Name: Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp ציפס NRCC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למדו תיעוד פעילות אלקטרופיזיולוגית בתאי עצב בתרבית באמצעות שבבי patch-clamp שטוחים. השיטה מאפשרת חקר תפקוד ערוצי יונים ברשתות עצביות וסינון תרופות ביעילות בינונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות אלכסיי בוגדנוב עבור ייצור של תיקון, מהדק שבבי ב CPFC, וגוון טראן, פינג זאו ומתיו שיו לעזרה עם הרכבה. Naweed סייד נתמך על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) גרנט. קולין לוק הוא חתן NSERC ו אלברטה הקרן למורשת למחקר רפואי (AHFMR) studentships.

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תיקון-clamp של NRCC החקירה פלטפורמת השבבים הוא כלי רב עוצמה פוטנציאלי גבוהה מבחני תוכן ומידע התרופות לחקור במודלים חוץ גופית של המחלה. יתרונות לעומת בטפי להחדרת נוזלים זכוכית הם התנגדות גישה נמוכה, המהווה יתרון לחקור תאים גדולים, ולמרות קיבול מעט יותר תגרום דינמיקה דומה של תאים קטנים יותר. תא ספונטנית חותמות צוהר התקבלו באופן שגרתי, והכניסה לתא כולו נצפתה להיות ספונטנית 14. הבדל ברור בין שבבי ואת שיטת פיפטה זכוכית היא העובדה כי בדיקה הוא חלק מנה תרבית תאים ולא מובא באופן ידני במגע עם קרום התא. Culturing תאים, אולי חלק של רשתות פונקציונליות, התוצאות במודלים רלוונטיים מבחינה ביולוגית יותר כמודלים מחלות, מנגנון שונה לאבטחת התא גבוהה לחקור כלבי ים 16. עם זאת, בניגוד השעיות סלולריים, השאיפה cannoלא ניתן להשתמש כדי למקם את התא על החללית. נוירונים חילזון, כמו תאים גדולים אחרים, ניתנים המיקום ידנית על גבי החללית. עבור תאים קטנים הדורשים פעמים תרבות ארוכות יותר, יש לנו חסכה מניפולציה כלשהי ולשמור על הסתברות גבוהה של קבלת החותם של פוליפפטידים דפוסים הדבקה על גבי הבדיקות להציב תאים על גבי הבדיקות, והפגינו מיקום של תאים על בדיקה 17,18. NRCC היא גם מפתחת שבב polyimide microfluidic תיקון, מלחציים 19 עם קיבול דומה לזה של זכוכית פיפטה. המטרה הסופית של הפרויקט היא מרובה בדיקות תיקון-מהדק שבב המאפשר ניטור סימולטני של פעילות אלקטרו של נוירונים מספר העוסקים בהתנהגות רשת ברזולוציה של תעלות יונים בודדים 14. שיטה זו היא שיטה ברזולוציה גבוהה משלים מרובת אלקטרודה arrays 20.

