Name: פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למד מיפוי פעילויות ריח בעכברים באמצעות אותות אופטיים פנימיים ופלורופרוטין אוטופלורסצנטיות. שיטות הדמיה ברזולוציה גבוהה מאפשרות חקר מנגנוני עיבוד ריח במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי &quot;סוכנות הידיעות הלאומית de la משוכלל ונדיר&quot; מענק ANR-09-JCJC-0117-01 ו &quot;Neuropôle דה משוכלל ונדיר Francilien-נרף&quot; מענק רומן Chery. אנו מודים לפבר פרנסואז לפיתוח תוכנה ב + + C / Qt ו לורן פינו ובטיסט Janvier לעזרה בפיתוח ההתקנה הדמיה אופטית.

1. הכנת בעלי חיים הדמיה (בהתאם להמלצות האירופי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, הוראה 86/609/EEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 עד 8 שבועות הישן C57BL6 עכברים זכרים מורדמים עם קוקטייל של קטמין (10mg/kg) ו xylazine (100mg/kg) מוזרק intraperitonealy. הניתוח מתחיל כאשר העכבר אינו מגיב hindpaw קמצוץ. במהלך הניסוי כולו החיה מושם על כרית חימום. טמפרטורת הגוף מנוטר באופן רציף ומתוחזק על 37 ° C. עומק ההרדמה נשמר לאורך כל הניתוח על ידי הפעלת הדמיה לבדוק את העדרו של איבר לסגת. הזרקה תת עורית של 20% קוקטייל ההרדמה הראשוני הוא מנוהל אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קוצץ, להסיר את השיער מן הקרקפת. נקו את העור חשוף משיער שיורית באמצעות גזה סטרילית ספוגה מלוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic. חוטם צריך להיות במישור זהה האחורי של הראש,על מנת להגדיר את פני השטח של הנורה חוש הריח כדי האופקי. מאובטח היטב את האוזן וברים האף על מנת למנוע תנועות במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה עיניים על העיניים של בעלי חיים כדי למנוע התייבשות וכאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70 מעלות ובאזור הקרקפת עם מטאטא רצופים של בבטאדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את העור המכסה את הגולגולת, להתחיל על ידי ביצוע חתך בעור במספריים בחלק האחורי של הראש בין האוזניים. ואז לחתוך לכיוון הבסיס של האוזן לכיוון anteroposterior לכיוון המצח לאורך העפעפיים של שני הצדדים. סיום להסיר את הקרקפת על ידי חיתוך העור על גבי חוטם קרוב לבר האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תצפית המשקפת, השתמש במקלון צמר גפן ספוג מלוחים בעדינות כדי לנתק את periosteum על החלק העליון של הגולגולת. השתמש זוג מלקחיים כדי להסיר את הרקמות שנותרו לגרד את פני השטח של הגולגולת עם אזמל יש הכנה נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">OB הוא מבנה סימטרי מורכב משני hemibulbs אשר ממוקמים בין העפעפיים. הם מוגבלים מקורי ו לכיוון הזנב על ידי סינוס ורידי, ו מופרדים על ידי תפר sagittal. מניחים חתיכת ספוג הג'לטין נספגים ספוגה במים מזוקקים על העצם מעל OB. חשוב לשמור על לחות באזור העצם לאורך כל הניסוי. </li></ol> 2. הכנת חלון גולגולתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ספוג הג'לטין ולהתחיל ידי מגרדים בעדינות את העצם עם להב n 10 ° אזמל. שמור על זווית קבועה של 45 מעלות בין להב לבין העצם, ולהעביר את הלהב מן העפעפיים לצד sagittal האזור הנורה. אין להפעיל לחץ אנכי על העצם או לשרוט את העצם מעל הסינוס ורידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך דילול, להפסיק כל 5min והמקום ספוג הג'לטין hydrated על העצם להתקרר ההכנה. ספוגית את הגולגולת עם הספוג כדי להסיר אבק העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור גורפתקירור לחילופין עד לדמיין את trabeculae, שכבת עצם ספוגית. Vasculature קנס של OB חייב להיות גלוי בשלב זה. עצור מגרד את העצם, ולהתחיל להשתמש בקצה של אזמל בניצב "למשוך" מלבן התוחם את OB. בשלב זה n ° 11 להב אזמל ניתן להשתמש. שמור את הניתוח בתוך גבולות של הסינוסים ורידי שאמור להיות בטוח לשבץ כל אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dig בהדרגה התעלה מלבני נוצר באמצעות תנועות רצופות של אזמל. נגבו את קצה את האזמל מעת לעת לנקות אותו ולשמור אותו חדה. היה זהיר במיוחד של עומק קצה אל תיגע במשטח הדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל תחושה של עובי של העצם הנותרים, לדחוף אותו בעדינות עם קצה של זוג מלקחיים. אם קפלי דש העצם תחת לחץ, לעבור לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת טיפת מלח, השתמש קצה של אזמל אוריינטציה אופקית להרים את דש העצם. הסרת דש חייב להיעשות גarefully להימנע לקרוע את העצמות הנותרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פני השטח של OB חשוף, לבדוק בהעדר דימום או כלי דם השקה. פציעה של דורה או את פני השטח רקמות תפחית את הסיכוי לקבל אותות אופטיים. נגב את האזור עם ספוג טבול ג'לטין מלח כדי לשמור על לחות הנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מלט שיניים polyacrylate להקים גם על העצם סביב החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של נקודת התכה נמוכה agarose (1.2%) על הדורה, ולשים כוס כיסוי סטרילי בכל הממדים של החלון. במהלך הפגישה הדמיה, כמות קטנה של agarose ניתן להוסיף על מנת לפצות את התייבשות. Agarose תמנע OB לנוע עם הנשימה תספק משטח שטוח עבור הדמיה אופטית. </li></ol> 3. דימות אופטי ההתקנה למיפוי פעילות חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי חוש הריח יש להגדיר במדויק על ידי שימוש olfactometer זמן ועוצמת. אנו משתמשים בגרסה מותאמת אישית של מערכת multivial זלוף Valvebank 8II מ אוטומציה מדעיים הקשורים בסיסי מדחס אוויר (אוויר דחוס לנשימה יהיה מתאים גם כן). מערכת זו מאפשרת שליטה מדויקת ומהירה שסתום חיצוני. פתרונות של odorant טהור הם בדילול מלא שמן מינרלי בריכוז שנבחר. כדי להפעיל את אלדהידים OB הגבי כגון hexanal משמשים בדרך כלל. נפח המדויק של odorant מדולל (20 עד 50μl) נטען על נייר מסנן והושמו מאגר מזרק. באמצעות מערכת זלוף, לחץ אוויר מבוקר מועבר למערכת, על מנת להבטיח שיעור קבוע של אספקת אוויר השטף odorized לאף חיה במהלך פתיחת שסתום. Odorant מועבר באמצעות צינורות Tygon R-3603 שואב אבק (Saint-Gobain Corporation) נושאת האוויר בקצב הזרימה של ~ 1000ml/min. הימנע זיהום בין odorants וכמויות שיורית של odorant בצינור. אם זמין, שחזור של הגירוי odorant ניתן controlled באמצעות גלאי יינון להבה (microFID Photovac 2020). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה אופטיות מופעלת. זה מורכב מקורר interlaced 12 ביטים מצלמת CCD (ORCA AG Hamamatsu) הקשורים stereomicroscope פלואורסצנטי (לייקה MZ16), olfactometer המחשב נשלט ומנורות עירור התייצב עם מסננים התערבות מתאימה bandpass. תכנית המתאר ההתקנה שלנו ניתנת באיור 2. עבור אותות אופטי פנימי דימות (IOSI), טונגסטן הלוגן 200W מנורה (אוריאל QTH) בשילוב עם אור טבעת סיבים (שוט) פקוק סביב המטרה מיקרוסקופ משמשים כדי לספק תאורה יציבה אפילו. עבור Flavoprotein autofluorescence איתותי דימות (FASI), מנורת מתכת 150W Halide (לייקה) עם מדריך הליבה 5mm אור נוזל לספק אפילו עירור מקומי של הקרינה דרך נמל עלית תאורה של stereomicroscope. רכישת תמונה וסינכרון חומרה ממומשות על ידי תוכנה מותאמת אישית. ים פתוחource תוכנה Micromanager יכול לשמש גם כדי לשלוט על הרכישה התקנה אופטיות. </li></ol> 4. הדמיה אופטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסגרת stereotaxic תחת stereomicroscope, חלון גולגולתי מרוכז בתחום של תצוגה (ראה איור. 2A עבור סכמטית של ההתקנה אופטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המיקרוסקופ להתמקד הנימים. לפני ניסויים גירוי (ראו תיאור 5) תמונה של הנורה הוא נלקח תחת אור (ירוק) 560nm (טבעת סיבים) אשר מספק ניגודיות טובה עבור דימות כלי הדם. תמונה זו משמשת כפקד אנטומיים כדי לבדוק את מצב הכנת והוא רכש מספר פעמים במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור IOS הדמיה, עוצמת האור משתקף שתועדו על ידי מצלמת CCD תחת 630 + / -10 ננומטר (אדום) תאורה. תמונות נרכשים על מסגרת מלאה (ללא binning) בשעה 5 פריימים לשניה אשר תואמות את זמן החשיפה של כ 150ms. כוח של מקור האור מותאם מחדש אח אפור רמות לפחות ~ 3000 על שטח OB, קרוב הרוויה של פיקסלים CCD בארות. פעולה זו מאפשרת לנצל את הדינמיקה 12bits של ה-CCD כדי ללכוד שינויים בעוצמת להתעלף במהלך ההפעלה. מקסימום IOS אמפליטודות להגיע ~ 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור FAS דימות פלואורסצנטי נרכש תחת עירור של 480nm + /-20nm (כחול) אור epiflurorescence. סינון גבוהה לעבור על 515nm מוגדר ללכוד אור. תמונות נרכשות ב 5 פריימים לשניה עם binning של 4 על 4 על מנת למקסם את הרגישות. נורית ההפעלה עירור מותאם באופן דומה IOS עם רמות האפור של 3000 על שטח OB. מקסימום FAS אמפליטודות להגיע ~ 3%. במשך שתי שיטות הדמיה, עומק השדה במישור נושא זהה והיה נמדד 0.5 מ"מ עבור הגדלה של כ 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור יש לכבות בין ניסויים הדמיה כדי למנוע חימום photobleaching של התכשיר. </li></ol>le "&gt; 5. הניסויים הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מושב הדמיה כלל הבסיס של 5 עד 10s שהאוויר רק מועבר, ואחריו גירוי הריח במשך 3 עד 10s תלוי ריכוז הריח הנבחר, 70 עד 82s נרשמות נוסף עם זרימת אוויר מתמדת התאוששות הבסיס (איור 2A). בסוף המשפט, אור כבוי אוויר טהור מועבר על משך הניסוי בין מרווח (1 עד 3 דקות) כדי לשטוף את מולקולות הריח שיורית ולהימנע הרגלה חושית. ניסויים ריח היו משולבים עם משפטים ריקים (אספקת אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריח עורר אזורי הופעל הם דמיינו כאזורים כדורית בקירוב על המפות ועל מתאימות לגודל של glomeruli בודדים (80 עד 200μm בקוטר 9). עיבוד תמונה הוא הסביר 2B איור. מפות חוש הריח מוצגים באיור 3. בניגוד לכל מערכת חושיות אחרות, יחס אות לרעש ב OB היה מספיק כדי לפתור ריח עורר תגובות בניסויים יחיד (איור. 3B עבור IOS ו איור. 3D עבור FAS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מומתים מיד בתום הפגישה הדמיה בשיטות בהתאם להמלצות האירופי לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. </li></ol> 6. נציג תוצאות (ראה מפות הריח באיור 3): <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 ארגון מבנית של הנורה הריח העיקרי מכרסמים. עצב סנסורי חוש הריח, תאים חושית העיקרי נמצא אפיתל ההרחה הראשי, לבטא את קולטן odorant אותו להתכנס על glomeruli באותו OB. Glomeruli חוש הריח, את עגולי neuropils (מעגלים מקווקווים), הממוקמים על פני השטח של OB. שים לב כי רשת כלי דם סמיך מאוד ומורכב נמצא ברמה גלומרולרי. קיצורים (למעלה / למטה): ONL: שכבת עצב ההרחה, GL: שכבת גלומרולרי, EPL: שכבה חיצונית plexiform; MCL:שכבת תאים צניפי; GCL: שכבת גרעין התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 ההחזרה אותות הקרינה ההקלטה in vivo. א רחב בתחום הדמיה אופטית ההתקנה. המוח של העכבר הרדים חשוף או אדום (IOS) או כחול (FAS) אור דרך טבעת או סיב טבעתי המצורפת העדשה אופטיקה או יציאת עלית תאורה של מיקרוסקופ. ריחות נטענים לתוך צלוחיות אטום odorized האוויר מועבר לאף חיה (אור ירוק: שסתום פתוח). ב הקלטת פרוטוקול ועיבוד נתונים. IOS ו FAS נרשמות סדרה של ניסויים בודדים (שנות ה -90 של משך הזמן). התרשים מראה את ציר הזמן של משפט אחד: הבסיס נע בין 5 ל 10s, גירוי בין 3 ל 10s, ולחזור בסיסית בין 70 ל 82s. עיבוד תמונה מחייב פיקסל אחר פיקסל חיסור של ערכים אינטנסיביות במהלך הבסיס לערכים בעוצמה בתקופות של גירוי (עבור FAS) or גירוי בתוספת לחזור בסיסית (עבור IOS). הפרש זה מחולק מכן על ידי ערכי הבסיס לקבל וריאציה% (ראה תמונות וכתוצאה מכך איור. 3). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3336/3336fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3 ריח עורר מפות הפעילות OB באמצעות IOS ו FAS הדמיה. א vasculature של OB הגב דמיינו תחת אור ירוק. לפני הספירה. IOS הדמיה (משפט בודד לעומת שלושה ניסויים בממוצע בהתאמה) עבור המצגת 10s של hexanal 20%. חיצים לבנים מצביעים על אזורים כדורי עניין זה מופעל על ידי ריח. מפות אלו הושגו באמצעות הפעלת המסגרות בממוצע במהלך בשנייה הראשונה לאחר סיום גירוי ריח (לכל היותר% וריאציה ההחזרה ב -0.63% ו -0.52 ב '). הערה אזורי השחור של ספיגת שם ההפעלה ריח התרחשה. תקליטור. FAS רכשה ברצף בעכבר זהה odorant זהה (משפט בודד לעומת שלושה ניסויים בממוצע בהתאמהly). מפות אלו הושגו באמצעות הפעלת המסגרות בממוצע במהלך בשנייה הראשונה לאחר תחילת גירוי ריח (מקסימום של 0.72% הקרינה וריאציה ב D ו 0.66% ב-E). שימו לב לבן של אזורי פליטת autofluorescence מסומנים על ידי חצים שחורים תואמים את אזורי שחור IOS. ההיבט מגורען לראות במפה FAS נובע 4 על ידי binning 4 נדרש לשיפור הרגישות. תמונות FAS לא תוקנו מ autofluorescence הלבנה. מידות בפועל של תמונות להיות: 0.7 רחב מ"מ x 1.2 מ"מ אורך.

