שינוי כיוון והכיוון של השדה החשמלי במהלך יישום קטניות החשמל משפר את העברת גנים פלסמיד במבחנה
12 בספטמבר 2011
Transfection ג'ין ידי electroporation הוא השתפר בכ פעמיים כאשר הכיוון של השדה החשמלי משתנה במהלך יישום הדופק, תוך כדאיות התא אינו מושפע. הגידול transfection גן נגרמת על ידי גידול של אזור קרום המורכב המוסמכת לכניסת ה-DNA לתוך התא.
העברה גנטית באמצעות אלקטרודות היא שיטה פיזיקלית המשמשת להחדרת גנים לתאים על ידי יישום פולסים חשמליים קצרים ועוצמתיים. בהעברה גנטית מוצלחת באמצעות אלקטרודות, מעורבים מספר שלבים: יצירת קומפלקס בין ה-DNA לממברנת התא, תעתוק של ה-DNA דרך הממברנה המפולסת, מעבר של ה-DNA מהציטופלזמה אל הגרעין, וביטוי גנטי. פרוטוקולים שונים של פולסים חשמליים משמשים כדי להשיג טרנספקציה גנטית מקסימלית.
אחת מהן היא שינוי כיוון השדה החשמלי במהלך הולכת הפולסים. בסרטון זה, אנו מדגימים את ההבדל ביעילות העברת הגנים דרך אלקטרודות כאשר כל הפולסים מועברים באותו כיוון לעומת כאשר הפולסים מועברים בכיוונים משתנים. על ידי שינוי כיוון השדה החשמלי, בוצעו ניסויים בתאי שחלה של המסטרים הסיני, CHOK one, עבור הניסוי.
בצע את השלבים הבאים: גדל תאים בבדילת תרבית במדגרה למשך 24 שעות. ביום הניסוי, הכן תרחיף תאים באמצעות טריפסין עם 0.25% trips in EDTA solution וספור את התאים; סבב את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1000 rotations per minute בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, והשעה מחדש את משקעי התאים ב-ISO OSM Miller sodium phosphate buffer לצפיפות תאים של 5 מיליון תאים למיליליטר. העבר את הדגימה לצלח המתאים; התאים נחשפים לשדה חשמלי בתוך קצה פנפיה (pipe tip) בעל אלקטרודות מובנות המחוברות למחולל אב-טיפוס למתח גבוה.
אלקטרודות אלו מאפשרות הפעלת שדה חשמלי הומוגני יחסית בכיוונים שונים. הקצה והגנרטור פותחו במעבדה של הפקולטה לביוסיבנטיקה להנדסת חשמל באוניברסיטת Luana. הוסף את הפלסמיד E-G-F-P-N one לתליה של תאים בריכוז של 10 micrograms per milliliter.
ערבבו היטב את התאים עם ה-plasmid DNA והדרימו את התערובת למשך שתי עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר לפני הפעלת הפולסים החשמליים. שאבו 100 µL של תרחף תאים אל קצה הפ pipette עם אלקטרודות מובנות. בניסוי זה, רכבת של שמונה פולסים מרובעים מופעלת באמצעות מחולל אב-טיפוס במתח גבוה; בפרוטוקול הראשון נעשה שימוש בפרוטוקולי שדה חשמלי שונים.
כל הפולסים מועברים באותו כיוון, בעוד שבפרוטוקול השני, הפולסים מועברים על ידי שינוי כיוון השדה החשמלי. ניתן להשתמש בפרוטוקול השני רק עם מחולל פולסים מתאים, המאפשר יישום של פולסים חשמליים בכיוונים שונים. מיד לאחר יישום הפולסים, העבר את התאים מקצה הפיפטה לתוך פלטות של שש בארות והוסף fetal bovine serum.
דגרו את התאים למשך חמש דקות ב-37 °C בנפח של 25% מנפח הדגימה. כדי לאפשר סגירה מחדש של ממברנת התא, הוסיפו 2 mL של HAMF 12 לכל דגימה בלוח של שישה בארות, ודגרו את התאים למשך 24 שעות ב-37 °C באטמוספירה לחה של 5% CO2 באינקובטור. יעילות העברת הגנים באלקטרופורזה נקבעת כאחוז התאים המבטאים GFP כ-24 שעות לאחר יישום הפולס.
את התאים בוחנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בתוכנת הרכישה. הגדירו את אורך גל העירור ל-488 nanometers ובחרו מסנן Band pass מתאים לתמונה פלואורסצנטית ירוקה כדי לזהות את התאים המבטאים GFP. רכשו לפחות חמש תמונות, בניגוד פאזה (phase contrast) ובפלואורסצנציה ירוקה, בהגדלה של 20 פעמים.
ספירה של תאים בתמונה בניגוד פאזה (phase contrast) ותאים המבטאים GFP בתמונת פלואורסצנציה ירוקה תחת הגדלה של העדשה. קבע את אחוז יעילות העברה הגנים החשמלית על ידי חלוקת מספר התאים המבטאים GFP במספר כל התאים בכל תמונה תואמת. אחוז התאים המבטאים GFP כאשר כל הפולסים מועברים באותו כיוון, לעומת מצב שבו הפולסים מועברים תוך שינוי כיוון השדה החשמלי, מוצג באופן שבו שינוי כיוון השדה החשמלי מעלה משמעותית את אחוז התאים המבטאים GFP.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן טרנספקציית גנים באמצעות אלקטרופורציה, תוך הדגשת ההשפעה של כיוון השדה החשמלי על יעילות הטרנספקציה. הממצאים מצביעים על כך ששינוי כיוון השדה החשמלי במהלך יישום הפולסים יכול להכפיל את שיעורי טרנספקציית הגנים מבלי לפגוע בחיוניות התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרפיה גנומיקה
- ביולוגיה של התא
- טכניקות אלקטרופורציה
רקע
- העברה גנטית באמצעות אלקטרודות היא שיטה להחדרת גנים לתאים.
- היא כוללת הפעלת פולסים חשמליים קצרים ועוצמתיים כדי להקל על כניסת ה-DNA.
- טרנספקציה מוצלחת דורשת מה-DNA לחצות את קרום התא ולהיכנס לגרעין.
- פרוטוקולים שונים של פולסים חשמליים יכולים להגביר את יעילות הטרנספקציה.
מטרת המחקר
- להערכת השפעת כיוון השדה החשמלי על יעילות התעתוק של גנים.
- לקביעה האם שינוי הכיוון משפיע על חיוניות התאים.
- להדגמת התהליך באמצעות תאי שחלה של המסטר הסיני (CHO).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החלת פולסים חשמליים על תאי CHO.
- השוואה של יעילות הטרנספקציה עם אוריינטציות שונות של השדה החשמלי.
- הערכת חיוניות התאים לאחר הטרנספקציה.
- ניתוח כניסת ה-DNA לתאים וביטוי הגנים העוקב.
תוצאות עיקריות
- יעילות הטרנספקציה של הגנים השתפרה בכשתיים עם שינוי כיוון השדה החשמלי.
- לא נצפתה השפעה משמעותית על חיות התאים.
- שטח ממברנה מוגדל תרם לכניסה מוגברת של DNA.
- הוכשבה האפקטיביות של פרוטוקולים שונים של פולסים חשמליים.
מסקנות
- שינוי כיוונו של השדה החשמלי במהלך יישום הפולס משפר משמעותית את טרנספקציית הגנים.
- ניתן למצעגן שיטה זו מבלי לפגוע בבריאות התאים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון פרוטוקולים נוספים לשיפור אספקת הגנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
אופטימיזציה של כיוון השדה החשמלי במהלך אלקטרופורציה משפרת את יעילות העברת הגנים של פלסמידים, ומציעה אסטרטגיה לא-ויראלית לשיפור תשואות הטרנספקציה בתהליכי אימות מטרות וזיהוי מובילים בשלבים מוקדמים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הגברת חדירת ה-DNA באמצעות הרחבת כשירות הממברנה מבלי לפגוע בחיוניות התאים, ובכך משפרת את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים. שיטה זו מאפשרת העברת גנים הניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב עבור פיתוח בדיקות ויישומים של סריקה פנוטיפית במחקר ופיתוח של ביו-פרמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: הגדלה של שטח הממברנה המסוגל לכניסת DNA, דבר המשפר את יעילות הטרנספקציה ותומך באישור פונקציונלי של המטרה במחקרי ביטוי של חלבון רקומביננטי.
