הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice
6 בדצמבר 2011
בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין דגימות פרוסות רקמה חיות של האיבר האפי של העכבר (RO nasal organ) או של האיבר הוולסומטרי הנחיר (VNO), במטרה לבצע ניסויי דימות סידן (calcium imaging) על תתי-אוכלוסיות של נוירונים או על נוירונים בודדים ברקמה חיה. הדבר מושג תחילה על ידי הוצאת ה-VNO מאפו של העכבר, ולאחר מכן ביצוע מיקרו-דיסקציה של האיבר מקפסולת הסחוס שלו תחת מיקרוסקופ דיסקציה בתוך A CSF קר. לאחר מכן, ה-VNO המבודד ממוקם בצורה אנכית בבלוק אגר, ופרוסות רקמה קורונליות חיות נחתכות באמצעות מיקרוטום כדי לוודא את שלמות הרקמה.
מספר פרוסות נבחנו לאחר צביעה אימונוהיסטוכימית תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי. פרוסות אחרות נטענו בצבע רגיש לסידן ולאחר מכן בוצע להן בישור עם ליגנדים פרומונליים משוערים, כאשר האקטיבציה העצבית נצפתה באמצעות דימוי סידן. שיטה זו יכולה לסייע בפתרון סוגיות מרכזיות בתחום הריח.
לדוגמה, מאות קולטני פרומונים מבוטאים באיבר האף של ה-romo, אך למעט מאוד מהם זוהו ליגנדים. קולטני פרומונים קשים מאוד לביטוי במערכת הטרולוגית. נזדקקנו לפיתוח בדיקת in vivo יעילה כדי לשייך פרומונים ספציפיים לקולטנים ספציפיים.
ניתן להשתמש בעכברים טרנסגניים שבהם תת-אוכלוסייה ספציפית של נוירונים מבטאת רצפטורים לא ידועים וניתן לזהותה באמצעות ביטוי של GFP. נוכל להשתמש במערך זה גם כדי לחקור באופן פרמקולוגי תעלות יונים ואנזימים המעורבים בשרשרת העברת האותים של Fairmont תוך הדגמת הפרוצדורה. היום יצטרפו אלינו ג'וליאן ופאביאן, שני חוקרים מהמעבדה שלי, לפני תחילת הניתוח.
הכינו נוזל חוט שדרה (CSF) מלאכותי, טרי וקר, הרווי עם oxy carb, על ידי ערבוב כל הרכיבים למעט סידן כלוריד. הרוו את התמיסה על ידי הבעבעה ישירה של oxy carb לתוכה. לאחר מכן, הוסיפו את הסידן כלוריד והביאו לנפח הרצוי באמצעות מים מזוקקים פעמיים.
יש לשמור את תמיסת ה-A CSF על קרח עד לשימוש. לאחר הרדמה עם קטילת העכבר הבוגר ועריפת ראשו, יש להכין צלחת פטרי עם A CSF קר, המאוורר באופן רציף בחמצן ופחמן דו-חמצני. לאחר הסרת הלסת התחתונה, יש להניח את ראש העכבר בצלחת הפטרי.
מקם את ראש העכבר תחת מיקרוסקופ הדיסקציה כדי שניתן יהיה לדייק ולהראות את החיך. לאחר מכן, בצע חתך אופקי בחלק העליון של החיך באמצעות מספרי מיקרו, ולאחר מכן הסר את קרומי החיך בעזרת פינצטת מיקרו-דיסקציה. הרטב ונקה את החלל החשוף בעזרת A CSF.
גזרו את החלק העליון והתחתון של מחיצת האף. לאחר מכן, הוציאו בעדינות את מחיצת האף המכילה את ה-VNO והניחו אותה ישירות ב-A CSF במצב אנכי. הפרידו בין שני חלקי ה-VNO באמצעות פינצטת מיקרו-דיסקציה.
זהו את הקפסולה הסחוסית של ה-VNO ואז הסירה אותה בעדינות, תוך כדי וידוא שכל חלקי הסחוס הוסרו. ה-VNO המבודד, חלקי הסחוס וה-VNO שלא ננסח מוצגים כאן תחילה; הכן agarose בריכוז 3% בעל נקודת התכה נמוכה, ולאחר מכן ארגן את מרחב העבודה עם הכלים הדרושים. מלא את תבנית הטמיעה ב-agarose וודא שהטמפרטורה נמוכה מ-41 °C לפני טבילת ה-VNO המנוסח. מקם את הרקמה בצורה אנכית כדי לקבל חיתוכים קורונליים.
הנח את תבנית ההטמעה על קרח למשך דקה אחת עד להתגבשות האגר. לאחר דקה, הוצא את בלוק האגר, חתוך אותו לצורת פרמטאל, ולאחר מכן הדבק אותו לתמיכת המיקרוטום. בצע חיתוך של פרוסות VNO קורונליות במיקרוטום במהירות של 0.5 millimeters per second, באמפליטודה של 0.7 millimeters ובעובי של 100 micrometers בתוך CSF קר.
אספו את פרוסות הרקמה בעזרת מברשת והניחו אותן בצלחת תרבית רקמה מלאה ב-A CSF קר, וזאת על מנת לוודא את השלמות המבנית של פרוסות הרקמה שנאספו, אשר ניתן לקבע ולאחר מכן לצבוע באמצעות אימונוסטינינג עבור רכיבי השלד התאי או חלבונים אחרים רלוונטיים. כאן, אימונוסטינינג נגד acetylated tubulin בצבע סגול מדגים את השלמות המבנית של פרוסת הרקמה. יתרה מכך, תצפית על אוכלוסיית נוירונים ספציפית שבה קולטן פרומון מסוים סומן באמצעות GFP מראה את המורפולוגיה הנוירונלית השמורה; בעבודה בחדר חשוך ניתן להבחין בנוירונים עם גופי תא אובליים קטנים ודנדריטים ארוכים המגיעים לפני השטח של הלומן ומסתיימים במיקרווילוסים.
דגרו פרוסות VNO בתמיסת טעינה של A CSF קר עם 7 µM URA 2:00 AM ו-0.1%onic למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר שעה, שמרו את הפרוסות הטעונות על קרח בתנאי oxy carbonation עד לשימוש. השתמשו במכחול כדי להניח את הפרוסות הטעונות בתא פרפוזיה המכיל A CSF, והדקו אותן באמצעות מעגן לפרוסות רקמה.
הנח את תא הפרפוזיה על במה המיקרוסקופ של מערכת לדימות סידן ובצע פרפוזיה רציפה של A CSF מועשר בחמצן ובפחמן דו-חמצני בטמפרטורת החדר. צפה בחתכי ה-VNO הטעונים תוך שימוש באורכי גל פלואורסצנציה התואמים לצבע, שהם 340 עד 380 ננומטר עבור four O 2:00 AM. השתמש בתוכנה המתאימה כדי להקליט שינויים ביחס הסידן התו-תאי. מערכת פרפוזיה נחוצה כדי להשרות גרייה כימית.
כאן מוצג פרוסה קורונלית של רקמת vno מעכבר, שבו תת-אוכלוסיית הנוירונים המבטאים את קולטן הפרומון V one RB two מבטאת גם GFP, לאחר צביעה אימונולוגית נגד חלבון טובולין מאצטיל (acetylated tubulin) המוצג בסגול. תצפיות בהגדלה גבוהה יותר של הפרוסה מדגימות את שימור שלמות הרקמה. ניתן לראות נוירונים עם דנדריטים ארוכים המגיעים לפני השטח של הלומן, וניתן לראות ביטוי של החלבון המבני בבליטות הדנדריטיות (dendritic knobs) ובמיקרווילאיי עבור דימות סידן.