<ol><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Rubin, B. D., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odorant+representations+in+the+mammalian+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odorant representations in the mammalian olfactory bulb.</a> Neuron. 23, 499-511 (1999).</li>
<li>Chance, B., Cohen, P., J&246, bsis, &amp, F., Schoener, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+oxidation-reduction+states+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intracellular oxidation-reduction states in vivo.</a> Science. 137, 499-508 (1962).</li>
<li>Shibuki, K., Hishida, R., Murakami, H., Kudoh, M., Kawaguchi, T., Watanabe, M., Watanabe, S., Kouuchi, T., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+somatosensory+cortical+activity+in+the+rat+visualized+by+flavoprotein+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+549+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of somatosensory cortical activity in the rat visualized by flavoprotein autofluorescence.</a> J. Physiol. 549 (Pt. 3, 919-9127 (2003).</li>
<li>Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+maps+in+the+mammalian+olfactory+bulb%3A+domain+organization+and+odorant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features.</a> Nat. Neurosci. 3, 1035-1043 (2000).</li>
<li>Gurden, H., Uchida, N., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+intrinsic+optical+signals+in+the+olfactory+bulb+are+coupled+to+glutamate+release+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked intrinsic optical signals in the olfactory bulb are coupled to glutamate release and uptake.</a> Neuron. 52, 335-345 (2006).</li>
<li>Soucy, E. R., Albeanu, D. F., Fantana, A. L., Murthy, V. N., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+diversity+in+an+odor+map+on+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Precision and diversity in an odor map on the olfactory bulb.</a> Nat. Neurosci. 12, 210-220 (2009).</li>
<li>Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+functional+architecture+and+local+coupling+between+neuronal+activity+and+the+microcirculation+revealed+by+in+vivo+high-resolution+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 6082-6086 (1990).</li>
<li>Meister, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+and+topography+in+an+odor+map+on+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning and topography in an odor map on the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 21, 1351-1360 (2001).</li>
<li>Dunn, A. K., Devor, A., Bolay, H., Andermann, M. L., Moskowitz, M. A., Dale, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+total+cerebral+hemoglobin+concentration%2C+oxygenation%2C+and+blood+flow+during+functional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of total cerebral hemoglobin concentration, oxygenation, and blood flow during functional activation.</a> Opt. Lett. 28, 28-30 (2003).</li>
<li>L'Heureux, B., Gurden, H., Pain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+imaging+of+NADH+and+flavoproteins+in+the+rat+brain%3A+insights+from+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Optics.+Express%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence imaging of NADH and flavoproteins in the rat brain: insights from Monte Carlo simulations.</a> Optics. Express. 17, 9477-9490 (2009).</li>
<li>Renaud, R., Gurden, H., Chery, R., Bendhamane, M., Martin, C., Pain, F. Multispectral imaging of the olfactory bulb activation: influence of realistic differential pathlength correction factors on the derivation of oxygenation and total hemoglobin concentration maps (Proceedings Paper). Photonics West Conference, , (2011).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