culturing ו electrophysiology של תאים על patch-clamp צ&#39;יפס nrcc

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

בשל הרגישות המעודן שלה ואת היכולת לפקח ולשלוט תאים בודדים ברמה של תעלות יונים, תיקון, הוא מהדק את תקן הזהב של electrophysiology ליישם מודלים מחלות ומסכי התרופות כאחד 1. השיטה המסורתית כוללת בעדינות ליצור קשר סלולרי עם טפטפת זכוכית מלאה של פתרון פיזיולוגי כדי לבודד את תיקון של קרום מתחת לשיאה 2. האלקטרודה הוכנס פיפטה לוכד יונים ערוצים הפעילות תוך תיקון קרום או, כאשר מקרע, לתא כולו. בעשור האחרון, תיקון, מהדק שבבי הוצעו גם חלופה 3, 4: הסרט הושעה מפריד בינוני פיזיולוגי ממדיום תרבות, צמצם microfabricated בסרט מחליף את שיאו של טפטפת. Patch-clamp שבבי השתלבו במערכות אוטומטיות ממוסחרים לסינון תפוקה גבוהה 5. כדי incrלהקל על התפוקה, הם כוללים משלוח fluidic של תאים מן ההשעיה, המיקום שלהם על הפתח על ידי שאיבה, ואת השגרה אוטומטיות לגילוי תאים ל-בדיקה חותמות ולהיכנס למצב התא כולו. יש לנו דיווח על ייצור של שבב סיליקון תיקון, מלחציים עם עכבה אופטימיזציה צורת פתח המאפשר הקלטה באיכות גבוהה של פוטנציאל פעולה של נוירונים בתרבית 6 חלזונות, לאחרונה, דיווחנו גם התקדמות לקראת לחקור נוירונים יונקים 7. שבבי תיקון, מהדק שלנו מיוצרים על הקנדי Photonics ייצור מרכז 8, היציקה מסחרי, והם זמינים בסדרה גדולה. נשמח לקיים שיתופי פעולה עם electrophysiologists כדי לאמת את השימוש בטכנולוגיה NRCC במודלים שונים. השבבים משמשים על פי התוכנית הכללית מיוצג באיור 1: שבב סיליקון היא בחלק התחתון של בקבוקון תרבות הפרספקס האחורי של הצמצם מחובר chann תת קרקעיאל מצויד עם צינורות בכל צד של החבילה. תאים בתרבית בבקבוקון ושל התא על גבי החללית מנוטר על ידי אלקטרודה המדידה מוכנס 2 channel.The מחוץ יציאות fluidic להקל על חילופי פתרון עם הפרעה מינימלית לתא, זה יתרון לעומת בטפי להחדרת נוזלים זכוכית עבור תאיים זלוף. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עקרון המדידה באמצעות שבב NRCC תיקון, מהדק אנחנו כאן בפירוט את הפרוטוקולים כדי לעקר וראש צ 'יפס, לטעון אותם עם צלחת בינונית, אותם תאים, ולבסוף להשתמש בהם הקלטות אלקטרו.

אנחנו מראים איך מישורי תיקון, מהדק שבבי מפוברק המועצה הלאומית למחקר של קנדה מעוקרים, דרוך, עמוסה בינונית, מצופה בתאים, ושימשו הקלטות אלקטרו.

Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ&#39;יפס NRCC

בשל הרגישות יוצאת הדפס שלה והיכולת לנטר ולשלוט על תאים בודדים ברמת תעלות היונים, שיטת ה-patch-clamping היאe רמה המקובלת כ"סטנדרט הזהב"...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להקליט פעילות אלקטרופיזיולוגית של תאים בתרבית באמצעות שבב planar patch clamp. זאת מושג על ידי עיקור, הכנה (priming) ובדיקה של שבבי ה-patch clamp כדי לאפשר גידול של תרבית תאים וניטור עוקב של הפעילות האלקטרופיזיולוגית שלה. לאחר הבדיקה ניתן לאחסן את השבבים עד להכנתם מחדש במעבדת ביולוגיה של התא.כשלב הבא, נוירונים מופקים מגפיים, זנבות, ומגודלים על השבבים. לבסוף, השבבים מחוברים למגבר patch clamp כדי לנטר את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התאים. היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שבבי patch clamp שטוחים קיימים הוא שהיא מתאימה לשימוש עם נוירונים המקימים תרבית, מה שמאפשר חקירה של תקשורת סינפטית בין נוירונים.שיטה וגישה זו יאפשרו הבנה טובה יותר של תפקודי תעלות יונים בתאים מעוררים המוטמעים בתוך רשת נוירונלית, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים. ההשלכות של שיטה זו משתרעות לתחום הפרמקולוגיה, שבו ניתן להשתמש בה לביצוע סריקות תרופות עבור תעלות יונים וחלבונים קולטנים בעלות תפוקה בינונית ותוכן מידע גבוה. בחרנו להדגים שיטה זו באמצעות נוירונים של חלזונות מכיוון שניתן למקם ולתרבת נוירונים אלו בקלות.ומכיוון שנוירונים אלו יבנו מחדש רשת בתרבית, הם מהווים מודל מצוין למחקרים של טרנספורמציה. חשוב מכך, ניתן להשתמש בשבבים אלו גם במערכות תאים אחרות, כגון תאי לב ותאי סרטן. האתגר העיקרי בשימוש בשבבי planar patch clamp הוא השגת שבבים עם מפתחים נקיים, וכן זריעת התאים וגידולם בתרבית.שבבים שאינם מחוברים יהיו לא יעילים, ולכן כל השבבים נבדקים לפני השימוש. הנקודה הקריטית ביותר בהערכה האלקטרופיזיולוגית מתרחשת לאחר שביקרו את התאים בתרבית. היא כוללת את יצירת ה-giga seal בין ממברנת התא לשפת העליונה של השבב.כל שבבי ה-patch clamp הפלנטריים שיוצרו השתמשו בתאים מבודדים בתליה והסתמכו על יניקה כדי למשוך תאים אל הפתח ליצירת חסם ג'יגה (giga seal). יצירת ה-GigE בשבבים שלנו מתרחשת באופן ספונטני.בזמן שהנוירונים נמצאים בתרבית ואינם תלויים בשאיבה, אני אדגים את שלבי הסטריליזציה והסינון של השבב. טניה תסביר את תהליך הטעינה במעבדת ביולוגיה של התא, קולין ידגים את הכנת התאים והזריעה שלהם. לבסוף, מרסיה תראה כיצד מתבצעות ההקלטות שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע סטריליזציה לשבבים במנקה פלזמה בסיסי של heric עם לחץ אוויר שיורי של 0.1 עד 0.3 millibars למשך 15 דקות בהספק מרבי של 18 watts.טיפול הפלזמה הופך את השבב להידרופילי, מה שמקל על תהליך ההחדרה (priming). לאחר מכן, חברו לצינורות הזכוכית צינורות סיליקון מעבדה אלסטיים וסטריליים, באורך של שלושה אינץ' בקצה אחד ואינץ' אחד בקצה השני. לאחר מכן, מלאו את הצינורות בתמיסת בופר פוספט סטנדרטית סטרילית, תוך וידוא שאין בתוכם בועות אוויר כלואות.סגרו את צינור הסיליקון הארוך באמצעות תלישה (Clip) תוך הפעלת לחץ של אטמוספירה אחת על ה-PBS מהקצה הקצר. לאחר מכן, שחררו את הלחץ בתעלת הזרימה. לאחר מכן, מלאו את הבקבוקון ב-PBS באמצעות מזרק.טבלו אלקטרודת כסף/כסוף כלוריד בתוך הבקבוק ואלקטרודת עזר בתוך השפופרת הקצרה. השתמשו במד עכבה כדי לוודא שהתנגדות הגישה היא בין 300 kilo ohms ל-three mega ohms, וקיבול השנט הוא בין 10 pico ferriday ל-25 pico ferriday. לאחר מכן, שטפו את התעלה הפלואידית במים דה-יוניים סטריליים.רוקנו את המבחנה העליונה וחזרו על תהליך השטיפה פעמיים. לאחר מכן, טבלו את חבילת השבבים עם המבחנות במים דה-יוניים סטריליים וטריים למשך 30 דקות. לאחר מכן, העמיסו שבבים נוספים למכל סטרילי מלא במים דה-יוניים סטריליים.פעולה זו מבטיחה שהשבבים יישארו הידרופיליים ומוגנים מזיהום. פתח מכל שבבים תחת מbottlecap זרימה למינרית עם סינון HEPA והוצא את השבבים כאשר המבחנה העליונה פונה כלפי מטה, כדי למנוע זיהום משאריות אריזה הצפות על פני המים. כדי להסיר שאריות לכלוך מפני השבב, שטוף את המבחנה העליונה פעמיים במים דה-יוניים סטריליים מסוננים. חבר קצה אחד של צינור הגומי המחובר לתעלת הנוזלים למזרק בלחץ המכיל מים דה-יוניים סטריליים מסוננים.במערכת זו, המים במזרק נמצאים תחת לחץ באמצעות מיכל אוויר דחוס המכוון לאטמוספירה אחת, כדי להבטיח שהאוויר יעבור סינון לפני כניסתו למזרק. מערכת זו מצוידת גם בשני שסתומי פתיחה-סגירה (on-off valves) המאפשרים את בקרת הלחץ בעת הצורך. סגרו את קצה היציאה של מערכת הזרימה באמצעות תפס כירורגי (hemostat).