פרוסות רקמה טעונות FU נסרקות תחילה באמצעות מיקרוסקופ הפוכי בניגוד מופע (Hoffman phase contrast) כדי לאתר את שדה העניין; החל מכלי הדם, החץ הלבן הראשון, הצופה מתקדם לאט לעבר הלומן, החץ הלבן השני, ואזור האפיתל העצבי. ניתן לזהות את גוף התא האובלי של נוירון האף ב-RO בעזרת החץ הלבן השלישי, המזוהה לפי הדנדריט הארוך והדק שלו.
החץ הלבן הרביעי המכוון אל הלומן, הפינוקל הדנדריטי העצבי. החץ הלבן החמישי מצביע על מיקרווילוסים במגע עם תאים טעונים בפרומונים RA המוצגים כאן ב-80 nanometers, אשר לאחר מכן מוארים באופן רצופי ב-40 nanometers וב-80 nanometers, ויחס אורך גל פלואורסצנטי זה תואם לשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בנוירונים שנבחרו, המסומנים בעיגולים שחורים, אדומים וכחולים. נעשה שימוש ב-TP כדי לקבוע את חיוניות הנוירונים.
שימו לב לטווח התגובות של הסידן המוצגות בשלושת הנוירונים הנבחרים, ולעובדה שנוירון מספר שתיים (במעגל האדום) אינו מגיב ל-TP ולכן יסור מהניתוחים הבאים. לאחר מכן, גירוי כימי מבוצע באמצעות שתן וגם תערובת של פרומונים של עכבר, תוך התבוננות בעומק פרוסת הרקמה. ניתן לאתר תת-אוכלוסייה של נוירונים המבטאים הן GFP והן את הרספטור V1RR2.
כאן מוצג נוירון המבטא הן GFP והן את הקולטן V1RB2, לצד נוירון שאינו מבטא V1RB2. שני התאים טעונים ב-URA-2-AM, והנוירון המבטא V1RB2 מראה ספייק של סידן בתגובה לביצוע פרפוזיה של הליגנד של הקולטן, 2-hep known. מעניין לציין כי גם הנוירון שאינו מבטא V1RB2 מגיב ל-2-hep known, דבר המדגים את המורכבות של קידוד הפרומונים ב-VNO.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן החילוץ והמיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לצורך הכנת פרוסות רקמה חדות (acute tissue slices). פרוטוקול זה ניתן להתאמה גם למחקר פיזיולוגי באמצעות צבעי סידן חלופיים ומערכי מיקרוסקופ שונים. בהצלחה בניסוי.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת פרוסות רקמה חיות של האיבר הוומרונזלי (VNO) בעכברים לצורך דימוי סידן. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לצפות בנוירונים בודדים ובתגובותיהם לליגנדים פרומונליים ברקמה חיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר ריח
- דימוי סידן
רקע
- האיבר הוומרונזלי (VNO) חיוני לזיהוי פרומונים בעכברים.
- דימות סידן הוא כלי רב עוצמה לחקר פעילות נוירונלית.
- זיהוי אינטראקציות בין קולטן לליגנד חיוני להבנת איתות פרומוני.
- קולטני פרומונים רבים נותרו ללא אפיון בשל קשיים במערכות ביטוי.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה אמינה להכנת פרוסות VNO לצורך דימוי סידן.
- בחינת התגובות של אוכלוסיות עצביות ספציפיות לליגנדים פרומונליים.
- סיוע בזיהוי זוגות רספטור-ליגנד באותות פרומונליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפקה ומיקרו-דיסקציה של ה-VNO מרקמת עכבר.
- הכנת חתכים קורונליים חדים באמצעות מיקרוטום.
- אימונוהיסטוכימיה לאימות שלמות הרקמה.
- דימוי סידן לצפייה בהפעלה נוירונלית בתגובה לליגנדים.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות VNO השומרות על השלמות המבנית.
- זיהוי של אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות המבטאות רצפטורים לפרומונים.
- הדגמה של טכניקות דימות סידן לניטור פעילות נוירונלית.