במאמר זה אנו מציגים IOS ו FAS שיטות הדמיה עבור vivo בהקלטות של ריח עורר פעילות OB העכבר. כדי להשיג מטרה זו פשוטה יחסית וזולה רחב בתחום ההתקנה הדמיה אופטית הכרחי. הרכישה של דימות נתונים דורש אימון כדי לבצע את הניתוחים בסדר להימנע מכל פגיעה הדורה או רקמת המוח. בפרט, דימום גדול יהיה לקלוט פוטונים הדמיה רשמה בסופו של דבר את הניסוי. אחד היתרונות של IOS ו FAS ההדמיה, כדי למנוע את הזריקה של קליעים נותבים ניאון, אשר עלול לגרום לרעילות הסלולר או תופעות לוואי בלתי רצויה. הן מאפשרות להתמודד עם בעיות על מפות הריח ובכך קידוד המרחבי של גירויים חושיים. בניגוד הדמיה 2-DeoxyGlucose, הם מספקים אפשרות ריחות תמונה מספר חיה אחת. עם זאת, מאז חדירת הפוטון מוגבל בתוך הרקמה, IOS ו FAS מוגבלים החלק הגבי של OBולא ניתן להקליט מאזורים הגחון. אות אנדוגני הדמיה אופטית מציעה רזולוציה מרחבית מצוינת בתחום ההדמיה vivo. שיפורים טכניים חישובים דאגה כמותית של מרכיבי הדם של החזר אותות 8,9, כמו גם הדינמיקה של חמצון הדם ונפח במהלך הפעלת חושי 10. הדמיה Multiwavelength גישות IOS הדמיה מפותחים כיום במעבדה שלנו באופן מלא לכמת ריכוז המוגלובין חמצון הכולל ב OB במהלך הפעלת החושים. אלה מדידות אופטיות ספקטרוסקופיות הוסיף FAS הדמיה ייתן את ההזדמנות כדי להשיב את היחסים פתורות בין הדינמיקה של כלי הדם ואת תאיים במהלך ההפעלה החושית 11,12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם העוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Imalgene </td><td> Merial </td><td></td></tr><tr><td> Rompun </td><td> באייר </td><td></td></tr><tr><td> Agarose, סוג III-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9793-50 </td></tr><tr><td> Hexanal 98% </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 115,606, 100 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