בשלב הבא, פתח את שסתום מיכל האוויר הדחוס כדי להגביר את הלחץ של התמיסה. לאחר מכן, פתח את התפסן (hemostat) בקצה היציאה של מערכת הזרימה כדי לשטוף את השבב במים דה-יוניים סטריליים טריים. סגור את קצה היציאה של מערכת הזרימה באמצעות תפסן כדי לדחוף את המים מעלה דרך הפתח.כדי למנוע ניקוז של מים, קבעו את הכניסה של מערכת הזרימה באמצעות המוסטט וסגרו את שסתומי הפתיחה והסגירה. לאחר מכן, נתקו את קצה הכניסה של הצינורית מהמזרק. אטמו את שני קצוות הצינורית והסירו את ההמוסטטים.מלאו את המבחנה העליונה במים דה-יוניים סטריליים מסוננים. לאחר מכן, הניחו את המכסה של צלחת סטרילית בקוטר 35 מילימטר על בסיס של צלחת סטרילית בקוטר 100 מילימטר. לאחר מכן, הניחו שבב על גבי המכסה של ה-35 מילימטר וכסו במכסה של צלחת 100 מילימטר.כדי להבטיח שהממברנה והפתח של השבבים נקיים משאריות או בועות אוויר, מבצעים דמיון של השבבים. אם נמצאו שאריות או בועות אוויר, שוטפים את התעלה הפלואידית ואת הבקבוק העליון שוב ושוב במים סטריליים.אם לא ניתן להסיר את השאריות או את בועות האוויר, השבב נפסל. לאחר צילום השבבים, העבר אותם חזרה למנדף הזרימה הלמינרית. נתק את שני קצות הצינורית.חברו קצה אחד של הפיתול למזרק בלחץ המכיל מדיום פיזיולוגי, וסגרו את קצה היציאה של הפיתול באמצעות המוסטט כדי לשטוף את התעלה הפלואידית התת-קרקעית במדיום פיזיולוגי. פתחו את שסתומי הפתיחה/סגירה והסירו את ההמוסטט מקצה היציאה של הפיתול כדי לדחוף את המדיום הפיזיולוגי מעלה דרך הפתח; סגרו את קצה היציאה של הפיתול באמצעות ההמוסטט, סגרו את קצה הכניסה של הפיתול באמצעות ההמוסטט וסגרו את שסתומי הפתיחה/סגירה. לאחר מכן, הסירו את קצה הכניסה של הפיתול מהמזרק ואטמו את שני קצות הפיתול באמצעות פקקי זכוכית.לאחר מכן הסר את התפסני העצירה. לאחר מכן, הוצא את המים מהמבחנה העליונה. מלא את המבחנה העליונה במצע סטרילי מסונן.החזירו את השבב לצלחת ה-100 millimeter. לאחר מכן, הניחו את בסיס הצלחת של ה-35 millimeter בתוך צלחת ה-100 millimeter ומלאו אותה במים דה-יוניים סטריליים מסוננים כדי להגביר את הלחות. לאחר מכן, כסו את הצלחת עד למועד הזריעה.כדי להתחיל בהליך זה, הסיר את הקליפה החיצונית מ-li sags בני חודשיים עד שלושה באמצעות פינצטה קהה. לאחר מכן, הרדם את בעלי החיים בתמיסת limba saline המכילה 10% Listerine תחת מנדף זרימה למינרית. הצמד את החלזונות לדשנית cell guard מלאה ב-limba saline והוצא את המוח כולו.בשלב הבא, טפלו במוחות המבודדים בתוך מצע מוגדר בעזרת אנזים trypsin למשך 18 דקות. לאחר מכן, טפלו בהם במצע מוגדר ובמעכב trypsin. למשך 15 דקות, מקאו את המוחות לצלחת תאי הגנה קטנה המלאה במצע מוגדר בעל אוסמולריות גבוהה, באמצעות פינצטה עדינה ומספרי דיסקציה.הסיר את המעטפת החיצונית והפנימית של הגנגליונים הרלוונטיים וחשוף את הנוירונים. לאחר מכן, חבר פיפטת זכוכית שעברה התלהוט (fire polished) ומלאה במצע מוגדר בעל אוסמולריות גבוהה למזרק מיקרוסקופי, והפעל בעדינות יניקה בקרבת התא הרלוונטי עד שהנוירון ניתק מהמוח והוא תלוי בתוך הפיפטה. לאחר החלפת המצע במערכת הזרימה של שבב העצבים (neuro chip) לתמיסת הקלטה מתאימה, הטה את פיפטת הזכוכית לתוך מבחנה לתרבית וחשוף בעדינות את הנוירון מעל הפתח של השבב.השאירו את התאים ללא הפרעה למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר כדי לעודד את היצמדותם למשטח השבב שסביב הפתח. החליפו את התמיסה בצלחת התרבית בתמיסת ההקלטה המתאימה לצורך יציבות. הדביקו את השבב על עלית זכוכית והניחו אותה תחת מיקרוסקופ כדי לחבר את השבבים למגבר.גזרו את הקצה הארוך של הצינורית והכניסו את תיל הכסף המחובר לראש הבמה (head stage). לאחר מכן, הניחו את אלקטרודת הייחוס בצלחת תרבית השבב. השבב מוכן כעת להקלטה.כאן מוצגת דוגמה של תגובות מתח של נוירון גבי דורסלי שמאלי של הפדל לסדר מדורג של פולסי זרם תוך-תאיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין היטב כיצד להקליט את הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תאים בתרבית באמצעות שבב planar patch clamp. זכרו שבשלב הראשון אנו סורקים את השבבים כדי לוודא ששבבים שלא שימשו לזריעת תאים אינם סתומים; משתמשי Ture biology מתחילים משלב הטעינה ובדרך כלל עדיין מוצאים מספר שבבים חסומים בכל סדרה.שיטה חדשה זו מהווה פריצת דרך חשובה בפיתוח טכנולוגיה זולה המאפשרת בחינה של רשתות עצביות in vitro ברמת רזולוציה חסרת תקדים. טכנולוגיה זו עשויה להוביל לפיתוח בדיקות מתקדמות לזיהוי מטרות טיפוליות, פיתוח תרופות והערכה אבחנתית. פיתוח נוסף של טכנולוגיה זו יספק לחוקרי בריאות אמצעים חדשים לבחינת טיפולים חדשניים למחלות או הפרעות נוירולוגיות.הפוטנציאל שלו משתרע לתאי לב, לסרטן ולתאים אחרים בעלי תכונות אלקטרוגניות.

