הקלטה בקנה מידה גדול הרכבים העצבית עם בדיקות הסיליקון ב עכברוש הרדים
19 באוקטובר 2011
הקלטות תאיים של הפעילות העצבית באמצעות בדיקות סיליקון החולדה הרדים יתוארו. טכניקה זו מאפשרת לקבל מידע על אזורי מוח מרובים יותר מ 100 נוירונים בו זמנית. הוא מספק מידע עם רזולוציה של תא בודד על הדינמיקה בתוך מעגלים עצביים הרכבים מקומיים רבים.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתאר הקלטה נוירונלית אקוטית רחבת היקף מקליפת המוח הסומטוסנסורית של הגפה הקדמית השמאלית והימנית, בו-זמנית בחולדה מורדמת, באמצעות גשוש סיליקון. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמת בעל החיים באמצעות יוּרֶתָן, ולאחר מכן על ידי הצבת החולדה במסגרת סטריאוטקסית כדי לבצע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים מעל הגולגולת. השלב השני הוא מיקום ברגי ההארקה והייחוס.
לאחר מכן מבצעים שתי קרניאוטומיות מעל קליפת המוח הסומטוסנסורית ומסירים את קרום העטיפה (dura mater). השלב האחרון הוא החדרה זהירה של גשש הסיליקון אל המוח והורדתו באיטיות לאזור הרצוי. הליך זה מאפשר הקלטה של פוטנציאלים שדות מקומיים ופעילות ספייקים מעשרות נוירונים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שגשש סיליקון מאפשר הקלטה ממספר רב של נקודות הקלטה. יתרה מכך, ניתן לסדר מספר נקודות הקלטה במרחק של מילימטרים, מה שמאפשר הקלטה בו-זמנית על פני מספר עמודים קורטיקליים או על פני מספר שכבות בעמוד קורטיקלי אחד. באופן חשוב, פיזור מדויק גיאומטרית של נקודות ההקלטה מאפשר לחקור קשרים מרחביים בין אוכלוסיות נוירונליות.
שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד פעילותה של אוכלוסיית נוירונים מעורבת בפלסטיות של זיכרון, קידוד גירויים וקבלת החלטות, וכן כיצד אינטראקציות עצביות אלו מושפעות מתרופות שונות. כדי להתחיל בהליך זה, הרדימו את החולדה באמצעות isoflurine בריכוז של 3% עד 4% ושמרו על ריכוז של 2% כדי למנוע מהבעל חיים לסבול ממתח בעקבות ההזרקה. לאחר מכן, הזריקו 7.5 milliliters per kilogram של תמיסת urethane מהולה בריכוז של 20% באופן אינטraperitoneal, וחלקו את ההזרקה הזו לארבעה יישומים, כאשר כל אחד מהם מופרד במרווחים של כ-30 דקות.
בשלב הבא, נקה את הגששים הסיליקוניים במים מזוקקים תחת המיקרוסקופ. צבע את הגששים באמצעות סמן פלואורסצנטי כדי לסמן את מיקומי הגששים בניתוח ההיסטולוגי. יש לבצע הליך זה תמיד תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהגששים אינם נפגעים או מתעקמים.
לאחר מכן, גלחו את הפרווה לאורך אתר החיתוך. לאחר מכן, מרחו משחה לשתי העיניים. ניתן מינון של 5 mg/mL של Dexamethasone תת-עורי כדי להפחית את דלקת המוח.
בשלב זה, קבע את החיה במסגרת הסטריאוטקסית. לאחר מכן, הכן את אזור הניתוח באופן אנטיספטי באמצעות סבון כלורהקסידין ואתנול; לפני ביצוע החתך, הזרק לידוקאין ואפינפרין תת-עורית באתר החתך לצורך אלחוש מקומי ועל מנת להפחית את הסיכון הפוטנציאלי לדימום. לאחר מכן, בצע חתך של שני סנטימטרים לאורך קו האמצע של הקרקפת והסר את העור.
לחשיפת הגולגולת, נקו את קרקפת הגב מהפציה באמצעות דיסקציה קהה והפסיקו את הדימום בעזרת שעוות עצם. לאחר מכן, קדחו שני חורים בעצם העורפי של הגולגולת. חברו את הברגים הקטנים לחורים עבור אלקטרודות ההארקה והסימוכין.
על בורג הייחוס להיות במגע עם הדורה. לאחר מכן, בצעו שני חורי קרניאוטומי בקוטר של 1 עד 2 מילימטר בקואורדינטות המתאימות לקליפה הסומטוסנסורית של הגפה הקדמית.
השתמש באוויר דחוס כדי להסיר את אבקת העצם לפי הצורך במהלך הקרניאוטומיה, כדי למנוע את התחממות הגולגולת כתוצאה מהקידוח. טפטף תמיסת סליין. לאחר מכן, בנה מחסום קטן משרף אקרילי סביב שתי הקרניאוטומיות, כדי לשמור על PBS מעל הדורה החשופה ולמנוע את התייבשותה.
יש להחיל PBS באופן רציף לאורך כל הניסוי. לאחר מכן, השתמשו בשתי מחטים בכיול 30.5 עם קצוות כפופים כדי להסיר את הקרומי העבה (dura mater) משני חלונות הקרניוטומיה. בשלב זה, מקמו את קצות הגששים מסיליקון במגע עם הקרומי הרך (pia).
לאחר מכן, הכניסו באיטיות את גששי הסיליקון, תוך וידוא שניתן להחדיר את זרועותיהם לתוך המוח ללא התנגדות או כיפוף. הרכיבו את הגששים בזהירות עד שיגיעו לאזורי ההקלטה הרצויים. במידת הצורך, הוסיפו טיפות של PBS על החלק העליון של הקרניוטומיה כדי למנוע מהרקמה להתייבש.
כאן מוצג רישום אלקטרופיזיולוגי מייצג של פוטנציאל השדה המקומי למשך 500 מילישניות מ-tetrode אחד. דוגמה לצורת הגל של הספייק מופיעה בתוך התמונה. להלן דוגמאות לתצפיות דו-ממדיות של מקבצי יחידות שהתקבלו מ-tetrode אחד.
כל אשכול מייצג פריקה (spike) מנוירון בודד. מוצגות כאן צורות הגל הממוצעות של הפריקות מהיחידות המייצגות בכל אחד מארבעת הערוצים של טטרוד בודד. גרף זה מציג את אנרגיית גל הפריקות שהוקלטו לאורך זמן.
שימו לב כי ערך האנרגיה הקבוע יחסית עבור כל יחידה מעיד על הקלטה יציבה לאורך התקופה המוצגת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם תהיו מסוגלים לבצע הקלטות באמצעות גשושית סיליקון באזורי מוח מרובים ממעל למאה נוירונים בו-זמנית. הדבר מושג על ידי ביצוע השלבים הבאים: הרדמת בעל החיים, מיקום ברגי הייחוס וההארקה, ביצוע קרניאוטומיה (קידוח בגולגולת), הסרת הקרומים (dura), ולבסוף החדרת הגשושית לאזור ההקלטה הרצוי.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה להקלטות עצביות אקוטיות בהיקף רחב מקליפת המוח הסומטוסנסורית של הגפה הקדמית בחולדות תחת הרדמה, באמצעות גששים מסיליקון. טכניקה זו מאפשרת הקלטות סימולטניות מיותר מ-100 נוירונים באזורי מוח מרובים, ובכך מספקת תובנות לגבי דינמיקה ואינטראקציות עצביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- דינמיקה נוירונלית
רקע
- גששים מסיליקון מאפשרים הקלטות בצפיפות גבוהה ממספר רב של נוירונים.
- הבנת הפעילות של אוכלוסיות נוירונים היא חיונית להשגת תובנות לגבי זיכרון, קידוד וקבלת החלטות.
- טכניקות הקלטה יכולות להיות מושפעות מגורמים שונים, כולל הרדמה ודיוק כירורגי.