במוח, גירויים חושיים מפעיל מופץ אוכלוסיות של נוירונים בין מודולים תפקודית אשר להשתתף קידוד של הגירוי. פונקציונלית טכניקות הדמיה אופטית הם יתרון לדמיין את הפעלת מודולים אלה בקורטקס הסנסורי עם רזולוציה מרחבית גבוהה. בהקשר זה, אותות אופטיים אנדוגני הנובעות המנגנונים המולקולריים הקשורים neuroenergetics הם מקורות חשובים של ניגוד להקליט מפות מרחבי של הגירוי החושי על פני שדות רחבים במוח מכרסמים. כאן, אנו מציגים שתי טכניקות על בסיס השינויים של תכונות אופטיות אנדוגני של רקמת המוח במהלך ההפעלה. ראשית אותות אופטי פנימי (IOS) המיוצרים על ידי שינוי מקומי החזר אור אדום עקב: (i) קליטה על ידי שינויים ברמת החמצן בדם ואת נפח הדם (ii) פיזור פוטון. השימוש in vivo IOS להקליט מפות המרחבית החל באמצע 1980 של עם observatiעל מפות אופטי חביות זיף בחולדה ואת העמודות התמצאות החתול הראייה בקליפת 1. IOS הדמיה של פני השטח של הנורה מכרסם העיקרי חוש הריח (OB) בתגובה odorants הודגם מאוחר יותר על ידי הקבוצה של לארי כץ 2. הגישה השנייה מתבססת על אותות flavoprotein autofluorescence (FAS) בשל שינויים במצב חמזור אלה ביניים מטבולי המיטוכונדריה. ליתר דיוק, טכניקה מבוססת על הקרינה הירוק בשל מצב מחומצן של flavoproteins כאשר הרקמה הוא נרגש עם אור כחול. למרות אותות כאלה היו כנראה בין מולקולות ניאון המתועד הראשון לחקר פעילות המוח על ידי מחקרים חלוץ הסיכויים בריטון ועמיתיו 3, זה לא היה עד לאחרונה כי הם שימשו במשך מיפוי של הפעלת המוח in vivo. FAS הדמיה יושמה הראשון בקליפת החושית במכרסמים בתגובה לגירוי hindpaw על ידי קבוצה של Katsuei Shibuki 4. מערכת ההרחה היא בעלת חשיבות מרכזית לקיומה של הרוב המכריע של המינים החיים משום שהיא מאפשרת איתור זיהוי יעיל של חומרים כימיים בסביבה (מזון טורפים). OB הוא ממסר הראשון של עיבוד מידע ההרחה במוח. הוא מקבל תחזיות מביא מן הנוירונים חושי הריח העיקרי לזהות מולקולות odorant נדיפים. כל נוירון חושי מבטא רק סוג אחד של קולטן odorant ונוירונים נושאת את אותו סוג של קולטן לשלוח תהליכים העצב שלהם מוגדרים היטב microregions אותו ~ 100μm 3 היוו של neuropil דיסקרטית, glomerulus חוש הריח (איור 1). בעשור האחרון, IOS הדמיה טיפחה את החיפושים התפקודי של OB 5, 6, 7, אשר הפך לאחד המבנים חושית למד ביותר. מיפוי של פעילות OB עם FAS הדמיה לא שבוצעה עד כה. הנה, Wדואר להראות צעדים רצופים של פרוטוקול יעיל עבור IOS ו FAS הדמיה למפות ריח עורר פעילות OB העכבר.

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.

במוח, גרייה חושית מפעילה אוכלוסיות מפוזרות של נוירונים בתוך מודולים תפקודיים המשתתפים בקידוד של הגירוי. ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא למפות פעילויות המושרות על ידי ריח על פני השטח של הפקעת הרחב של עכברים, באמצעות אותות אופטיים אינטרינסיים ואותות אוטופלואורסצנציה של פלבופרוטאין או דימוי FAS, לאחר הרדמת העכבר וחשיפת הגולגולת. העצם שמעל הפקעת הרחב נדחקה. פתח בעצם נחתך באמצעות קצה של להב סכין ניש तर וסולק, ולאחר מכן נוצר תא מבטון דנטלי המקיף את פני השטח החשופים של הפקעת הרחב.ממלאים אותו ב-aros ומניחים זכוכית כיסוי מעל להכנה זו. מפות ריח נרכשות באופן רצופי באותה עכבר באמצעות אותות אופטיים פנימיים והדמיית FAS. הדמיה של פעילויות מעוררות אחרות בבצול ריח של העכבר באמצעות אותות השתקפות אופטית ואוטופלורסצנציה יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לארגון המרחבי של סדרי הריחות בבצול ריח. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיית 2-DG (דוקסי-גלוקוז) או fMRI, הוא היכולת להקליט פעילויות מעוררות של ריחות ברזולוציה מרחבית של גלומרולוס בודד.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטות אלו ייתקלו בקשיים בתחילת עבודתם, שכן רכישת המיומנויות הכירורגיות והמכשוריות היא תהליך איטי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי להפנות את תשומת הלב לשלבים המכריעים בהליכים הכירורגיים ובדיקות הדימות. צבטו את כף הרגל האחורית של העכבר כדי לוודא הרדמה, והסירו את הפרווה מהקרקפת באמצעות מכונת תספורת.נגבו שירי פשפש מהעור בעזרת רפידות גזה סטריליות הספוגות במים מזוקקים. מקמו את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית כך שהחלק הקדמי של האף יהיה במישור אחד עם החלק האחורי של הראש. כדי למקם את הבצול האופולקטורי (olfactory bulb) באופן אופקי, הדקו היטב את מוטות האוזניים והאף כדי למנוע תזוזה.יש למרוח פומד עיני לעיניים כדי למנוע התייבשות במהלך הדמיון, ולאחר מכן לחטא את אזור הקרקפת עם Betadine באמצעות מספריים סטריליים. יש לבצע חתך בחלק האחורי של הראש בין האוזניים, ואז לחתוך משני הצדדים לכיוון בסיס האוזן ובכיוון קדמי-אחורי לעבר המצח לאורך העפעפיים. השלימו את הסרת הקרקפת על ידי חיתוך העור באזור האף.השתמשו בסורג האף כמדריך. מקמו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והשתמשו במקלון צמר ספוג בסליין כדי להסיר בעדינות את הפריאוסטום (periosteum) מחלקו העליון של הגולגולת. השתמשו בפינצטה להסרת הרקמה שנותרה וגרדו את פני השטח של הגולגולת באמצעות סכין ניתוח כדי להבטיח הכנה נקייה, במטרה לשמור על אזור הבצבע הריחני (olfactory bulb) לח לאורך כל הניסוי.הניחו פיסת ספוג ג'לטין ספיג, שהרוויחו במים מזוקקים, על העצם מעל הפקעת הריחית הממוקמת בין העיניים. הסירו את ספוג הג'לטין והתחילו בגירוד עדין של העצם באמצעות להב סכין מנתחים מסוג 10. שמרו על זווית קבועה של 45 מעלות בין הלהב לעצם והזיזו את הלהב מהעפעפיים לכיוון הצד הסגיטלי של אזור הפקעת.יש להקפיד שלא להפעיל לחץ אנכי על העצם או לשרוט את העצם מעל הסינוס הורידי במהלך תהליך הדילול. יש לעצור מדי חמש דקות ולהניח ספוג ג'לטין לח על העצם כדי לקרר את הדגימה. יש להעביר את הספוג על הגולגולת כדי להסיר שיירי עצם ואבק, ולניגוב את קצה הסקלפל באופן מחזורי כדי לשמור עליו נקי וחד.המשיכו עד ששכבת העצם הספוגית או הטרבכולה (trabecula) תהיה גלויה. כאשר רשת כלי הדם העדינה של הבצל הריחני נראית לעין, הפסיקו את גירוד העצם והשתמשו בקצה של סכין מנתחים מספר 11 כדי לסמן שטח מלבני סביב הבצל הריחני. תוך שמירה על החלון בתוך גבולות הסינוסים הוורידיים, המשיכו לגרד את העצם בתוך השטח המלבני.היו זהירים במיוחד לגבי עומק קצה הסקלפל כדי להימנע ממגע עם פני השטח של הקשיה (dura). כדי להערך את עובי העצם הנותרת, דחפו אותה בעדינות באמצעות קצה של פינצטה. אם העצם נשברת תחת הלחץ, עברו לשלב הבא.הוסיפו טיפה של תמיסת מלח והשתמשו בקצה הסכין (scalpel) המכוון אופקית כדי להרים את מקורי הגומה (bone flap). הסירו בזהירות את המקורי באמצעות פינצטה כדי למנוע קריעה של העצם שנותרה. ברגע שפני הש bulb האולפקטורי (olfactory bulb) חשופים, ודאו שאין דימומים או כלי דם. אנסטומוזיס.נגב את האזור בעזרת ספוג ג'לטין ספוג במלח פיזיולוגי. על מנת לשמור על הבצל האפטירי (olfactory bulb) לח, מרח מלט דנטלי מפוליאקרילאט באמצעות מזרק בנחיר 29 כדי ליצור דופן על העצם מסביב לחלון הגולגולת. הנח טיפה של אגרוס (aros) בעל נקודת התכה נמוכה מעל הקשה (dura) והנח זכוכית כיסוי סטרילית מעל חלון הגולגולת לצורך הדמיה.הניחו את המסגרת הסטריאוטקסית תחת המיקרוסקופ הסטריאו, כאשר החלון הגולגולתי ממוקם במרכז שדה הראייה, וכוונו את הפוקוס כדי להביא את הנימים למבט. עברו לתאורה ירוקה של 580 nanometer וצלמו תמונת בקרה אנטומית כדי לבדוק את מצב ההכנה במהלך ההדמיה. לאחר מכן, המשיכו לצילום ניסיונות הגירוי באמצעות הדמיית אות אופטי אינטרינזי תחת תאורה של 630 nanometers, או הדמיית אות אוטופלואורסצנציה של פלאבופרוטאין תחת תאורה של 480 nanometers. סשן הדמיה סטנדרטי כולל קו בסיס של 5 עד 10 שניות שבהן מוגש אוויר בלבד, ולאחריו גירוי בריח למשך 3 עד 10 שניות, בהתאם לריכוז הריח שנבחר.ולבסוף, נרשמים 70 עד 82 שניות של אספקת אוויר עבור התאוששות לבסיס. כאן, מערכת כלי הדם של הפחית ריחית מצולמת דרך החלון הגולגולתי, ולאחריה תוצאות של ניסוי גירוי המשתמש ב-h sinal כחומר ריח, אשר תועדו באמצעות הדמיית iOS וגם הדמיית FAS. בשימוש בהדמיית iOS, פעילות המעוררת ריח מוצגת כאזורים כהים של בליעה; אזורים שהופעלו על ידי AL מסומנים על ידי החצים הלבנים, וניתן לראות אזורים פעילים הן בניסויים בודדים והן בממוצע של מספר ניסויים.מעבר לדימוי FAS באותו עכבר מראה כעת פעילות שעוררה OD כאזורים לבנים של פליטת אוטופלואורסצנציה המסומנים על ידי החיצים השחורים, וניתן לראותה הן בניסויים בודדים והן בממוצע של מספר ניסויים. שימו לב כי הן אזורי הבליעה השחורים שנראים באמצעות דימוי iOS והן האזורים הלבנים של פליטת אוטופלואורסצנציה שנראים באמצעות דימוי FAS חופפים. התאמה מרחבית זו מאשרת ששתי הטכניקות מאפשרות ויזואליזציה של אותם גלומרולי אולפקטוריים. ברגע שנקבע סדר הדימוי, ניתן לבצע מיפוי של פעילויות שעוררו באמצעות אותות רפלקטנציה אופטית ואוטופלואורסצנציה תוך שעה אחת לניתוח ומספר שעות לרכישת תמונות.החסרונות העיקריים בשימוש בשיטות דימות אופטיות אלו הם העובדה שלא ניתן להחיל אותן כדי להמחיש מפות ריח בעכברים הנעים באופן חופשי. ובשל החדירה המוגבלת של פוטונים לרקמות ביולוגיות, הן אינן מאפשרות גישה לגלומרולוסי הריח הוונטרליים לאחר התפתחותם בשנות התשעים המאוחרות, להקלטת אותות פנימיים במערכת הריח. אולי זוהי דרך עבור חוקרים בתחום הדימות האופטי לחקור את מאפייני הציפוי המיוחד של הריח.דימות פלואורסצנציה עצמית של פלבופרוטאין בפקעת הריח הוא טכניקה מבטיחה למתן תובנות חדשות לגבי הציפוי המיוחד של OD באמצעות אותות אופטיים אנדוגניים.

imaging-odor-evoked-activities-mouse-olfactory-bulb-using-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

מקור: Zhang, L., et al. אור אינפרא אדום קרוב (NIr) מגביר את הביטוי של סמן לתפקוד המיטוכונדריה באפיתל החושי של שיווי המשקל של העכבר. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את התהליך של הפעלת אור NIr על קרקפת עכבר מגולח כדי להפעיל נוירונים שיווי משקל ולעורר ייצור סופראוקסיד דיסמוטאז-1 (SOD-1), התומך בתפקוד עצבי. ההליך מדגיש את הטיפול ב-NIr כאסטרטגיה נוירו-פרוטקטיבית.

אפנון איתות עצבי חושי במודל עכבר באמצעות אור אינפרה-אדום קרוב

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג in vivo של נוירונים חושי ריח על ידי אלקטרופורציה ולאחר מכן סריקת לייזר קונפוקלית או מיקרוסקופ רב-פוטוני כדי להמחיש את המורפולוגיה העצבית והתפתחותה לאורך זמן.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה In vivo

אנו מציגים מבחן ריח פשוט ובלתי מוטה בעכברים. עם פרוטוקול זה ניתן להעריך אפליה, העדפה, הימנעות ורגישות לריח חדש בהשוואה למים במפגשים התנהגותיים בודדים. שיטה זו מיועדת לנסיין יחיד והניתוח מבוסס על עיבוד וידאו בעזרת מחשב.

פשוט וחוש ריח בדיקה לעכברים בסיוע מחשב

כאן אנו מתארים פרוטוקול למדידה וניתוח של תגובות טמפרטורה בפקעת הריח של Xenopus laevis. נוירונים של קולטני ריח ותאים מיטרליים מוכתמים באופן דיפרנציאלי, ולאחר מכן נרשמים שינויים בסידן, המשקפים רגישות של כמה רשתות עצביות בנורה לירידות טמפרטורה הנגרמות באף.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

חוש הריח נוירונים חושיים מבטאים מגוון רחב של מולקולות מיון האקסון להקים מעגלים עצביים נאותים. פרוטוקול זה מתאר שיטת מכתים immunohistochemical לדמיין ביטויים קומבינטוריים של מולקולות מיון האקסון ב טרמיני האקסון של נוירונים חושית חוש הריח.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

כאן, אנחנו מאמנים עכברים בפעילות associative learning כדי לבדוק את ריח אפליה. פרוטוקול זה מאפשר גם במחקרים על למידה-induced שינויים מבניים במוח.

מבחן אובייקטיבי, לשחזור של למידה חוש הריח ואפליה בעכברים

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

פרוטוקול זה חוקר את הקשר בין המוח להתנהגות בהיפוקמפוס CA1 בעכברים המנווטים בפלומת ריח. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב, כולל ניתוח לגישה להדמיה של ההיפוקמפוס, אימון התנהגותי, הקלטה ועיבוד של המוח במיניסקופ GCaMP6f, ונתונים התנהגותיים לפענוח מיקום העכבר מפעילות עצבית ROI.

מיניסקופ מקליט אותות סידן בהיפוקמפוס של עכברים המנווטים בפלומת ריח

פרוטוקול זה מתאר בניית אולפקטומטר לניסויי התנהגות חוש הריח. הוראות שלב אחר שלב, יחד עם תמונות, ניתנות על מנת להבטיח בנייה מוצלחת של האולפקטומטר. מידע לפתרון בעיות שנתקלו בהן במהלך התהליך כלול גם כן.

בניית אולפקטומטר לחקר התנהגות חוש הריח של מכרסמים

למד מיפוי פעילויות ריח בעכברים באמצעות אותות אופטיים פנימיים ופלורופרוטין אוטופלורסצנטיות. שיטות הדמיה ברזולוציה גבוהה מאפשרות חקר מנגנוני עיבוד ריח במערכת העצבים.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

גלה סרטונים נוספים