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

בסרטון זה, תרביות תאי כליה עובריים המבטאים חלבוני תעלות יונים תלויי אור המאוחים עם כתב פלואורסצנטי מדגימות את השפעת האור על תנועת היונים. מהדק טלאי תא שלם משמש לניטור תנועת היונים.

רישום אלקטרופיזיולוגיה אופטוגנטית של תאים עם תעלות יונים תלויות אור

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

נוירונים חושיים מאותתים מידע חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. זיהוי נוירונים אפרנטיים ספציפיים יעזור בהבנת הפיזיולוגיה שלהם. אנו מתארים שיטה של תיוג לאחור לזיהוי נוירונים אפרנטיים, וחוקרים את תעלות היונים עם שער המתח בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה של מהדק טלאי.

זיהוי אוכלוסיות נוירונים חושיים ספציפיים לחקר תעלות יונים מבוטאות

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

פרוטוקולי לולאה סגורה הופכים נפוצים יותר ויותר באלקטרופיזיולוגיה המודרנית. אנו מציגים דרך פשוטה, רב-תכליתית וזולה לביצוע פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים מורכבים בנוירונים פירמידליים בקליפת המוח במבחנה, באמצעות מחשב שולחני ולוח רכישה דיגיטלי.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

מתוארת שיטה לגירוי פעילות חשמלית של תרביות תאים במבחנה עם אור נראה, המבוססת על שימוש בפולימרים אורגניים מוליכים למחצה.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל מבטיח במבחנה לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ומידול מחלות. כאן אנו מפרטים פרוטוקול למדידת התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה של hiPSC-CMs.

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

למדו תיעוד פעילות אלקטרופיזיולוגית בתאי עצב בתרבית באמצעות שבבי patch-clamp שטוחים. השיטה מאפשרת חקר תפקוד ערוצי יונים ברשתות עצביות וסינון תרופות ביעילות בינונית.

Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ'יפס NRCC

גלה סרטונים נוספים