למשך 30 דקות. לאחר הוספת נוגדנים ראשוניים, כגון anti CD 31 ו-anti P-D-G-F-R beta, דגרו למשך שמונה שעות או למשך הלילה בפלטת מיקרו מכוסה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, שטפו שלוש פעמים ב-PBS Triton X לאורך זמן כולל של שמונה שעות ב-4 °C.

לאחר חסימה חוזרת של החתכים ודגירה בנוכחות נוגדנים משניים, שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS Triton X לאורך שמונה שעות בסך הכל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, קבעו מחדש את הדגימות ב-4%paraldehyde PBS למשך 30 דקות על קרח, ושטפו שלוש פעמים נוספות ב-PBS Triton X למשך 30 דקות על קרח. ייבשו את הדגימות באמצעות סדרת ריכוזים עולים של methanol PBS Triton X למשך 10 דקות בכל שלב.

לאחר מכן, החליפו את ה-100% methanol במתנול טרי והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הניחו את הדגימה על זכוכית כיסויה עם שקע (depression slide) וכסו את הדגימה בתמיסה של 1:1 של BABB ומתנול. הדגירו את הדגימות למשך 10 עד 15 דקות.

בשלב הבא, החליפו את התמיסה ב-100% BABB והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות או עד להשקיפות. הוסיפו זכוכית כיס ואטמו באמצעות שתי עד שלוש שכבות של לק ציפורניים. המתינו לייבוש לק הציפורניים בחושך ובטמפרטורת החדר.

ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C, אך יש לצלם את התמונות בתוך 12 עד 24 שעות. צלם חתכים קפואים בעובי 10 micron באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם עדשת plan A per chromat 20x 0.8 וקווי לייזר של 633, 543 ו-488 nanometer. רכוש חתכי Z קונפוקאליים בעובי one micron של חתכים טמיעים ב-aros בעובי 50 micron באמצעות עדשת plan A per chromat 10x 0.4 עם קווי לייזר של 488, 543 ו-633 nanometer. שחזר חתכי Z סדרתיים באמצעות תוכנת Zeiss AIA vision 4.6 או תוכנת ניתוח תמונות דומה. סימון יעיל של כלי הדם העובריים הוא קריטי להערכת פגמים בכלי דם בעכברים עובריים. איורים אלה מראים סימון ספציפי של כלי דם בטימוס ב-E 16.5 וסימון משותף של a GS L one I selectin.

עוברים שמוזרקו ב-B four עם CD 31 וכן צביעה של החדר הימני והשמאלי. בניסויים אלה נעשה שימוש בפרוטוקול B four לבתיקי קריו עבור GSL one I selectin. כאן מוצגת סימון במלואו (hole mount) של רשת כלי הדם בעור בעכברים בשלב E 16.5 בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון סימון משותף (co-labeling) של תאי הסייסטמה ותאי דם יחד עם כלי הדם, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד תאי דם ותאי סייסטמה מקיימים אינטראקציה עם כלי הדם בעובר העכבר, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים?