סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש במערך נוגדנים מסוג DOT scan כדי לאפיין מולקולרית אנטיגנים של פני השטח ברקמות של סרטן המעי הגס. בנוסף, נעשה שימוש במולטיפלקס פלואורסצנטי כדי להבחין בין סוגי תאים בעלי פרופילים ספציפיים בתוך האוכלוסייה המעורבת. אנטיגנים מסוג Cluster of differentiation או CD זוהו כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים או מטאסטטיים פוטנציאליים בסרטן המעי הגס.

אנטיגנים אלו מהווים סממנים ביולוגיים אידיאליים, שכן ביטויים משתנה לעיתים קרובות עם התקדמות הגידול או כתוצאה מאינטראקציה עם סוגי תאים אחרים. בסרטון זה, אנו משתמשים במערך נוגדנים מסוג DOT scan כדי ללכוד תאים חיים באמצעות האנטיגנים המבטאים על פני השטח. מערך הנוגדנים DOT scan מורכב מ 슬ייד זכוכית עם שכבת ניטרוצלולוז.

פאנל המיקרומערך של נוגדני DOT scan מוקף בנקודות יישור המורכבות מ-CD 29 ו-CD 44. מערכים כפולים מנוקדים גם בכל צד של המערך. הפאנל הראשון כולל את 82 הנוגדנים המקוריים של מיקרומערך ה-DOT scan ללוקמיה, ו-40 נוגדנים נוספים נבחרו על בסיס פוטנציאל פרוגנוסטי כמיקרומערך לוויין לסרטן המעי הגס.

והפאנל האחרון מורכב מנוגדני בקרה מסוג איזוטיפ. כאן, רקמת סרטן מעי גס ורירית מעי נורמלית עוברות עיכול וסינון כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים חיוניים. ניתן להקפיא את התרחיף או לאחסנו לשימוש מאוחר יותר.

תרחיף התאים משמש ללכידת תאים על גבי מערך מיקרו-נוגדנים של סריקת DOT; אנטיגנים המבוטאים בתתי-סוגים שונים של תאים מאופיינים באמצעות ריבוי פלואורסצנציה (fluorescence multiplexing). פרופילי הביטוי המתקבלים מראים שינוי משמעותי בביטוי האנטיגנים בין תאי סרטן המעי הגס לבין רירית מעי נורמלית. הבדל זה בא לידי ביטוי גם באוכלוסיית הלוקוציטים הקשורה לגידול.

הקבצה היררכית של מספר פרופילים של גידולים מראה מקבץ של חתימות מחלה התואמות לשלבים של סרטן המעי הגס. שלום, אני ג'רי מהבית לסciences ביו-מולקולריות באוניברסיטת סידני, אוסטרליה, והיום אציג בפניכם ניסוי לאפיון של אנטיגנים על פני השטח של רקמת סרטן המעי הגס. באמצעות מערך מיקרו-antibody מסוג dot scan ומולטיפלקס פלואורסצנטי, מאפשרים מערכי מיקרו dot scan אפיון של כ-140 אנטיגנים על פני השטח של תאי סרטן חיים יחד עם הלוקוציטים דלקתיים נלווים.

ניתן להבחין בין תת-אוכלוסיות של תאים שנלכדו על גבי מיקרו-מערכים (microarrays) באמצעות נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית, הנקשרים לאנטיגן מסמן המבוטא ברמה גבוהה בתאי העניין. ניתן לאפיין עד שלוש תת-אוכלוסיות שונות של תאים על גבי מיקרו-מערך בודד, תוך שימוש בסממנים פלואורסצנטיים מתאימים על נוגדנים בעלי שלוש ספציפיות שונות. בדיקת ה-DOT scan microarray היא שיטה פשוטה יחסית, וכבר נעשה בה שימוש לאפיון פני השטח של תאים במספר סוגי סרטנים.

מאפיין מרכזי של סריקת DOT הוא יכולתה ללכוד תאים חיים באמצעות האנטיגנים שעל פני השטח שלהם, כך שתבנית הקישור המתקבלת משקפת את פרופיל פני השטח של התא. לאנטיגנים על פני השטח תפקיד חשוב בהתפתחות גידולים ובגרורות, וכן בתגובה הדלקתית למלחמה בסרטן. ניתן להשתמש בפרופילי פני שטח נרחבים או באימונופנוטיפים כחתימות של מחלה כדי לשפר את סיווג הסרטן, ובכך לאפשר טיפול אופטימלי לאחר ניתוח.

בסדר, בואו נתחיל. בניסוי המוצג כאן, דגימות של גידולי סרטן רקטי-מעי גס קליניים, בדרגות A עד D, נאספות בבופר הנקס (Hank's buffer). כדי להתחיל, יש לחתוך בזהירות את הגידול לפרוסות בעובי של 1 mm באמצעות שני סקלפלים.

הנח את הפרוסות בתמיסת collagenase type four בריכוז 2% ותמיסת DNA בריכוז 10% לצורך עיכול. נלקחים מקטעים של רירית מעי תקינה מאותו המטופל, במרחק של 10 סנטימטרים מאתר הגידול הראשוני. מקטעים אלו משמשים כביקורת ומעובדים באופן זהה לדגימת הגידול.

עיכול הגידול מתבצע בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת כדי לעודד את פירוק הרקמה החיבורית, כאשר ה-D ns ינקו DNA מתאים פגומים. לאחר הדגירה, תרחיף הרקמה מועבר דרך רשת סיבים תוך שטיפת הדגימה בבופר Hanks, בעוד שבוחן של מזרק 10 ml משמש לסיוע בדחיפת התאים דרך הרשת. תהליך זה חוזר על עצמו מספר פעמים עד שרוב התאים עוברים דרך רשת הסיבים.

הרשת מפרידה בין התאים לבין רקמת חיבור שלא עוכלה. לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים פעם נוספת על ידי שאיבתו למזרק של 10 mL וסינונו דרך מסנן fcon של 200 µm ולאחר מכן דרך מסנן fil con של 50 µm. מסננים עדינים אלו אמורים להבטיח את הסרת עודפי ריר או DNA, וכן את פירוק מקבצי תאים כדי לקבל תרחיף תאים בודדים חיוניים.

אותו טיפול מבוצע גם עבור הרירית הנורמלית. מצאנו כי הרירית הנורמלית נוטה להכיל יותר רקמת חיבור, וכתוצאה מכך, נדרשים מספר שטיפות נוספות כדי להעביר אותה לצנטריפוגת רשת להשגת תרחיף תאים ב-410 G ב-20 degrees Celsius למשך חמש דקות. כהכנה לאחסון בקירור, נשעה את משקע התאים ב-750 microliters של סרום עגל עוברי, ולאחר מכן בנפחים שווים של סרום עגל עוברי עם DMS.

הוסף תמיסה ב-DMS זה. טפטף את התמיסה תוך ערבוב קבוע, העבר מנה (aliquot) מהעלה (supernatant) לשפופרת קריו והנח אותה במיכל מבודד. ניתן לאחסן דגימות אלו ב-minus 80 למשך עד שנה אחת.

הבידוד וה-DMSO אמורים להבטיח שהתאים ישתחררו לאט ללא התפוצצות. תופעת לוואי של האחסון היא ליזיס של אוכלוסיית תאי הדם האדומים. למזלנו, אין בהם צורך.

עבור הניסוי, הוצא את הדגימות מהאחסון והפסק את ההקפאה במהירות. בבניס רחצה של 37 °C, השהה מחדש את תרחיף התאים ב-10 mL של Hank's buffer; התמימות אמורה לסייע בדילול ה-10% DMSO וסרום עגל עוברים (fetal calf serum). סנטריפוג את התאים למשך חמש דקות ב-410 ×g בטמפרטורה של 20 °C.

בשלב הבא, העבירו את העלה (supernatant) ותלו אותו מחדש ב-500 µL של בופר הנק (Hank's buffer); ייתכן שחלק מהתאים ייהרסו במהלך תהליך ההקפאה וההפשרה, מה שיגרום לשחרור DNA אל הסספנזיה. כדי לטפל בבעיה זו, דגרו את הדגימה עם 0.1% DNase בטמפרטורת החדר. בזמן זה, ניתן לבצע ספירת חיות תאים.

ערבבו כמויות שוות של triam blue עם 10 µL של תרחיף תאים, והעבירו באמצעות פיפט 10 µL מהתערובת לסופר תאים. תחת המיקרוסקופ, תאים בריאים וחיוניים יופיעו שקופים. לעומת זאת, תאים שאינם חיוניים, שקרומי התאים שלהם נפגעו, יופיעו בצבע כחול.

דרושים לפחות 4 מיליון תאים חיוניים עבור לכידת תאים על נוגדן ה-DOT scan. MICRORAY falling. טיפול ב-DNA שטח את התאים פעם שנייה עם 10 mils של בופר הנקס (Hank's buffer) וסנטריפוגה ב-410 G למשך חמש דקות ובטמפרטורה של 20 degrees Celsius.

אנו תולה את משקע התאים הסופי ב-200 µL של מצע RPMI. מצע זה מכיל רכיבים תזונתיים רבים יותר מאשר בבופר Hanks, והוא משמש כדי להקל על לכידת התאים על גבי מערך המיקרו-מערך של הנוגדנים תוך שמירה על חיות התאים. מערך המיקרו-מערך של הנוגדנים לסריקת נקודות של סרטן המעי הגס מורכב מ-140 נקודות נוגדנים שונות המופיעות בכפילות על גבי הניטרוסלולוז.

כל נקודה במערך מכילה 10 nanoliters של נוגדן מונוקלונלי נגד האנטיגן שעל פני השטח של התא. כדי להכין את מערך הנוגדנים, טבול אותו בתבנית עם PBS כדי להרטיב את הניטרוצלולוז ונגב את קצה הזכוכית של המערך בעזרת Kim wipes, תוך הקפדה לא לגעת בחלק הניטרוצלולוז. הנח את מערך הנוגדנים בתבנית וטפטף באמצעות פיפט את תרחיף התאים על הניטרוצלולוז.

פיזור אחיד של תרחיף התאים יבטיח שלכל הנוגדנים יהיה פוטנציאל ללכידת תאים. דגרו את המיקרו-מערך (microarray) ב-37 °C למשך שעה אחת. במהלך הדגירה, תאים שונים יסחפו למטה ויבואו במגע עם הנוגדנים שעל תאי המערך.

אנטיגנים של פני השטח המוצגים, התואמים לנוגדן שלהם, יקשרו וילכדו את התא לאחר דגירה. שטפו את התאים שלא נקשרו על ידי טבילה עדינה של המערכים בשלושה סבבים של PPS טרי. קבעו את התאים שנקשרו בפתרון PPS בריכוז 10%.

העבר בטפטוף עדין כמות נדיבה של מקבע כדי לכסות את אזור הטעינה של תא הניטרוסלולוז. דגרו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, טבלו את המערכים המיקרוסקופיים של שלוש פעמים ב-PBS טרי.

השאירו את המערכים ב-PBS להשריה למשך 30 שניות בכל שטיפה, שכן עודף של גובה הפולימר עלול להפריע למולטיפלקס פלואורסצנטי. כעת ניתן לבדוק אם התרחשה קישוריות של תאים על ידי החזקת מיקרומערך תחת מקור אור, לצורך ניתוח מדויק הרבה יותר. הסורק DOT scan ותוכנת הניתוח מאפשרים לסרוק את דפוס הקישור ולהפיק תוצאות כמותיות של ביטוי אנטיגנים באוכלוסיית תאים מעורבת.

התוכנה משווה את עוצמת קישור התאים לעומת רעש הרקע בסולם אפור של שמונה ביטים. יחידות העוצמה מנורמלות לערך מקסימלי של 256. לצורך הקלה בהשוואה בין מערכים, כל קישור חיובי של בקרת איזוטיפ מנוכה מהנוגדנים בעלי איזוטיפי ה-IG התואמים.

הוסף 200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) למערך המיקרו (microarray) והדגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כהכנה לריבוי פלואורסצנטי (fluorescence multiplexing), הוסף 10 µL של CD3 מצומד ל-Fiery ו-20 µL של EPCAM מצומד ל-Alexa לתוך 118 µL של תמיסת חסימה. בנוסף, הוסף לתערובת 2 µL של סרום מנוטרל בחום (heat inactivated serum) כדי למנוע קישור לא ספציפי.