- הקלטות רחבות היקף יכולות לחשוף קשרים מרחביים בין אוכלוסיות נוירונים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה להקלטת פעילות נוירונלית בקליפת המוח הסומטוסנסורית.
- לבחון כיצד אינטראקציות נוירונליות תורמות לתפקודים קוגניטיביים.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים המעוניינים בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת החולדה באמצעות urethane ו-isoflurane.
- מיקום בעל החיים במסגרת סטריאוטקסית לצורך ניתוח מדויק.
- ביצוע קרניוטומיה והחדרת גששים מסיליקון אל הקורטקס.
- הקלטה של פוטנציאלי שדה מקומיים ופעילות ספייקים של נוירונים.
תוצאות עיקריות
- הקלטות מוצלחות ממספר נוירונים לאורך שכבות קורטיקליות.
- הדגמת יציבות של ההקלטות לאורך זמן.
- אספקת דוגמאות של נתונים אלקטרופיזיולוגיים שנאספו במהלך הפרוצדורה.
- הדגשת היתרונות בשימוש במגשים מסיליקון להקלטות רחבות-היקף.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של פעילות נוירונלית.
- היא יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות משמעותיות במדעי המוח בנוגע לאינטראקציות נוירונליות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקה זו כדי לחקור תופעות נוירולוגיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטות באמצעות גששי סיליקון בקנה מידה רחב בקורטקס של חולדה תחת הרדמה מאפשרות מיפוי ברזולוציה גבוהה של פעילות אנסמבלים נוירונליים, ובכך תומכות בהסרה של סיכונים מנגנוניים ובתיקוף מטרות בתהליכי גילוי תרופות נוירולוגיות. גישה זו מספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציה מרחבית, החיוניים להערכת השפעות של תרופות ברמת המעגל המוחי ולסיוע בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של ניהול פורטפוליו. יכולת השחזור והסקביליות של השיטה ממצבות אותה כבסיס תשתיתי למחקר ופיתוח במידתם של מדעי העצבים התרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של תפקוד מעגלים עצביים ומודולציה המושגית על ידי תרופות ברמת האוכלוסייה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת קשרים מרחביים ותפקודיים בין תתי-סוגים של נוירונים.
- מספק ראיות כמותיות למעורבות של מטרה (target engagement) ולבדיקת היפותזות מכניסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקל על הכנת מערכות עצביות מתוקפות עבור סריקת תרכובות ופיתוח בדיקות אלקטרופיזיולוגיות.
- מספק הקלטות רב-אתריות סטנדרטיות וניתנות לשחזור להשוואה חסונה בין תנאים ניסויים.
- מאפשר הערכה בסביבת תפוקה גבוהה של השפעות תרכובות על פעילות של מקבצי נוירונים.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי לכידה של סמנים ביולוגיים ברמת המעגל ונקודות סיום תפקודיות.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לביצוע ניתוחים חוצי-מצבים וחוצי-אזורים.
- מספק נתונים ניבויים לקידום מותאם-סיכון של תרכובות נוירו-אקטיביות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו להקלטה באמצעות גשושית סיליקון נשמרת כחלק מהרצף שבין השלב הגילוי למשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים באמצעות מיפוי פעילות נוירונלית ברמת האנסמבל.
- סריקה: מספקת הקלטות עצביות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים כמותיים של ספייקים ופוטנציאל שדה להשוואה סטטיסטית של קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של חתימות עצביות פרה-קליניות עם נקודות סיום רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור מו"פ נוירו-פרמצבטיקה מרובה פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מספק נתונים עצביים סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור לאורך מחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון באמצעות אספקת נתונים חסונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדירת עדיפויות מותאמת סיכונים ובקידום של נכסים נוירו-אקטיביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה in vivo ובניתוחים סטריאוטקסיים.
- מחייב גישה לגששים מסיליקון בצפיפות גבוהה ולמערכות הקלטה רב-ערוציות.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולים כירורגיים ואנליטיים בין צוותים שונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות אילוצים של הכנה אקוטית והשפעות של הרדמה על הפעילות העצבית.