- ערך תפעולי: מאפשר העברה עקבית של פלסמידים על פני אוכלוסיות תאים, ובכך מפחית שונות בשלבים מוקדמים של בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של יעילות העברת גנים, התואמות לפלטפורמות של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרמטרי electroporation באמצעות קצוות אלקטרודה משולבים ומחוללי פולסים תכנוניים, ובכך משפר את השחזוריות של הבדיקה בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: תומך בהכנה ניתנת להרחבה (scalable) של שורות תאים שעברו טרנספקציה עבור בדיקות של מעורבות מטרות (target engagement) ובדיקות ביומרקרים בשלבים הבאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על חיוניות התאים לאחר טרנספקציה, מה שמאפשר מחקרים אורכיים של ביטוי גנים והשפעות פנוטיפיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ערך תפעולי: מקל על יצירת מודלים פרה-קליניים עם טרנספקציה יציבה או זמנית באמצעות תאי CHO, מאחסט נפוץ לייצור ביולוגים ולניתוח מסלולים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), כאשר נדרש הובלה יעילה של גנים כדי להעריך את תפקוד המטרה ולבצע מודולציה של מסלולים במודלים תאיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות אפשור ביטוי יתר (overexpression) או השתקה (knockdown) אמינה של גנים רצויים בתאים של יונקים.
- סריקה: מספקת תוצרי טרנספקציה כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה של מבנים גנטיים או אלמנטים רגולטוריים.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי יעילות מבוססי אחוזים (t-cells GFP+/total cells) המאפשרים השוואה סטטיסטית בין פרוטוקולי פולס.
- מחקר תרגומי: מקשרה לרציפות פרה-קלינית על ידי ייצור תאים טרנספקטיביים חיוניים המתאימים לתיקוף נוסף במודלים תלת-ממדיים או במערכות של תרבית משותפת (co-culture).
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת אלקטרופורציה ניתנת לשימוש חוזר, ישימה על פני מספר פרויקטים הדורשים העברת פלסמיד אל תוך שורות תאים דבקים או תאים בתליה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתוצאות החיזוי של העברת גנים על ידי העלאת יעילות הטרנספקציה באמצעות אופטימיזציה ביופיזית של פרמטרי הדופק.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה של הליכי העברה של גנים באמצעות רצפי דופקים מוגדרים ובקרה על כיוון השדה.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון הביולוגי בתיקוף מטרות על ידי הבטחת ביטוי מספיק של הגן המועבר להערכה פנוטיפית, ובכך ממזער תוצאות שגויות שליליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות של מטרות גנטיות מותאם סיכון, בהתבסס על רמות הביטוי הניתנות להשגה במערכי בדיקה תאיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי יונקים, הכנת פלסמידים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית להערכת יעילות הטרנספקציה.
- תלוי בגישה למחוללי פולסים במתח גבוה המסוגלים לשינויים תכנוניים של כיוון השדה החשמלי ובחודים תואמים בעלי אלקטרודות מובנות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרמטרי הפולס (מתח, משך זמן, מספר פולסים) וצפיפות התאים בין ניסויים שונים כדי להבטיח השוואתיות.
- כולל אופטימיזציה של היחס בין ה-DNA לתאים ושל זמני האינקובציה כדי לאזן בין יעילות הטרנספקציה לבין העקה תאית.
- מוגבל לקווי תאים דבקים או תאים בתליה התואמים לאלקטרופורציה; תאים ראשוניים או רגישים עשויים לדרוש שיטות הובלה חלופיות.