- פוטנציאל לפתרון סוגיות מרכזיות במחקרים על חוש הריח.
מסקנות
- השיטה המתוארת מספקת כלי בעל ערך לחקר אותות פרומונליים.
- דימות סידן של פרוסות VNO יכול לשפר את ההבנה של מנגנונים ריחוניים.
- גישה זו עשויה להוביל לזיהוי של קולטני פרומונים שאינם ידועים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על תגובות נוירונליות לליגנדים פרומונליים ברקמה חיה, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות (target validation) במחקרי ריח ונוירופרמקולוגיה. על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ואפשרות לדימות סידן ספציפי לליגנד, היא מספקת מערכת רלוונטית פיזיולוגית להפחתת סיכונים בהשערות לגבי מטרות בשלב מוקדם של הגילוי. גישה זו נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי בשיוך ליגנדים לרצפטורים יתומים, ובכך משפרת את הביטחון הניבוי במגמה של בחירת מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור רספטורים ספציפיים לפרומונים לסליגנדים שלהם ברקמה טבעית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על הפעלה עצבית בתגובה לסליגנדים משוערים.
- ערך ניבוי: מסייע בזיהוי מועמדים פוטנציאליים (leads) על ידי אישור אינטראקציות רספטור-סליגנד במערכת חושית רלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת פרוסות רקמה ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקה המשכית של תרכובות פרומונליות.
- פלט כמותי: מאפשר דימות סידן רציומטרי למדידת תגובות עצביות תלויות-מינון.
- שחזוריות: הכנה סטנדרטית של פרוסות תומכת בקבלת תוצאות עקביות בין ניסויים ומעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש ב-VNO של עכבר כמודל לחקר מסלולים כימו-סנסוריים הרלוונטיים להפרעות התנהגותיות ונוירולוגיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לפיזיולוגיה של רקמה שלמה, ובכך משפר את הערך החזוי לתוצאות in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר בירור פרמקולוגי של תעלות יונים ומסלולי איתות המעורבים בהעברה של פרומון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת בתיקוף המטרה לפני שלבי פיתוח הבדיקה ואופטימיזציה של המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של פעילות עצבית המושרית על ידי ליגנדים ברקמת VNO מקורית.
- סריקה: מייצרת תכשירי רקמה המתאימים לסריקת ספריות תרכובות כנגד נוירונים ספציפיים המבטאים רצפטורים לפרומונים.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של שטף סידן המאפשרות השוואה של עוצמת הליגנד ויעילותו בין תת-אוכלוסיות של נוירונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית, ובכך מסייעת בהסברה (extrapolation) למודלים התנהגותיים ופרה-קליניים.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת פלטפורמה רב-פעמית לחקר זוגות רצפטור-ליגנד מרובים במערכת הוומרונזלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי אישור אינטראקציות תפקודיות בין רצפטור לליגנד ברקמה חיה.
- ערך תפעולי: מספק הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור לדימוי סידן במערכי ליגנדים ובמודלים גנטיים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת אי-הוודאות במנגנון המטרה ובספציפיות של הליגנד.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם-סיכון עם מעורבות ליגנד מאומתת במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, חיתוך במיקרוטום ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה לקריוסטט, תא פרפוזיה ומערכת לדימות סידן עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרפוזיית ACSF ושל פרוטוקול טעינת הצבע בכלל המשתמשים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש התאמות בזווית ובבעובי החיתוך עקב הבדלים אנטומיים.
- מוגבל על ידי משך חיוניות הרקמה, דבר המחייב ביצוע ניסויים בזמן קצר לאחר הכנת הפרוסות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Dissection of the Mouse Vomeronasal Organ (VNO)
3:37
VNO Tissue Slice Preparation
4:37
Immunohistochemistry of VNO Floating Slices
5:19
Calcium Imaging of VNO Slices
6:23
Representative Immunostaining and Calcium Imaging of VNO Slice
9:00
Conclusion