עם סיום החסימה, מחליפים את תמיסת החסימה בתמיסת multiplexing ומדגירים בחושך למשך 30 דקות. במהלך הדגירה בטמפרטורת החדר, נוגדנים מצומדים ל-CD3 ייקשרו לתאי T המבטאים CD3 הקשורים למערך, בעוד שנוגדן מצומד ל-EPAM ייקשר לתאים אפיתליאליים או לתאי סרטן של המעי הגס על המערך. לאחר מכן, שוטפים את המיקרו-מערך שלוש פעמים ב-PBS טרי ומניחים להם להתייבש בחושך לפני הסריקה לפלואורסצנציה.

פלואורסצנציה מזוהה באמצעות סורק typhoon FLA 9,000 cd. פרופיל FICO ery נסרק באמצעות לייזר של 5 2 3 nanometer ומסנן פליטה 5 8 0 BP 30 EP. camm Alexa 6 4 7 נסרק באמצעות לייזר של 6 3 3 nanometer ומסנן פליטה 6 7 0 BP 30. התמונות הפלואורסצנטיות המתקבלות מומרות לפורמט tip לצורך ניתוח.

באמצעות תוכנת סריקת DOT. ריבוי פלואורסצנטי (Fluorescent multiplexing) מאפשר לנו להבחין בפרופילים של אנטיגנים באוכלוסיות תאים שונות בתוך אותה דגימת רקמה. התמונות המוצגות כאן הן מדגימה של סרטן מעי גס.

שלוש תמונות אלו הן של סריקה אופטית, סריקה פלואורסצנטית לתאים המבטאים CD3 וסריקה פלואורסצנטית לתאים המבטאים EPAM. תוצאות מסריקת ה-DOT scan microray צריכות להראות דפוסי קישור תאים עקביים בין שתי השקופיות הכפולות. קישור נקודות אינטנסיבי לאורך קצה השקופית מעיד על כך שנלכדה כמות מספקת של תאים.

ניתן להפיק דוח PDF כדי לקבל ערכים כמותיים של קישור לתאים. גרף העמודות המייצג את הקישור לתאים מראה הבדל בביטוי האנטיגן בין רירית נורמלית לבין דגימת הגידול.

בעוד שהתוצאות האופטיות סיפקו ייצוג כללי של ביטוי האנטיגן בכל סוגי התאים בתוך הדגימה, תוצאות הריבוי (multiplexing) של ה-AAM מראות תמונה ברורה יותר של ההבדל בביטוי האנטיגן בין תאי אפיתל נורמליים לתאי סרטן. אף על פי שרבים מהאנטיגנים המבטאים באופן דיפרנציאלי ידועים כקבוצת ביומרקרים לסרטן המעי הגס, הם מספקים חתימה מחלתית מדויקת הרבה יותר לצורך סטרטיפיקציה מכפי שכל ביומרקר בודד יכול להשיג. תוצאות הריבוי של CD3 מראות מספר רב יותר של תאי T בדגימת הסרטן בהשוואה לדגימה הנורמלית.

לעתים תאי T מסרטן מבטאים סמני הפעלה, מה שמעלה את האפשרות שתאי T אלו הם לימפוציטים חודרי גידול (tumor infiltrating lymphocytes) או תאי T הקשורים לדלקת. ניתן לבצע ניתוח רחב היקף באמצעות multi experiment viewer גרסה 4.4, תוכנת קוד פתוח לניתוח נתונים ומפות חום (heat maps). ניתן להשתמש באשכולה היררכית (Hierarchial clustering) של דגימות מסרטן המעי הגס והפישס כדי לבצע קורלציה עם שלב המחלה או עם פרוגנוזת המטופל.

ספריית חתימות מחלה מקיפה היא כלי בעל ערך לניבוי הפרוגנוזה בחולי סרטן המעי הגס או לקביעת מהלך הטיפול הפוסט-אופרטיבי. הצגנו כעת את הפרוצדורה לאפיון ביטוי של אנטיגנים על פני השטח באוכלוסיית תאים מעורבת מרקמת סרטן המעי הגס, תוך שימוש במערך נוגדנים של DOT scan ובפלואורסצנציה מולטיפלקס. היבט חשוב אחד של ניסוי זה שיש לזכור הוא שיש להשתמש תמיד ברקמה טרייה, ולפחות 4 million תאים חיוניים נדרשים כדי שהניסוי יצליח. תודה שצפיתם בסרטון זה ובהצלחה בניסוייכם.